Polysome profilage en Leishmania, les cellules humaines et des testicules de souris

Résumé

L’objectif global de la technique de profilage polysome est analyse de l’activité traductionnelle de différents mRNAs ou transcriptome ARNm au cours de la synthèse des protéines. La méthode est importante pour les études de règlement de la synthèse de protéine, l’activation de la traduction et répression en santé et les maladies humaines multiples.

Résumé

Expression de la protéine appropriée au bon moment et dans les bonnes quantités est la base de la fonction des cellules normales et de survie dans un environnement en évolution rapide. Pendant longtemps, les études d’expression de gène étaient dominées par la recherche au niveau transcriptionnel. Cependant, les niveaux d’équilibre des ARNm ne concordent pas bien avec la production de protéines et la traductibilité du mRNA varie grandement selon les conditions. Chez certains organismes, comme le parasite Leishmania, l’expression de la protéine est réglementée principalement au niveau traductionnel. Des études récentes ont démontré que le dérèglement de cette protéine traduction est associé avec le cancer, métabolique, neurodégénératives et autres maladies humaines. Polysome profilage est une méthode puissante pour étudier la régulation traduction protéique. Il permet de mesurer l’État translationnelle des ARNm individuels ou examiner la traduction sur une échelle de tout le génome. La base de cette technique est la séparation des polysomes, ribosomes, leurs sous-unités et l’ARNm libre lors de la centrifugation d’un cytoplasme lysat par un gradient de saccharose. Nous présentons ici un polysome universel profilage protocole utilisé sur trois modèles différents - parasite Leishmania majeur, des cellules humaines cultivées et tissus d’origine animales. Leishmania cellules poussent librement en suspension et des cellules humaines cultivées croissent en monocouche adhérente, tandis que des testicules de souris représentent un échantillon de tissus d’origine animale. Ainsi, la technique est adaptée à l’ensemble de ces sources. Le protocole pour l’analyse des fractions polysomique permet la détection des ARNm individuels par RT-qPCR, protéines par Western blot et l’analyse des ARN ribosomiques par électrophorèse. La méthode peut être étendue par examen des mRNAs association avec le ribosome au niveau du transcriptome par profonde RNA-seq et analyse des protéines associées aux ribosomes par spectrométrie de masse des fractions. La méthode peut être facilement ajustée aux autres modèles biologiques.

Introduction

Régulation de l’expression de gène dans les cellules est contrôlée par des mécanismes transcriptionnels, post-transcriptionnel et post-traductionnelle. Les progrès dans le séquençage en profondeur RNA permettent l’étude des niveaux d’ARNm stationnaire sur une échelle de tout le génome à un niveau sans précédent. Cependant, les découvertes récentes ont révélé que d’ARNm stationnaire n’est pas toujours corrélée avec la production de protéine^1,2. Le sort d’un relevé de notes individuel est très complex et dépend de nombreux facteurs comme des stimuli internes/externes, stress, etc.. Régulation de l’expression génique au cours de la synthèse des protéines fournit une autre couche de contrôle d’expression nécessaire pour une réponse rapide dans des conditions changeantes. Polysome (ou « polyribosomique »), le profilage, la séparation et la visualisation de traduire activement des ribosomes, est une méthode puissante pour étudier la régulation de la synthèse protéique. Bien que, ses premières applications expérimentales est apparu dans les années 1960³, polysome profilage est actuellement une des techniques plus importants en protéines translation studies⁴. Seul ARNm peut se traduire par plus d’un ribosome conduisant à la formation d’un polysome. Relevés de notes peuvent être calés sur les ribosomes avec cycloheximide⁵ et ARNm contenant des nombres différents de polysomes se distingue dans le processus de fractionnement polysome de saccharose ultracentrifugation dégradé^{6,7 , 8 , 9}. l’analyse des fractions polysomique RNA puis permet de mesurer des changements dans les États translationnelles de différents mRNAs à l’échelle du génome et au cours de différentes conditions physiologiques^{4,7, 10}. la méthode a été également utilisée pour révéler les rôles de 5' UTR et 3' UTR des séquences dans le contrôle de l’ARNm traduisibilité¹¹, examiner le rôle des miARN dans la répression traductionnelle¹², découvrir des défauts dans la biogenèse des ribosomes¹³ et comprendre le rôle des protéines associées aux ribosomes avec des maladies humaines^14,15. Au cours de la dernière décennie, un rôle croissant pour la régulation de l’expression génique au cours de la traduction a émergé qui illustre son importance dans les maladies humaines. Les éléments de preuve pour le contrôle de la traduction dans le cancer, métabolique et maladies neurodégénératives est écrasante^15,16,17,18. Par exemple, le dérèglement du contrôle de la traduction eIF4E dépendant contribue à autisme associés déficits¹⁵ et FMRP participe au blocage des ribosomes sur mRNA liés à l’autisme,¹⁴. Ainsi, polysomique de profilage est un outil très important pour l’étude des défauts de régulation traductionnelle dans plusieurs maladies humaines.

Analyse des protéines des fractions polysomique dans différentes conditions physiologiques dissèque la fonction des facteurs associés aux ribosomes pendant la traduction. La technique de profilage polysome a été utilisée dans de nombreuses espèces, y compris les levures, les cellules de mammifères, plantes et protozoaires^10,19,20,21. Parasites protozoaires comme Trypanosoma et Leishmania pièce contrôle transcriptionnel limité de l’expression génique. Leurs génomes sont organisés en groupes de gènes polycistronique qui n’ont pas réglementés promoteur de transcription²². Au lieu de cela, l’expression des gènes du développement est surtout contrôlée au niveau de la traduction des protéines et à la stabilité des ARNm dans trypanosomatide espèce^23,24. Compréhension du contrôle de la traduction en l’absence de régulation de la transcription est donc particulièrement importante pour ces organismes. Polysomique de profilage est un outil puissant pour étudier la régulation post-transcriptionnelle de l’expression génique à Leishmania^25,26,27,28.

Les récents progrès dans la détection des niveaux d’ARNm individuels par le real time PCR quantitative (RT-qPCR) et pleine transcriptome par séquençage de nouvelle génération, ainsi que technologies de protéomique, apporte la résolution et les avantages du profilage polysomique à un nouveau niveau. L’utilisation de ces méthodes peut être étendue par l’analyse des différentes fractions polysomique par séquençage en RNA profondeur combiné à l’analyse protéomique pour surveiller l’État translationnelle de cellules sur une échelle de tout le génome. Cela permet l’identification de nouveaux acteurs moléculaires régissant la traduction dans différentes conditions physiologiques et pathologiques. Nous présentons ici un polysome universel profilage protocole utilisé sur trois modèles différents : le parasite Leishmania majeur, des cellules humaines cultivées et tissus d’origine animales. Nous présentons des conseils sur la préparation des lysats de cellules de différents organismes, l’optimisation des conditions du gradient, choix des inhibiteurs de la RNase et l’application de la RT-qPCR, Western blot et électrophorèse RNA pour analyser les fractions de polysome dans cette étude.

Protocole

Tous les traitements animales et la manipulation des tissus obtenus dans l’étude ont été réalisés selon les protocoles approuvés par le Comité de l’urbanisme à la Texas Tech University Health Science Center, selon le National Institutes of et d’institutionnels animalier Lignes directrices de santé bien-être animal, numéro de protocole 96005. S’il vous plaît sacrifier des animaux vertébrés et préparer les tissus selon les lignes directrices animalier institutionnel et du Comité de l’emploi. Si la faute d’un tel comité, veuillez consulter les directives de protection des animaux des National Institutes of Health. Adultes (> 60 jours ans) souris C57BL/6 ont été utilisés. Tous les animaux et les tissus ont été obtenus selon les protocoles approuvés par le Comité de l’urbanisme à la Texas Tech University Health Sciences Center selon les directives de protection des animaux des National Institutes of Health et d’institutionnels animalier. Pour l’euthanasie, une seule souris a été placée dans une petite chambre, et l’air a été déplacée graduellement avec environ 30 % du dioxyde de carbone pour anesthésier et minimiser la souffrance de l’animal. Après l’arrêt de la respiration, nous avons utilisé la dislocation cervicale pour confirmer la mort de l’animal avant la récolte de tissus.

ATTENTION : Tous les travaux avec direct Leishmania et des cellules humaines cultivées a été fait en biosécurité armoire BSL-2 laboratoire certifié.

1. préparation des lysats cytoplasmiques de Leishmania grandes , des cellules humaines cultivées et les tissus de souris

Remarque : Il y a plusieurs différences dans les préparations de lysats avec les matériaux de source différente. Autres mesures, y compris la préparation de gradients de sucrose et de fractionnement polysomique sont identiques et ne dépendent pas de la source de l’échantillon.

1. Préparation de lysat cytoplasmique Leishmania majeur
   1. Ensemencer les cellules Leishmania majeur (souche FV1) dans 30 mL de 1 x M199 moyen²⁹ contenant 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) et pénicilline/streptomycine de mélange (100 unités et 100 μg/mL proportionnellement)à une densité de 1 x 10⁵ cellules/mL .
      Remarque : Toutes les étapes impliquant des cellules de Leishmania majeur doivent être effectués dans une armoire de sécurité biologique.
   2. Placer les cellules dans un incubateur et cultivez-les à 27 ° C jusqu'à ce que la phase logarithmique (mi journal correspond à 5 x 10⁶ cellules/mL). Il prend habituellement environ deux jours à se développer.
   3. Ajouter cycloheximide à la culture de Leishmania majeur à une concentration finale de 100 μg/mL d’arrêter les ribosomes sur traduction ARNm. Replacez les cellules dans l’incubateur pendant 10 min à 27 ° C.
   4. Fin du traitement de cycloheximide, transférer des cellules dans un tube conique de 50 mL et eux tournent à 1 800 x g et 4 ° C pendant 8 min. jetez surnageant.
   5. Laver les cellules avec 30 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (SPD). Centrifuger à 1 800 x g et 4 ° C pendant 8 min.
   6. Jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de SPD.
   7. Prélever une partie aliquote de cellules et mélangez-le avec la solution de formaldéhyde de 3,5 %.
   8. Compter les cellules par hémocytomètre et déterminer leur concentration. Transvaser le nombre désiré de cellules dans le tube à centrifuger. Lysate préparé à partir de 0.5x10⁸-2 x 10⁸ cellules/mL est suffisante pour le chargement de gradient d’un saccharose.
   9. Faire tourner les cellules à 1 800 x g et 4 ° C pendant 8 min. éliminer le surnageant.
   10. Resuspendre le culot cellulaire sur glace dans 1 mL de tampon de lyse contenant des inhibiteurs de la protéase et inhibiteur de RNase (20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 2 mM TNT, 1 % NP-40, 1 x inhibiteur de protéase cocktail (exempt d’EDTA), inhibiteur de RNase 200 unités/mL).
   11. Passer le lysat par une aiguille de calibre 23 trois fois. Le lysat doit devenir transparent après passage de l’aiguille.
   12. Centrifugeuse à 11 200 x g et 4 ° C pendant 10 min afin de clarifier le lysat. Transférer le clarifié lysat pour un nouveau tube et le garder sur la glace jusqu’au saccharose gradient ultracentrifugation.
   13. Frais virés 400-500 μL du lysat en entrée (pour analyser plus tard), congelez-la immédiatement dans l’azote liquide pour analyse des protéines futures ou ajouter réactif de purification d’ARN avant de les congeler pour l’analyse de la RNA.
2. Préparation lysate cytoplasmique des cellules humaines cultivées de HeLa
   1. Fractionner les cellules HeLa et leur semence dans 20 mL de milieu DMEM contenant 10 % FBS et pénicilline/streptomycine mélange (100 unités et 100 μg/mL proportionnellement) avec cellule compter 2 x 10⁵ cellules/mL dans une plaque de 15 cm.
   2. La croissance de cellules HeLa à 37 ° C, 5 % de CO₂ pour la transfection d’ADN de plasmide 20 à 24 h. effectuer conformément aux protocoles du fabricant.
   3. Propagez les cellules pendant 24 h après la transfection à 37 ° C, 5 % de CO₂.
   4. Le cycloheximide s’ajoute les cellules HeLa cultivées à la concentration finale de 100 μg/mL d’arrêter les ribosomes sur mRNA traduits et incuber les cellules pendant 10 min à 37 ° C, 5 % de CO₂. Aspirez le milieu. Laver les cellules deux fois avec SPD froid sur la glace.
   5. Ajouter 500 μl de tampon de lyse (20 mM HEPES-KOH pH 7,4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,5 % NP-40, 1 x inhibiteur de protéase cocktail (EDTA-libre), 200 unités/mL d’héparine de RNase inhibiteur ou 1 mg/mL) à la plaque et raclez les cellules sur la glace.
   6. Transférer les cellules lysées vers le tube à centrifuger. Ajuster la concentration de NP-40 à 0,5 % et MgCl₂ à 5 mM selon l’augmentation du volume de l’échantillon.
   7. Passer le lysat par une aiguille de calibre 23 3 à 6 fois.
   8. Tourner à 11 200 x g et 4 ° C pendant 8 min à clarifier lysat. Après centrifugation, transférer le surnageant dans un nouveau tube. Utilisez un spectrophotomètre pour évaluer l’efficacité de la lyse des cellules et pour déterminer la quantité d’échantillon pour le chargement sur le gradient. Ajouter 10 μL d’échantillon à 0,5 mL de 0,1 % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). Vide contre SDS 0,1 %. Mesurer l’absorbance à 260 nm. Valeur d’absorbance attendu est d’environ 15-20 unités/mL.
   9. Diluer les échantillons avec tampon de lyse de la même valeur d’absorbance avant la centrifugation en gradient de saccharose. Conservez les échantillons sur la glace jusqu'à la centrifugation en gradient de saccharose.
3. Cytoplasmique préparation lysate de testicule de souris
   1. Disséquer les testicules de souris. Faites une petite incision à l’albuginée et recueillir les tubules séminifères des testicules et de les transférer dans un tube conique 15 mL contenant 5 mL de SPD additionné le fluorure phénylméthylsulfonyle (PMSF) de 0,1 mM.
   2. Mélanger vigoureusement le tissu en retournant plusieurs fois. Laisser le tissu pour s’établir à la gravité de l’appareil sur la glace pendant 5 min.
   3. Retirer et jeter le trouble tampon contenant les cellules conjonctives et fragments tissulaires. Répétez l’opération 2 à 3 fois plus. Le granule blanc restant s’enrichit des tubules séminifères et des cellules germinales.
   4. Transférer le culot tubules séminifères dans un tube de microcentrifuge de 2 mL et essorage à 500 g pendant 1 min. éliminer le surnageant.
   5. Ajouter 500 µL de tampon de lyse (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM de KCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,5 % NP-40, 1 x inhibiteur de protéase cocktail (exempt d’EDTA), héparine de 1 mg/mL ou 200 unités/mL d’inhibiteur de RNase) pour les tubules. Utiliser une pipette pour triturer les tissus.
   6. Transférer la suspension dans un petit (0,5 à 1,0 mL) Dounce homogénéisateur. Perturber le tissu avec sept ou huit coups du pilon de verre.
   7. Transférer le lysat dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
   8. Centrifuger l’échantillon à 12 000 x g et 4 ° C pendant 8 min effacer le lysate. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et le magasin sur la glace jusqu’au chargement le long du gradient de saccharose.
   9. Collecter 50 μL du lysat comme échantillon d’entrée, tout de suite le congeler à-80 ° C pour l’analyse de la protéine future ; ou ajouter le réactif de purification d’ARN avant de les congeler pour l’analyse des RNA.

2. ultracentrifugation et préparation gradients de sucrose

1. Préparer deux gradients solutions de saccharose (20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, KCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM TNT, 1 inhibiteur de protéase x cocktail 100 mM), contenant 10 % de saccharose ou sucrose à 50 %. (Tris-HCl, pH 7,4, peut servir au lieu de HEPES). Ajouter 200 unités/mL héparine inhibiteur ou 1 mg/mL de RNase selon le protocole expérimental. Placer un tube d’ultracentrifugeuse pour rotor SW 41 dans le bloc marqueur et tracer la ligne le long de l’étage supérieur du bloc. Transférer le tube dans un support stable.
2. Prenez une seringue de 10 mL avec l’appareil de superposition fixée et remplir la seringue avec la solution de 10 % de saccharose (préparée comme indiqué ci-dessus). Doucement Libérez-le en bas du tube ultracentrifugeuse jusqu'à ce qu’il atteigne le repère sur le tube.
3. Remplir une autre seringue avec solution de sucrose à 50 % et introduire son dispositif de superposition à travers la couche de saccharose de 10 % jusqu’au fond du tube. Relâchez doucement la solution de saccharose à partir du bas jusqu'à atteindre le repère sur le tube. Fermer le tube avec le capot de protection fourni.
4. Pour préparer le gradient de saccharose, éteignez l’appareil de gradient maker ON. Niveau de la plaque à l’aide de la vers le haut ou vers le bas les touches et appuyez sur DONE. Mise à niveau est important pour la linéarité du dégradé.
5. Après la mise à niveau la presse plaque GRAD pour ouvrir le menu dégradé. Aller à la liste dans le menu dégradé et sélectionnez le rotor SW 41 Ti. Puis choisissez le gradient de saccharose désiré dans la liste du menu à l’aide des boutons haut et bas . Appuyez sur utilisation.
6. Placez le porte-tube dégradé sur la plaque de gradient maker. Transférer le tube dans le support. Jusqu'à 6 dégradés peuvent être préparés en même temps. Appuyez sur exécuter. Le gradient maker fait pivoter les tubes à la vitesse programmée et les angles formant un dégradé linéaire. Il faudra que quelques minutes pour préparer le gradient.
7. Lorsque le processus est terminé, placer les tubes dans un rack. Enlever les bouchons. Retirer le même volume que le volume de l’échantillon sur le dessus des tubes ultracentrifugeuse.
8. Soigneusement charger 400-500 μL de lysat contenant 15-20₂₆₀ unités de polysomes sur le dessus. Placer les tubes dans les seaux de rotor et leur équilibre.
9. Centrifugeuse à 260 000 x g et 4 ° C pendant 2 h à l’aide de rotor SW 41.

3. polysome fractionnement et prélèvement d’échantillons

NOTE : Tandis que les préparations lysats présentent quelques différences selon les sources, gradient préparation et polysome fractionnement protocoles sont les mêmes pour tous les types de lysats.

1. A l’issue de l’ultracentrifugation, placer les seaux du rotor avec les tubes sur la glace. Tourner le collecteur de fraction et gradient fractionnateur ON. Cliquez sur Rechercher dans le menu de fractionnement. Mettre un rack avec 24 tubes de prélèvement dans le collecteur de fraction.
2. Remplir un réservoir de rinçage sur le côté le fractionnement à l’eau désionisée. Appuyez sur la touche RINSE pendant 10 s pour rincer la pompe sur le fractionnement. Fixer un adaptateur de rinçage avec la seringue remplie d’eau au piston pour l’étalonnage.
3. Ouvrez le logiciel de fractionnement sur l’ordinateur. Appuyez sur calibrer. Utilisez les paramètres par défaut et appuyez sur OK. Être prêt à injecter de l’eau de la seringue.
4. Appuyez sur OK pour faire le calibrage. Immédiatement commencer à injecter de l’eau pour le prochain 5 s. Pendant ce temps, l’eau s’écoule à travers la cellule de flux détecteur UV et l’instrument sera calibré. Le symbole Zéro étalonnage terminé s’affiche. L’instrument est prêt pour le fractionnement.
5. Retirez l’adaptateur de rinçage avec la seringue. Fixer un embout sur le piston de la fractionnateur.
6. Ouvrez la clé en laiton d’air valve et presse AIR pour 10 s à tuyauterie sèche et cellule d’écoulement. Fermez la valve d’air.
7. Doucement, retirer le tube dégradé le seau de rotor et placez-le dans le panier. Appliquer le capuchon du tube vers le haut du tube et soigneusement déplacer le tube dans le porte-tube et bloquer en position.
8. Placez le support sous le piston de la fractionnateur. Souvent, polysomique bandes peuvent être vu par les yeux. Introduire les paramètres souhaités pour les numéros de fraction et de volume (24 fractions à 500 μL/fraction sont généralement suffisantes). Nommez le fichier de façon appropriée. Appuyez sur OK, puis sur le bouton Aller à graphique . Dans la fenêtre suivante, appuyez sur Démarrer l’analyse. Les paramètres seront affiche, appuyez sur OK. Le collecteur se déplacera de la gouttière à la première fraction et le piston se déplace dans le tube. Lorsque le piston atteint le sommet de la pente, il va ralentir à la vitesse sélectionnée et les fractions seront recueillies. Une fois terminé, le piston se déplace hors du tube de gradient.
9. Ouvrez la clé en laiton d’air valve et presse AIR sur le fractionnement pour récupérer la dernière fraction.
10. Déplacer les tubes de la crémaillère sur la glace.
11. Ajouter 2 volumes de réactif de purification d’ARN à chaque fraction et flash congélation dans l’azote liquide jusqu'à purification RNA. Sinon, si la protéine doit être analysée, ajouter l’acide trichloroacétique à la concentration finale de 10 % pour les concentrer pour Western blotting (voir Section 8).

4. préparation d’ARN synthétique In Vitro pour la normalisation des ARNm niveaux pendant l’analyse de données de RT-qPCR

Remarque : L’ARNm OmpA d’e. coli est utilisée dans le présent protocole pour la normalisation. N’importe quel autre ARN qui n’a pas d’identité vaste avec l’ARNm de l’organisme étudié (mammifères ou Leishmania) peut être utilisé.

1. Préparer le fragment d’ADN OmpA contenant la séquence du promoteur SP6 par une réaction de PCR standard d’un plasmide contenant le gène de OmpA³⁰.
2. Préparer 100 µL du mélange : 80 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 16 mM MgCl₂, 2 mM Spermidine, 10 mM DTT, ATP, 3 mM CTP, 3 mM 3 mM UTP, 3 mM GTP, inhibiteur de RNase U/μl 0,5, 1 μg de OmpA PCR ADN, 3 μL SP6 ARN polymérase , 0,005 pyrophosphatase U/μl.
3. Incuber à 40 ° C pendant 2 h.
4. Purifier les RNA par un kit de purification d’ARN.
5. Mesurer la concentration de spectrophotomètre et examiner par électrophorèse sur gel d’agarose.

5. isolement de Fractions dégradé et préparation de cDNA

Remarque : Passez directement avec ce protocole pour la purification de RNA si un inhibiteur de RNase a été utilisé comme un inhibiteur de la ribonucléase. Toutefois, lorsqu’il est utilisé comme un inhibiteur de la ribonucléase, héparine nuira à la transcriptase inverse, utilisée dans la préparation de l’ADNc. Par conséquent, purification supplémentaire de l’ARN est nécessaires si l’héparine a été utilisé dans le tampon de lyse et dégradé. Voir la Section 6 pour préparer l’ARN si l’héparine a été utilisé pour la synthèse de cDNA.

1. Décongeler les échantillons contenant le réactif de purification d’ARN, ajouter 20 ng d’ARN synthétique comme contrôle interne pour la normalisation des résultats de la RT-qPCR. Procéder à la préparation d’ARN selon le protocole du fabricant sauf une modification. Ajouter 1 µL de précipitation d’isopropanol préalable ARN grade glycogène (20 µg). Dissoudre les granules de RNA dans 20 à 25 µL d’eau exempte de RNase.
   NOTE : Glycogène sert comme support et aide à éviter les pertes et visualiser des granulés de RNA pendant la purification. OmpA ARNm est utilisé pour plus de normalisation dans les réactions de la RT-qPCR.
2. Mesurer la concentration d’ARN à l’aide du spectrophotomètre pour assurer le rendement adéquat. Mélanger des quantités égales de fractions de RNA contenant 40 s, 60 s et monosomes comme prepolysomes. Fractions contenant des ribosomes 2-4 combinent comme lumière polysomes et fractions de 5-8 ribosomes combinent comme lourds polysomes.
3. 5 à 10 µL d’ARN de fractions combinées permet de préparer des ADNc à l’aide d’un kit et suite aux recommandations du fabricant.
4. Ajouter 80 µL d’eau libre nucléase à 20 µL de cDNA. Congeler les échantillons de cDNA à-20 ° C.

6. RNA Purification de la Contamination de l’héparine

Remarque : L’héparine inhibe enzymes telles que la transcriptase inverse de la transformation des acides nucléiques. Par conséquent, utiliser ce protocole de purification supplémentaire lorsque l’héparine est utilisée dans le tampon de lyse et/ou dans le gradient.

1. Ajouter LiCl à une concentration finale de 1 M pour les échantillons d’ARN purifiés.
2. Mélanger les échantillons et incuber sur la glace pendant 1 h.
3. Faites tourner les échantillons à 16 000 x g et 4 ° C pendant 15 minutes.
4. Retirez le surnageant aussi complet que possible à l’aide d’une pipette.
5. Sécher les boulettes pendant environ 5 min.
6. Remettre en suspension les boulettes dans le volume initial d’eau exempte de RNase.
7. Effectuer une mesure spectrophotométrique à 260 nm pour déterminer la concentration de l’ARN. Habituellement, la perte de l’échantillon est minime.

7. RT-qPCR et analyse de données de Distribution de l’ARNm

1. Mélanger 10,2 μL d’eau, 20 μL de SYBR Green, 4.8 μL d’amorces spécifiques de gènes (ensemble de 2,5 μM de chaque), 5 μL d’ADNc, bien mélanger et charger 10 μL / puits dans réanalysés dans plaque 384 puits.
2. Couvrez le plat avec film adhésif et centrifuger la plaque à 1 800 g pendant 5 min.
3. À l’aide d’un appareil de PCR en temps réel mis en place qPCR réaction selon les modalités indiquées dans le tableau 1.
4. En utilisant le cycle seuil (C_T) les valeurs et la méthode comparative de la C_T (ΔΔC_T)³¹ calculent le pourcentage (%) de répartition des ARNm dans prepolysomes, la lumière et les polysomes lourds comme décrit³² avec une modification. Utiliser l’ARN synthétique (OmpA ici) pour la normalisation des données en analyse de données RT-qPCR. L’ARN synthétique fournit un contrôle de normalisation qui permet de calculer les niveaux de mRNA relative et de les comparer dans les différentes fractions d’un dégradé.

8. l’analyse des protéines dans les Fractions polysomique Western Blot

1. Provenant d’un stock de 100 % (p/v), ajouter l’acide trichloracétique (TCA) pour les fractions sélectionnées (500 μL) à une concentration finale de 10 %, rester sur la glace pendant au moins 15 min, centrifuger dans une microcentrifugeuse pendant 5 min, jeter le surnageant, laver deux fois avec de l’acétone glacée et dissoudre dans 25 μL de S DS-PAGE chargement tampon d’électrophorèse.
2. Chargez sur le SDS-PAGE et mener l’électrophorèse standard avec transfert suivant à la membrane PVDF. Passez à la Western blotting³³.

Résultats

Dans cette étude, nous décrivons l’application de la technique de profilage polysomique à trois sources différentes : parasite Leishmania majeurdes cellules humaines cultivées et des testicules de souris. Leishmania cellules poussent librement dans les milieux liquides en suspension, des cellules humaines cultivées se développent dans la monocouche adhérente sur les plaques et les testicules de souris représentent un échantillon de tissu. La méthode peut être facilement ...

Discussion

Fractionnement de polysome par gradient de saccharose combinés avec de l’ARN et analyse des protéines des fractions est une méthode puissante pour analyser translationnelle statut des différents mRNAs ou le translatome entier ainsi que des rôles de facteurs protéiques régulant translationnelle machines au cours de l’état normal, physiologique ou une maladie. Polysomique de profilage est une technique particulièrement adaptée pour étudier la régulation traductionnelle organismes tels que les trypanosomatidés y compris

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Instruments :
Gradient master	Biocomp Instruments Inc.	Fractionneur
	Biocomp Instruments Inc.	152
Collectionneur de fractions	Gilson, Inc.	FC203B
NanoDrop One	Thermo Scientific	NanoDrop One
Microscope inversé	Nikon	ECLIPSE Ts2-FL/Ts2
2720 Thermocycleur	Applied Biosystems by Life Technologies	4359659
Incubateur CO2	Panasonic Healthcare Co.	MCO-170A1CUV
Incubateur HERATHERM	Thermo Scientific	51028063
Enceinte de Sécurité Biologique, classe II, type A2	NuAire Inc.	NU-543-400
Congélateur Revco	Technologies	ULT1386-5-D35
Beckman L8-M Ultracentifuge	Beckman Coulter	L8M-70
Centrifugeuse	Eppendorf	5810R
Centrifugeuse	Eppendorf	5424
Rotor d’ultracentrifugeuse SW41	Beckman Coulter	331362
Rotor à godets oscillants	Eppendorf	A-4-62
Rotor à angle fixe	Eppendorf	F-45-30-11
Quant Studio 12K Flex Machine PCR en temps réel 285880228	Applied Biosystems by life technologies	4470661
TC20 Compteur de cellules automatisé	Bio-Rad	145-0102
Hémacytomètre	Hausser Scientific	02-671-51B
fort  ;
Triax software  ;	Biocomp Instruments Inc.
Matériaux :
Lames de comptage, double chambre pour compteur de cellules	Bio-Rad	145-0011
Tube de microcentrifugation de 1,5 mL	USA Scientific	1615-5500
Tubes à centrifuger polyclear ouverts, (14 mm x 89 mm)	Seringue Seton Scientific	7030
, 5 mL	BD
Seringue BD 3 mL23 Calibre 1 pouce Aiguille	BD	10020439
Nunclon Delta Surface, 14 cm	Thermo Scientific	168381
Nunclon Delta Surface, 9 cm	Thermo Scientific	172931
Nalgene unité de filtration à débit rapide 90 mm, 500 mL, 0,2 aPES	Thermo Scientific	569-0020
BioLite 75 cm3	Thermo Scientific	130193
Nunc 50 mL tubes à centrifuger coniques	Thermo Scientific	339653
Chemicals :
Trizol LS	Ambion by Life Technologies	10296028
	HEPES Fisher Scientific	BP310-500
Trizma base	Sigma	T1378-5KG
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-high glucose (DMEM)	Sigma	D6429-500ML
Sérum fœtal bovin (FBS)	Sigma	F0926-50ML
Pénicilline-Streptomycine (P/S)	Sigma	P0781-100ML
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco’s ( DPBS)	Sigma	D8537-500ML
Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl2x6H2O)	Acros Organics	AC413415000
Chlorure de potassium (KCl)	Sigma	P9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40)	Fluka (Sigma-Aldrich)	74385
Rnasine recombinante Inhibiteur de la ribonucléase	Promega	N2511
Héparine sel de sodium	Sigma	H3993-1MU
cOmplete Mini inhibiteurs de protéase sans EDTA	Roche Diagnostics	11836170001
Glycogen	Thermo Scientific	R0551
Water	Sigma	W4502-1L
Cycloheximide	Sigma	C7698-1G
Chloroform	Fisher Scientific	194002
Dithiotreitol (DTT)	Fisher Scientific	BP172-5
Bromure d’éthidium	Fisher Scientific	BP-1302-10
Acide éthylènediaminetétraacétique disodique déshydraté (EDTA)	Fisher	Scientific S316-212
Optimem	Life Technologies	22600050
dichlorhydrate de puromycine	Sigma	P8833-100MG
Saccharose	Fisher Scientific	S5-3KG
Solution trypsine-EDTA	Sigma	T4049-100ML
Capacité Hgh Kit d’ADNc Transcriptase inverse	Biosystèmes appliqués par technologies du vivant	4368814
Power SYBR Green PCR Master Mix	Biosystèmes appliqués par technologies du vivant	4367659
HCl	Fisher Scientific	A144SI-212
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26324
Hydroxyde de potassium (KOH)	Sigma	221473-500G
Anticorps anti-RPL11	Abcam	ab79352
Protéine ribosomique S6 (C-8) Anticorps	Santa Cruz Biotechnology Inc.	sc-74459
1xM199	Sigma	M0393-10X1L
Cloure de lithium	Sigma	L-9650
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Fisher Scientific	D128-500
Gel Loading Buffer II	Thermo Scientific	AM8546G
Agarose UltraPure	Thermo Scientific	16500-100
Acide trichloracétique (TCA)	Fisher Scientific	A322-100
Substrat chimiluminescent SuperSignal West Pico PLUS Thermo	Scientific	34580
Formaldéhyde	Fisher Scientific	BP531-500
Dodécylsulfate de sodium (SDS)	Sigma	L5750-1KG
Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)	Sigma	P7626-5G
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104
Adénosine 5&prime ;-triphosphate hydraté de sel disodique (ATP)	Sigma	A1852-1VL
Cytosine 5'-triphosphate hydraté de sel disodique (CTP)	Sigma	C1506-250MG
Uridine 5'-triphosphate hydrate de sel trisodique (UTP)	Sigma	U6625-100MG
Guanosine 5'-triphosphate sodium hydrate (GTP)	Sigma	G8877-250MG
SP6 ARN polymérase	NEB	M0207S
Pyrophoshatase	Sigma	I1643-500UN
Spermidine	Sigma	S0266-1G