Gène candidat essais dans des études de cohortes cliniques avec génotypage multiplexé et spectrométrie de masse

Résumé

Identification des variantes génétiques qui contribuent à la maladie humaine complexe permet de repérer les nouveaux mécanismes. Ici, nous démontrons une approche de génotypage multiplex de gènes candidats ou analyse de voie de gène qui maximise la protection à faible coût et peut faire l’objet d’études de cohorte.

Résumé

Maladies complexes reposent souvent sur plusieurs variants génétiques communs qui contribuent à la susceptibilité à la maladie. Nous décrivons ici une approche de polymorphisme (SNP) de nucléotide simple tag rentable en utilisant un test de génotypage multiplexée avec la spectrométrie de masse, à étudier les associations de voie de gène dans les cohortes de la cliniques. A titre d’exemple, nous étudions le locus de candidat d’allergie alimentaire Interleukin13 (IL13). Cette méthode optimise efficacement la couverture en profitant de déséquilibre de liaison partagée (LD) au sein d’une région. SNP sélectionnés de LD puis visent dans un essai multiplexé, permettant jusqu'à 40 différents SNP à analyser en même temps, augmenter la rentabilité. Réaction en chaîne par polymérase (PCR) est utilisée pour amplifier les loci de cible, suivis de nucléotide simple extension, et les amplicons sont alors mesurés à l’aide de laser assistée par matrice désorption/ionisation-temps flight(MALDI-TOF) de spectrométrie de masse. La sortie brute est analysée avec le génotype composant logiciel, en utilisant le contrôle de la qualité rigoureuses définitions et seuils, et les génotypes de forte probabilité sont déterminés et d’analyse des données de sortie.

Introduction

Dans la maladie humaine complexe, variants génétiques contribuent à la susceptibilité à la maladie et quantifier ces variantes peut-être être utile pour la pathogénie de compréhension, identifier les groupes patients à risque élevé et les intervenants de traitement. En effet, la promesse de la médecine de précision est dépendante de l’utilisation de l’information génomique pour identifier des sous-groupes de patients¹. Malheureusement, en l’espace de biologie des maladies complexes, où les phénotypes de la maladie sont sous-tendus par une hétérogénéité génétique importante, faible pénétrance et expressivité variable, cohorte taille les besoins pour les approches de Génome-large d’identifier roman les candidats sont souvent excessivement large². Par ailleurs, une approche de gène candidat ciblé commence par une hypothèse a priori sur les gènes spécifiques et des sentiers dans l' étiologie de la maladie³. Outils d’analyse de parcours sont utilisées pour étudier la physiopathologie d’un locus de cibles identifiés, générant de nombreuses voies de candidat d’être explorées. Nous montrons ici une approche de génotypage multiplex permettant l’étude des dizaines ou des centaines de SNP avec un dosage, adaptés aux études de cohorte humaine⁴. Cette approche est relativement élevée à travers-mis, permettant à des centaines de milliers d’échantillons d’ADN d’être génotypés pour les études de la découverte et l’étude des voies spécifiques. Les méthodes décrites ici sont utiles pour identifier des allèles de risque et de leurs associations à caractères cliniques de façon relativement rapide et peu coûteuse. Cette plate-forme a été très avantageuse pour le dépistage et de diagnostic des fins^5,6et plus récemment, pour les infections microbiennes⁷ et papillomavirus humain⁸.

Ce protocole commence par la sélection d’un ensemble de gènes pour enquête, i.e., les régions cibles, généralement déterminées par le biais de recherches documentaires ou des hypothèses a priori pour implication dans le processus de la maladie ; ou peut-être sélectionné pour la réplication, comme les principales associations d’une étude Génome-large association (GWA) de découverte. De l’ensemble de gènes, le chercheur choisira une liste raffinée du SNP. Autrement dit, le déséquilibre de liaison (LD), ou la corrélation, parmi les variantes dans la région sert à identifier un représentant « tag SNP » pour un groupe de SNP dans haute LD, connu comme un haplotype. Le LD haut de la région signifie que les SNP sont souvent hérités ensemble tel que génotypage un SNP est suffisant pour représenter la variation à tous les SNP dans l’haplotype. Alternativement, si suite à une liste définitive de SNP dans de nombreuses régions, par exemple., la réplication pour une étude GWA, ce processus peut être inutile. Pour le génotypage multiplexé, un test doit être conçu autour de ces cibles telles que les amorces d’amplification sont des différant en masse à ceux des amorces extension et spectres de masse de produits pour produire interprétable. Ces paramètres sont facilement mises en œuvre par un outil de conception de test de génotypage multiplexé. Les amorces et inverses de l’illustration servira à cibler les marqueurs d’intérêt et d’amplifier la séquence contenant le SNP. Les amorces extension attachent directement proximal des SNP et une base unique, masse modifié, « terminator » qui complète le SNP est ajoutée. La base de terminator empêche plus extension de l’ADN. La masse-modification de la base permet aux fragments qui diffère par une base unique pour être détectée par spectrométrie de masse. La plaque contenant la chimie de génotypage est ensuite appliquée à une puce pour la mesure sur une plate-forme de spectrométrie de masse. Après l’application des contrôles de qualité appropriés aux appels génotypage cru détectés par le système, les données peuvent être exportées et utilisées pour l’analyse statistique pour tester la liaison avec les phénotypes de la maladie.

Protocole

Le matériel génétique utilisé dans les présentes était éthiquement approuvé par le Bureau pour enfants HREC (Human Research Ethics Committee) (CDF/07/492), le département de HREC de Services humains (10/07) et Hospital (RCH l’enfance Royal) HREC (27047).

1. la conception du test multiplexé

1. Préparer une liste SNP pour la conception de l’essai.
   1. La région cible l’entrée dans la fonction de tagger des Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Utilisez le LD (corrélation, r²) entre le SNP s’étendant sur la région cible pour générer une liste de SNP, qui fournit une couverture complète de la région souhaitée avec le plus petit nombre de variantes nécessaires. Générer une liste de SNP tels que tous les allèles à saisir sont corrélés au-dessus d’un seuil défini par l’utilisateur (p. ex.., r² 0,8).
2. Identification des séquences appropriées pour marche avant, marche arrière et extension des amorces
   1. Entrez la liste générée de SNP dans l’outil de conception de test de choix.
      Remarque : Les instructions suivantes s’appliquent à l’outil de conception de test utilisé pour générer les résultats représentatifs, comme spécifié dans la Table des matières.
   2. Une fois que l’outil de conception de test a été lancé, sélectionnez le Nouveau Design de génotypage. Entrez un nom pour la conception de test dans le champ Nom de la conception .
   3. Fournir la liste SNP générée à l’étape 1.1.1 en cliquant sur le bouton Modifier la saisie de texte avec les instructions rs ou FASTA à gauche du bouton.
      Remarque : SNP peut être dans une liste de texte de référence (SR) SNP IDs ou téléchargées au format FASTA, ou le format de fichier de groupe de SNP utilisée par l’outil. Pour télécharger des fichiers dans ces formats, cliquez sur le bouton de Téléchargement de fichiers . La limite supérieure de variantes qui peuvent être conçus dans un seul essai, appelé « bien », est 40 SNP. Il est possible de spécifier les SNP qui constituent une priorité pour la conception avant de commencer la course ; ce seront tout d’abord conçus. SNP de contrôle peut être spécifiées : par exemple, un test pour détecter des sexes dans le cas d’échantillon mix ups ou un contrôle pour déterminer ce modèle suffisant a été ajouté si vous travaillez avec faible ou de mauvaise qualité de l’ADN. Toutefois, il convient de noter qu’à l’aide de SNP contrôle et priorité peut réduire le nombre de SNP qui peuvent être conçus dans un seul bien.
   4. Dans le menu prédéfini , sélectionnez l’option de multiplexage haute iPLEX Preset . Dans le menu de l’organisme , sélectionnez l’organisme dont dérive l’ADN d’être génotypés. Pour les résultats représentatifs présentés ici, c’était l’homme.
      Remarque : La souris et organismes bovines sont également compatibles avec l’outil. On peut choisir aussi autres si vous travaillez avec un autre organisme comme plante ou microbe ; Toutefois, les étapes automatisées pour trouver SNP proximale et zones amorce optimale ne sera pas disponibles en raison de l’absence d’un génome de référence.
   5. Dans le menu base de données , sélectionnez la dernière version du génome, ou une version alternative si nécessaire, dans le menu de la chimie . Choisissez iPLEX introduction par effraction pour le champ Niveau de Multiplex , le plus haut niveau du multiplexage : 40. Maintenant, sélectionnez Commencer à courir. « Étape 1 » de l’outil commencera.
      Remarque : Au cours de l’étape 1, l’outil récupère et met en forme les séquences SNP. Ici, les erreurs peuvent inclure mise en forme du fichier FASTA auquel cas le fichier FASTA devrait être vérifié et reformaté en tant que de besoin. Une autre erreur est SNP rs numéros qui ont été fusionnés avec un autre numéro de rs, dans lequel cas le nombre de rs doivent être recherchés dans une base de données SNP comme dbSNP de la NCBI pour identifier le nouveau numéro de rs SNP. Séquences autour du SNP sont recherchées pour n’importe quel SNP proximale connue pouvant interférer avec la conception d’amorce. Des sites potentiels d’amorces PCR sont comparés avec le génome pour éviter l’amplification non spécifique en raison de multiples coups dans le génome.
   6. Attendent l’achèvement de « Step 2 » de l’outil de conception dans lequel proximale SNP est identifiés.
      Remarque : Si vous utilisez un organisme qui n’est pas pris en charge par cette étape, annoter les séquences avec SNP proximale dans l’annotation de l’UICPA si cette information est disponible. Il y a rarement des erreurs au cours de cette étape ; Cependant, des erreurs peuvent survenir si l’organisme de référence erronée ou du génome a été sélectionné ou si les séquences d’ADNc ont été entrées plutôt que de l’ADN génomique. Pour optimiser l’étape 2, sous Paramètres avancés, il est possible de filtrer les SNP basée sur une population si vous travaillez au sein d’une population spécifique. SNP rare peut également être filtré en excluant ceux qui ont une fréquence inférieure à 1 %. Enfin, SNP qui n’ont pas un statut validé ou n’ont pas d’information de la population peut également être exclus si vous le souhaitez.
   7. Attendent l’achèvement des régions « Étape 3 » de l’outil de conception qui identifie l’apprêt optimal. Si vous préférez l’apprêt emplacements ont été identifiés, ou si vous travaillez avec un organisme différent, entrer manuellement les emplacements de l’apprêt en annotant la séquence d’entrée (les fichiers de groupe SNP) avec les régions des amorces privilégiées en majuscules et le reste de la séquence en bas cas, certains Cas de préserver dans le menu paramètres avancés pour cette étape.
      Note : Les erreurs pour les étapes 2 et 3 peuvent inclure : (1) A proximal SNP la conception d’une amorce de blocage avec la solution étant de masquer avec une base sans modèle et commander un oligo avec une base universelle comme Isonine ou, pour concevoir deux amorces, une avec chacun des allèles de la proxim SNP al, ou, une amorce de conception avec l’allèle commun seulement. (2) une autre erreur commune est l’incapacité d’identifier un site unique pour l’amorce avec la solution étant de modifier la longueur de l’amplicon afin d’identifier un site unique. Dans l’outil utilisé pour cet article, la valeur par défaut est 80-120 bp. Ceci peut être modifié de bp 60-400 dans le dialogue des paramètres avancés sous les paramètres de longueur de l’Amplicon dans « 3. Identifier les zones optimales de Primer » et également sous l’onglet Amplicon « 4. Concevoir des essais ». S’assurer que les deux sont modifiés. Toutefois, il est à noter qu’augmenter la longueur de l’amplicon lorsqu’à l’aide de dégradé l’ADN n’est pas recommandé.
   8. Attendre l’achèvement de l’étape de conception de test (outil « Etape 4 » de la conception), ici l’outil vise à assurer l’espacement optimal passe entre les amorces d’extension et les allèles de tous les SNP dans les conceptions multiplexées. Une fois cette étape terminée, exporter le fichier de commande Oligo, qui est formaté pour la commande facile via un oligo commande fournisseur de choix.
      Remarque : Les amorces d’Amplification (vers l’avant (F) et marche arrière (R)) sont conçus pour produire un amplicon optimale de taille de 80 à 120 bp. L’apprêt d’amplification masse doit être différent de celui de l’amorce de l’extension et son produit pour éviter des résultats contradictoires dans le spectre de masse et de la performance globale de PCR. L’amorce de l’extension devrait être de 15 à 30 nucléotides de long (4 500-9 000 Da), conçus de sorte que l’extrémité 3' s’attache directement adjacent au site du polymorphisme. Tous ces paramètres sont définis automatiquement dans l’outil utilisé pour générer les résultats représentatifs.
3. Exporter la conception d’amorces outil et ordre choisis auprès d’un fournisseur de l’oligomère : 25 nmol de chacune des amorces PCR (avant et arrière) et 100 nmol de chacune des amorces extension. Voir le tableau 1 pour les amorces utilisées pour produire les résultats représentatifs.

2. le génotypage (1 à 2 jours)

1. Préparer des amorces d’amplification.
   1. Advenant que des amorces lyophilisées, reconstituer avec de l’eau moléculaire de catégorie. Utiliser une concentration de 100 μM/μL d’amorces et inverses et 500 μM/μL d’extension.
   2. Piscine avant et marche arrière amorces pour chaque dosage multiplexé dans un mélange de stock apprêt, contenant chaque amorce à une concentration de 0,5 mM.
      Remarque : par exemple, une piscine de primer 400 ml pour 400 réactions :
      
      2 μL de chaque amorce, à une concentration de 100 μM/μL, est nécessaire pour le pool stock amorce. Pour un dosage de 30-plex avec 60 amorces avant et arrière, un total de 120 μL d’apprêt serait nécessaire (la piscine de l’apprêt concentré). Eau de moléculaire-grade 280 μL s’ajouterait alors à faire un volume final de 400 ml d’apprêt mélanger.
2. Amplification en utilisant la réaction en chaîne de la polymérase (PCR)
   1. Faire un mélange maître pour la PCR contenant 100 nM du mix amorce détaillés plus haut 500 μM des dNTPs, 2 mM de MgCl₂et 0,5 U de l’enzyme ADN polymérase. 1 U est requis pendant plus de 26-plex dosages. Reportez-vous au tableau 2.
   2. Ajouter 4 μL de ce mélange dans chaque puits de la plaque PCR 384 puits, ainsi que 1 μL de l’ADN génomique à une concentration de 5 à 10 ng/μl.
      Remarque : les contrôles de qualité devrait également figurer sur la plaque, comme le contrôle sans modèle et un contrôle positif qui a joué auparavant avec le dosage (au cours d’une série de tests). Si l’exécution de plusieurs plaques, ADN plusieurs échantillons provenant de l’autre plaque (s), par exemple., en trois exemplaires, doit être exécuté en tant que contrôles techniques pour la variabilité inter inter-plaques.
   3. Centrifuger la plaque à 200 x g pendant 1 min à température ambiante avec une plaque de couverture en place pour assurer le maximum de liquide figure au bas du puits de la plaque.
   4. Exécutez le PCR dans les conditions suivantes de thermocycleur : incubation de 4 min à 94 ° C, pour activer l’ADN polymérase ; 45 cycles de ce qui suit (dénaturation à 94 ° C pendant 20 s, recuit à 56 ° C pendant 30 s et l’extension à 72 ° C pendant 1 min) et ensuite une extension finale à 72 ° C pendant 3 min. se référer au programme de la PCR dans le tableau 3.
   5. Effectuer sur gel d’agarose pour que l’amplification de l’ADN soit réussie. Utilisez 1 µL du produit PCR (avec 3 µL de tampon de charge) sur un gel d’agarose 2 % (p/v), en mélangeant la poudre d’agarose et tampon Tris Borate EDTA (TBE) de 0,5 %, puis exécutez pendant 45 min à 100 V.
3. Étape de Purification de la Phosphatase alcaline (SAP) crevettes
   Remarque : Cette étape sert à enlever les nucléotides non constituées en société. L’enzyme SAP Clive groupes phosphate pour empêcher les excès d’apprêt et dNTPs non constituées en société d’interférer dans la réaction de l’extension à venir.
   1. Faire un master mix contenant 1,7 unités/μL d’enzyme Phosphatase alcaline crevettes (SAP), tampon SAP x 10 et compléter au volume avec de l’eau moléculaire de qualité. Reportez-vous au tableau 4.
   2. Ajouter 2 μL de la fraîchement confectionnés par SAP master mix à chaque puits de la plaque, contenant déjà 5 μL de la réaction PCR. Centrifuger brièvement et retourner au thermocycleur à 37 ° C pendant 40 min, puis à 85 ° C pendant 5 min pour l’inactivation de l’enzyme. Voir au tableau 5.
4. Réaction de Extension d’amorce
   Remarque : La concentration des amorces dans le mélange de primer extension extension doit être ajustée selon la taille (ajustement linéaire de Primer-APL). C’est parce qu’il y a une relation inverse à l’intensité maximale (sur les spectres de masse) et produit masse. Ajustement de la concentration de primer extension corrige cette relation produire des pics d’intensité égale. Ajusté des amorces utilisées pour générer des résultats sont fournis par le représentant dans les tableaux 6 et 7. Les volumes fournis sont de générer 1,5 mL du mélange primer extension.
   1. Calculer les facteurs de dilution pour chaque amorce en utilisant un algorithme dégradé, disponible à partir de Agena Biosciences (« ajustement linéaire en Primer »), qui règle pour la masse et la concentration de l’amorce et le nombre total d’amorces dans la réaction multiplexée (voir Les tableaux 6 et 7). Entrez la masse UEP pour chaque amorce dans la UEP_MASS de la feuille de l’ajustement linéaire de Primer.
      Remarque : La concentration en masse ajustée pour l’apprêt est automatiquement calculée dans la cellule avec le texte de l’en-tête « Réaction Concentration cible (µM). » Le volume d’amorce à ajouter à la piscine de l’amorce sera sorti dans la cellule sous le texte de l’en-tête « Volume Stock amorce d’être ajouté à la piscine (µL). » Le volume d’eau à ajouter à la piscine de l’apprêt pour compenser les concentrations calculées est sorti de la cellule en regard du texte « Volume de PCR Grade RNase libre H₂O d’être ajouté Primer Pool (µL). »
   2. Prendre le volume de chaque amorce comme spécifié dans le fichier d’ajustement linéaire de Primer et forment un bassin d’apprêt. Ajouter le volume d’eau calculé par l’algorithme pour diluer la piscine apprêt tel que déterminé à l’étape 2.4.1.
      Remarque : Si la méthode algorithme dégradé n’est pas disponible, une autre méthode consiste à diviser les amorces de faible masse et de masse élevée et ajouter le double de la concentration des amorces massives élevées par rapport à la faible groupe de masse. Trois ou quatre groupes peuvent être requis pour un dosage de haute-plex (autrement dit, plus de 19 SNP). Toutefois, cette méthode ne se produira pas comme taux d’appel optimal comme la méthode de gradient algorithm.
   3. Assembler le mélange maître de poste. Pour le dosage faible plex (plex 1-18), ajouter 0,2 μL de tampon, 0,1 μL de mélange de résiliation, 0,94 μL du mélange amorces APL ajusté et 0.0205 μL d’enzyme (préparée sur glace). Pour le dosage élevé de plex (plex 19-36), ajouter double concentration du mélange de résiliation et enzyme (résiliation mix 0,2 μL et iPLEX enzyme 0,041 μL). Se référer au tableau 8.
   4. Ajouter 2 μl du mélange maître extension réaction à la plaque de la réaction précédente, maintenant ce qui porte le total à 9 μL par puits. Centrifuger brièvement et placer dans le thermocycleur : 94 ° C pendant une incubation initiale de 30 s, 40 cycles de 1 x 94 ° C pendant 5 s avec 5 x (52 ° C pendant 5 s, suivie de 80 ° C pendant 5 s) et puis de 72 ° C pendant 3 min. se reporter au tableau 9.
5. Purification de la résine.
   Remarque : Sels d’excès peuvent donc être supprimées de la réaction avec l’utilisation de résine.
   1. Ajouter 16 μL d’eau déionisée dans les puits de la plaque Récupérée, ce qui porte le volume de la plaque jusqu'à 25 μL.
   2. Appliquer la résine, habituellement de 6 mg de plaque de résine réactionnelle (achetée séparément), ajuster à la plaque entière. Laissez la résine à sécher la plaque réactionnelle de la résine pendant 20 min à température ambiante avant de l’appliquer à la plaque de réaction. Après addition de la résine, faire pivoter la plaque pendant 5 min à température ambiante à la main ou avec un mélangeur de suspension à une vitesse lente (e.g., 7,5 t/min).
      Remarque : Avant le chargement de l’analyte de génotypage sur la puce de génotypage, les échantillons et la mise en page de test doivent être entrées dans l’interface du logiciel. Ceci peut être réalisé en utilisant le fichier de résumé de la conception de l’outil de conception de test.
6. Mesure sur une plate-forme de spectrométrie de masse.
   1. Centrifuger la plaque à 3 200 g pendant 5 min éviter l’application de résine à la puce de spectres de masse.
   2. Télécharger le schéma des échantillons à l’interface du logiciel du système avant l’exécution.
      Note : Étape 2.6.3 doit être effectuée uniquement par personnel qualifié.
   3. Appliquer le mélange d’analyte de génotypage de la plaque à la puce de génotypage avec un système de distribution. Ensuite, chargez la puce sur le système de MALDI-TOF pour générer les spectres de masse du mélange d’analyte, qui peuvent ensuite être interprétées à l’aide de l’interface du logiciel de la plate-forme.
      Remarque : Le système génère les spectres de masse par réalisation de courtes impulsions de lumière UV à chaque « pad », correspondant à un seul puits de la plaque de génotypage, de la puce de spectres de masse. Cette impulsion se traduit par désorption et l’ionisation de l’analyte. Ces ionisé ADN molécules sont ensuite propulsés à la tête du tube par un champ électrostatique de haute tension, séparer les ions plus légers, qui se déplacent plus rapidement et d’atteint le détecteur tout d’abord, des ions plus lourdes. Le « temps de vol » de ces analytes sont enregistré par le système, d'où la masse de chaque fragment d’ADN peut être déterminée, et donc la base nucléotide présente au SNP peut être déduite.

3. données de génotypage

Remarque : contrôle de la qualité et l’interprétation des données ne sont pas l’objet de ce document de méthodologie. Toutefois, le texte suivant brièvement couvrira interprétation des spectres de masse.

1. Inspection manuelle et contrôle de la qualité des spectres de masse.
   Remarque : Les spectres de masse brutes sont générés par le système et analysées avec le logiciel figurant dans la Table des matières. Un mélange gaussien méthode de clustering est appliqué à cette sortie pour faire des appels de génotypage probabiliste.
   1. Ouvrez le logiciel d’analyse. Sélectionnez Typer Analyzer. Dans le menu fichier , sélectionnez Des puits ouverts de fichier et sélectionnez le fichier xml avec les données du spectre générées à l’étape 2.6.3. Le nom de puce pour la course doit être visible, sélectionnez-le et un volet « feu » de la plaque 384 puits s’affiche avec une liste des SNP dans le bien. De là, sélectionnez Appeler Cluster parcelles pour afficher un diagramme de dispersion des points de données pour chaque SNP.
      Remarque : Il est recommandé qu’un résultat « sans appel » être demandé au SNP de faible intensité. Dans le logiciel utilisé pour les résultats représentatifs, un seuil de grandeur clustering de 5, qui est supérieur à la valeur par défaut, est suggéré pour le contrôle de qualité rigoureux. Ce paramètre peut être réglé sur le champ de Magnitude Cutoff sous paramètres dans le volet de Post Processing Clusters . Sélectionnez Autocluster dans l’onglet Outils pour exécuter une analyse typologique.
   2. Effectuer une inspection manuelle du génotype appels en examinant les parcelles cartésienne dans le volet de traitement de message. Dans le volet de l’analyse, sélectionnez le SNP d’intérêt et cliquez sur l’onglet Groupes de post-Processing , une parcelle de cluster avec le génotype de cluster sera visible avec ID d’échantillon et génotypes correspondantes pour le SNP.
   3. Examiner les grappes d’appel génotype et évaluer la façon dont chaque appel individuel grappes avec les autres appels pour le SNP. Le logiciel fournit des lignes de démarcation sur le terrain pour chaque génotype d’orientation ; Voir l’exemple d’un complot de cluster appels génotype de l' IL13 SNP (Figure 1). Si l’appel non cluster étroitement avec les autres appels et se trouve clairement à l’extérieur d’un cluster, ou si elle a de très faible intensité, cliquez avec le bouton droit sur le point de données et sélectionnez Appeler changement manuellement mettre à N° à appeler.
   4. Pour s’assurer que les données de génotypage de haute qualité sont utilisées pour l’analyse en aval, exclure les SNP et des individus avec des taux d’appel inférieur à un seuil QC, par exemple 90 %. Une fois que les ajustements appropriés ont été apportées aux données appel, exportez les données pour les applications de la statistique. Dans le logiciel utilisé pour générer les résultats représentatifs (énumérés dans la Table des matières), ceci est réalisé avec la sélection de Données de la plaque depuis le menu Affichage et en sélectionnant Enregistrer sous.

Résultats

Avec le protocole décrit ci-dessus, nous génotypées tag SNPs dans le gène immunitaire Th2 IL13 dans une cohorte de nourriture allergie cas et témoins⁹. Nous avons appliqué l’analyse de régression logistique, ajustée pour l’ascendance et autres covariables potentiels, afin de vérifier si les variantes génétiques dans la région d’intérêt augmente les risques d’allergies alimentaires. Tableau 10 ⁹ montre qu’une variant...

Discussion

Ici, nous démontrons la méthode de génotypage multiplexé, spectrométrie de masse. Les résultats représentatifs ont été générés à l’aide de la PCR jumelé avec MALDI-TOF spectrométrie de masse⁴ avec chimie dosage figurant dans le Tableau des matériaux¹³. Avec cette plate-forme, nous avons généré un total de 11 295 génotypes 1 255 personnes pour 9 SNP au sein de 40 h en laboratoire.

Nous illustrons l’utilité de la technique en répon...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ADN génomique  ;	-	-	1 &mu ; L à une concentration de 5 à 10 ng/&mu ; L
Amorces : amplification et extension directes et inverses	IDT	-	voir le manuscrit section 1.2.1 sur la conception des amorces
Eau déminéralisée	Par exemple l’eau Milli-Q  ;	-	désionisé avec 18,2 M&Omega ;. Kit de
réactifs de génotypage de résistivité cm. Kit de réactifs de chimie iPLEX Gold  ;	Agena Bioscience	#10148-2	comprend tous les réactifs pour les réactions en 2.2.1, 2.3.1 et 2.4.2 , des
(puits 384)	Abgene	#ABGAB-1384	Pour le système MassARRAY les plaques d’Abgene sont compatibles
Micropipettes centrifugeuses			à un et 8 canaux
;			compatible avec les plaques à 384 puits
Thermocycleur			compatible avec les programmes PCR comme détaillé dans les sections 2.2.4, 2.3.2 et 2.4.3
Plaque de résine alvéolée  ;	Agena Bioscience		6mg, 384 puits
Rotateur de plaques  ;
Analyseur MassARRAY 4 Système	Agena Biosciences		MALDI-TOF (désorption/ionisation laser assistée par matrice &ndash ; temps de vol) Spectromètre de masse.
RS1000 Nanodispenser	Agena Biosciences
Assay Design Suite	Agena Biosciences		Outil utilisé pour concevoir les tests de génotypage multiplex Hot
Start Taq			DNA polymérase enzyme  ;
Résine  ;	Agena Biosciences		Livré avec le kit iPLEX