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Un modèle In Vitro pour étudier l’effet de la thérapie photodynamique véhiculée par 5-Acide aminolévulinique sur Staphylococcus aureus Biofilm

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DOI :

10.3791/57604

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16 avril 2018

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1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye & ENT Hospital, Shanghai Key Clinical Disciplines of otorhinolaryngology, Fudan University, 2Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College of Fudan University, 3Department of Dermatology, Huashan Hospital, Fudan University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole afin d’étudier l’effet antimicrobien de la thérapie photodynamique induite par l’acide 5-aminolévulinique (ALA-PDT) sur un biofilm de Staphylococcus aureus . Ce protocole peut être utilisé pour développer un modèle in vitro afin d’étudier le traitement des biofilms bactériens par PDT à l’avenir.

Résumé

Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) est un pathogène humain commun, ce qui provoque des infections pyogènes et systémiques. Infections à S. aureus sont difficiles à éliminer non seulement en raison de l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques, mais aussi sa capacité à forme biofilms. Récemment, la thérapie photodynamique (TPD) a été indiquée comme l’un des traitements possibles pour contrôler les infections du biofilm. Cependant, plus amples études sont nécessaires pour améliorer notre ignorance de son effet sur les biofilms bactériens, ainsi que les mécanismes sous-jacents. Ce manuscrit décrit un modèle in vitro de PDT avec de l’acide 5-aminolévulinique (5-ALA), un précurseur de la réelle photosensibilisateur, protoporphyrine IX (PpIX). Brièvement, mature S. aureus biofilms ont été incubées avec ALA et ensuite exposées à la lumière. Par la suite, l’effet antibactérien de ALA-PDT sur S. aureus biofilm a été quantifié en calculant les colonies formant des unités (UFC) et visualisée par viabilité fluorescente coloration via confocal laser scanning microscopy (CLSM). Résultats représentatifs ont démontré une forte action antibactérienne de l’ALA-PDT sur les biofilms de S. aureus . Ce protocole est simple et peut être utilisé pour développer un modèle in vitro afin d’étudier le traitement des biofilms de S. aureus par ALA-PDT. À l’avenir, il pourrait également être référencée dans d’études PDT utilisant autres photosensibilisateurs pour différentes souches bactériennes avec des ajustements minimes.

Introduction

S. aureus est un pathogène Gram positif important qui colonise la peau et les muqueuses des hôtes humains. Sa capacité à forme biofilms est considéré comme un aspect important de sa pathogénie1. Biofilms bactériens sont une communauté de bactéries noyées dans une matrice autoproduite, qui est composée de substances polymériques extracellulaires, y compris les polysaccharides, ADN et des protéines. Cette matrice joue un rôle important dans la persistance des infections bactériennes, contribuant à un haut degré de résistance au système immunitaire humain et thérapies anti-microbiens actuels2. Les antibiotiques sont toujours le traitement majeur pour les infections de biofilm, bien que les effets des antibiotiques sur les biofilms sont limitées. Il a été démontré précédemment que les cellules dans les biofilms sont 10 à 1 000 fois plus résistantes aux antibiotiques par rapport à leurs homologues planctoniques3. Ainsi, les stratégies alternatives sont nécessaires à la conquête de ce sujet.

PDT, un autre traitement pour les infections bactériennes, utilise la lumière d’une longueur d’onde appropriée pour activer les substances photosensibilisantes. Cela conduit à la production d’espèces oxygénées réactives (ROS), qui sont mortelles pour cibler les cellules en perturbant la paroi cellulaire, inactivation des enzymes et endommager l’ADN4. Cette caractéristique de cible multiples, il est difficile pour les bactéries à développer une résistance au traitement PDT.

L’effet antimicrobien du PDT sur les biofilms bactériens et fongiques, avec plusieurs substances photosensibilisantes, comme le bleu de toluidine, vert de malachite, bleu de méthylène, chlore e6 et porphyrines, a été étudiée dans les précédents rapports5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, une prodrogue de la réelle photosensibilisateur, PpIX, se caractérise par son faible poids moléculaire et une clairance rapide12,14. Ces avantages donnent ALA-PDT potentiel majeur comme une application thérapeutique. Bien que l’effet de ALA-PDT sur bactéries planctoniques a été étudiée par de nombreux groupes12, l’effet antimicrobien des ALA-PDT sur les biofilms bactériens n’a pas encore été élucidé. Pendant ce temps, il est difficile de comparer les résultats entre les études antérieures. Une des raisons est que les différents protocoles sont utilisés par divers groupes. Par conséquent, ce protocole décrit un modèle in vitro d’un système de ALA-PDT basé sur notre précédent travail15. L’effet de ce modèle a été confirmée par le calcul de l’UFC et de la viabilité de coloration avec CLSM.

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Protocole

1. la Formation de Biofilm

  1. Formation de biofilm en Microplaque 96 puits
    1. Récupérer la souche USA300 de Staphylococcus aureus et 3 formation de biofilm souches cliniques (C1 - C3) conservés à-80 ° C.
      Remarque : La capacité des souches cliniques pour former des biofilms a été déterminée par l’essai de plaque de microtitration décrit précédemment15.
    2. Inoculer la bactérie dans 5 mL tryptone soja bouillon (BST) de milieu et de cultiver dans un incubateur avec agitation à 37 ° C durant la nuit à la phase stationnaire.
    3. Centrifuger la culture bactérienne pendant la nuit à 4 000 x g pendant 10 min à 25 ° C et ensuite jeter le surnageant. Remettre en suspension les boulettes dans la saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration finale de 2,0 x 109 UFC/mL.
      Remarque : La concentration des bactéries a été évaluée en mesurant la densité optique et plus déterminée par plaque compter16, révélant celui de OD 1600 de suspension contenue 1,5 x 108 UFC/mL.
    4. Diluer la suspension bactérienne à 1 : 200 (1,0 x 107 UFC/mL) en milieu de BST contenant 0,5 % de glucose. Inoculer 200 µL de la suspension bactérienne dans chaque puits d’une microplaque de 96 puits en polystyrène cellulaire--traitée pour la culture.
    5. Incuber la microplaque statiquement à 37 ° C pendant 24 h dans un milieu bien oxygéné.
      Remarque : Le temps d’incubation pour la formation de biofilms à maturité peut varier pour différentes souches bactériennes ; Cela doit être déterminé avant que le PDT expérimenter15.
    6. Ignorer les médias dans les puits et laver la microplaque doucement avec du PBS trois fois et puis jeter le surnageant.
      Remarque : L’étape devrait être effectuée très doucement pour ne pas perturber le biofilm formé.
  2. Formation de biofilm dans les plats
    1. Ensemencer la souche USA300 de Staphylococcus aureus dans 5 mL de milieu du BST et de cultiver dans un incubateur avec agitation à 37 ° C durant la nuit à la phase stationnaire.
    2. Centrifuger la culture bactérienne pendant la nuit à 4 000 x g pendant 10 min à 25 ° C et ensuite jeter le surnageant. Remettre les boulettes dans du PBS à une concentration finale de 2,0 x 109 UFC/mL. Ensuite, diluer la suspension bactérienne à 1 : 200 (1,0 x 107 UFC/mL) en milieu de BST contenant 0,5 % de glucose. Ensemencer des 2 mL de la suspension bactérienne dans une boîte de Petri de qualité optique 35 mm verre bas cellule et incuber statiquement à 37 ° C pendant 24 h.
      Remarque : La concentration des bactéries a été estimée en mesurant la densité optique.
    3. Aspirer les médias avec une pipette et rincer ensuite les biofilms dans le plat doucement avec du PBS trois fois et puis, éliminer le liquide surnageant avec soin.
      Remarque : Ne pas toucher le bout de la pipette au fond du plat. L’étape 2.2 devrait être effectuée immédiatement après cette étape pour éviter le dessèchement du biofilm formé.

2. lumière d’Irradiation

  1. Stocker 5-ALA dans un réfrigérateur à 4 ° C. Avant l’expérience, diluer 5-ALA avec du PBS à 10 mM.
    NOTE : 5-ALA solution doit être préparée avant l’expérience.
  2. Dans le groupe expérimental, ajouter 200 µL de 10 mM ALA dans chaque puits de la microplaque ou 2 mL à la boîte de Pétri. Couvrir le plat/plat avec du papier aluminium et incuber pendant 1 heure. Puis, irradient le plat/plat avec une diode électroluminescente (LED) avec une intensité de 100 mW/cm2 pendant 1 h atteindre une dose légère de 360 J/cm2 à une longueur d’onde majeure de 633 ± 10 nm17.
    Remarque : Afin de laisser l’énergie lumineuse efficacement et également livrés à biofilm dans tous les puits/plats, fixer la distance entre le pic de la source lumineuse et le puits/plat à 6,0 cm et limiter la région expérimentale à la zone centrale de l’irradiation (10 cm x 8 cm). pour s’assurer que les résultats sont reproductibles, les expériences doivent être effectuées à la même température ambiante.
    Dans l’étape de l’irradiation de LED, afin d’éviter une exposition directe de la plaque d’autres sources de lumière, comme la lumière du soleil, éclairage de la pièce ou lumière de la lampe, le voyant était allumé avant de passer le plat/plat à la zone d’irradiation, et la lumière était assez brillante pour terminer l’opération.
  3. Mettre en place les groupes de contrôle (contrôle trois groupes ont été mis en place dans notre expérience).
    1. Pour le contrôle du premier groupe (ALA - LED-), ajouter 200 µL de PBS dans chaque puits de la microplaque ou 2 mL à la boîte de Pétri. Couvrir le plat/plat avec du papier aluminium et il incuber pendant 2 h.
    2. Pour le deuxième groupe de contrôle (ALA + LED-), ajouter 200 µL de 10 mM ALA dans chaque puits de la microplaque ou 2 mL à la boîte de Pétri. Couvrir le plat/plat avec du papier aluminium et il incuber pendant 2 h.
    3. Pour le troisième groupe de contrôle (ALA-LED +), ajouter 200 µL de PBS dans chaque puits de la microplaque ou 2 mL à la boîte de Pétri. Couvrir le plat/plat avec du papier aluminium et il incuber pendant 1 heure. Puis l’exposer la plaque à la LED avec 360 J/cm2 irradiation légère à une longueur d’onde majeure de 633 ± 10 nm17.
      Remarque : Dans l’étape de l’irradiation de LED, éviter l’exposition directe de la plaque d’autres sources de lumière, comme la lumière du soleil, éclairage de la pièce ou lumière artificielle.

3. détermination de l’efficacité du traitement PDT

Remarque : Pour vérifier l’effet de ALA-PDT sur les biofilms de S. aureus , la viabilité des cellules avec ou sans ALA-PDT a été évaluée en comptant les UFC, ainsi que par la coloration de la viabilité.

  1. Détermination des cellules bactériennes viables restants
    1. Après le traitement de l’ALA-PDT, jeter les médias dans les puits et laver les puits avec du PBS trois fois pour enlever toutes les cellules non adhérentes à la fois expérimental et le groupe témoin.
      NOTE : Cette étape doit se faire très doucement.
    2. Grattez les cellules adhérentes bactéries soigneusement des puits avec l’embout de la pipette et recueillir les cellules de tubes coniques.
    3. Centrifuger la suspension bactérienne à 4 000 x g pendant 10 min à 4 ° C, puis jeter le surnageant.
    4. Remettre en suspension les bactéries dans 1 mL d’enzyme pancréatine 0,25 % dans du PBS et incuber à 37 ° C pendant 1,5 h.
    5. Centrifuger à 4 000 x g pendant 10 min ; jeter le surnageant, puis Resuspendre le culot dans 200 µL de PBS.
    6. Rendre à 01:10 série de dilutions de la solution de cellules avec du PBS ; puis, ajouter 5 µL de chaque échantillon de dilutions gélose la tryptone soja (TSA). Incuber les plaques TSA à 37 ° C pendant 16 h ; Ensuite, compter (par l’oeil nu) le nombre de colonies bactériennes (UFC/mL).
  2. Observation des biofilms de S. aureus par CLSM
    1. Après irradiation lumineuse, laver les biofilms dans la boîte de Pétri avec du PBS trois fois.
      NOTE : Cette étape doit se faire très doucement.
    2. Ajouter 1 mL de 1 µM vert-fluorescence nucléaire et tache d’un chromosome qui est perméable aux membranes cellulaires procaryotes (p. ex., SYTO9) et 1 mL d’iodure de propidium 1 µM (PI) pendant 20 min colorer le biofilm, mais aussi les cellules mortes.
    3. Observer des cellules viables (green fluorescence, Ex / Em 485 nm/530 nm) et les cellules mortes (fluorescence rouge, Ex / Em 485 nm/630nm) sous un CLSM avec un objectif de 63 X 1.4-NA-immersion dans l’huile.
    4. Générer des images à l’aide de logiciels de microscopie.

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Résultats

Diminution de la viabilité de la bactérie dans les biofilms après traitement ALA-PDT par rapport aux contrôles (ALA - LED-, ALA + LED - et ALA-LED +) USA300 tant les trois souches cliniques (Figure 1).

Pour confirmer les résultats de l’UFC de dosage et observent l’antibactérien effet de ALA-PDT sur le S. aureus biofilm in situ, les biofilms USA300 ont été visualisées par CLSM viabi...

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Discussion

PDT est un traitement bien étudié pour le traitement du cancer depuis il a été inventé il y a plus de 100 ans18. Durant la dernière décennie, PDT a été appliqué comme stratégie d’antimicrobiens et a montré l’efficacité contre certaines bactéries pathogènes résistants aux antibiotiques12. Par rapport à l’État planctonique, biofilms bactériens semblent être plus résistants aux traitements antibiotiques3, tandis que l’effet de ALA-PDT sur les biofilms n...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Remerciements

Ce travail a été financé par la Fondation des sciences de Nature nationale de Chine pour jeunes chercheurs (no 81300810), programme de formation de Shanghai Young médecin (n° 20141057) et Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (81671982, 81271791 et 81571955). Nous tenons à remercier LetPub (www.letpub.com) d’assistance linguistique lors de la préparation de ce manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bouillon de soja au tryptone (TSB)OXOIDCM0129B
Gélose au soja tryptone (TSA)OXOIDCM0131
SYTO9Thermo Fisher ScientificL7012The LIVE/DEAD BacLight Kits de viabilité bactérienne  ;
Iodure de propidium (PI)Thermo Fisher ScientificL7012The LIVE/DEAD BacLight Kits de viabilité bactérienne  ;
PancréatineSigma-AldrichP3292
Acide 5-aminolévulinique (ALA)Fudan Zhangjiang Bio-Pharm3.1
Staphylococcus aureus souche USA300//La source des références USA 300 " Tenover FC, Goering RV. J Chimie antimicrobien. 2009 sept. 64(3) :441-6".
emStaphylococcus aureus (C1-C3)//Toutes les souches cliniques ont été isolées chez des patients atteints de rhinosinusite chronique dans le département d’oto-rhino-laryngologie-chirurgie de la tête et du cou, hôpital ophtalmologique et ORL de l’Université Fudan [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 mars ; 12(3) : e0174627].
Microplaque à 96 puitsCorning Inc3599Microplaques en polystyrène transparent à fond plat traitées TC, emballées individuellement, avec couvercle,
Fluorodishstérile NEST Biotechnology801001Fond en verre,
Tubes Eppendorf Safe-Lock non apyrogènes, 1,5 mLMicrocentrifugeuse Eppendorf0030120086
Eppendorf 5417EppendorfZ365998 |  ; Incubateur SIGMA
Thermo Fisher ScientificSHKE4000MaxQ 4000 Agitateurs orbitaux de paillasse
Diode électroluminescente (LED)Technique optique et électronique Wuhan Yage COLED-IB
Leica TCS SP8 Microscope confocal à balayage laserLeica Microsystems
Leica LAS Logiciel AFLeica Microsystems
IMARIS logicielBitplane

Références

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Mots-clés

Unit s formant colonieMicroscopie confocale balayage laserMarquage fluorescentViabilit bact rienneFormation de biofilmEffet antimicrobien

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