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Article de méthode

Interactions plantes-microorganismes : Réponse transcriptionnelle de Bacillus Mycoides d’exsudats racinaires de pommes de terre

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DOI :

10.3791/57606

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2 juillet 2018

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, University of Groningen

Dans cet article

Résumé

L’objectif du protocole présenté ici est d’étudier la réponse de transcriptomique des isolés endosphère Bacillus mycoides aux exsudats racinaires de pommes de terre. Cette méthode facilite l’identification des gènes bactériens importants impliqués dans les interactions plantes-microorganismes et est en principe applicable aux autres endophytes et plantes, avec des ajustements mineurs.

Résumé

Bactéries associées aux plantes jouent un rôle important dans la promotion de la croissance et la prévention des maladies chez les plantes. L’application des rhizobactéries promotrices de la croissance de plantes (PGPR) biofertilisants ou biocontrol agents est devenu une alternative efficace à l’usage des engrais classiques et peut augmenter la productivité des cultures à faible coût. Interactions plantes-microorganismes dépendent des signaux sécrétée à la plante hôte et une réaction sur le connaissement par leurs bactéries associées. Cependant, les mécanismes moléculaires des bactéries bénéfiques comment répondent à leurs associés végétale signaux ne sont pas totalement comprises. Évaluation de la réponse de transcriptomique des bactéries aux exsudats racinaires est une approche puissante pour déterminer l’expression de gène bactérien et règlement conditions rhizosphérique. Une telle connaissance est nécessaire pour comprendre les mécanismes sous-jacents impliqués dans les interactions plantes-microorganismes. Cet article décrit un protocole détaillé pour étudier la réponse de transcriptomique de b. mycoides CE18, une souche isolée chez l’endosphère de pommes de terre, d’exsudats racinaires de pommes de terre. Avec l’aide des récentes technologies de séquençage haut débit, ce protocole peut être effectué en plusieurs semaines et les ensembles de données massives de produits. Tout d’abord, nous collectons les exsudats des racines dans des conditions stériles, après quoi ils sont ajoutés à des cultures de b. mycoides . L’ARN de ces cultures est isolé en utilisant une méthode phénol/chloroforme combinée avec une trousse commerciale et soumises à un contrôle de qualité par un instrument automatisé de l’électrophorèse. Après le séquençage, analyse des données est effectuée avec le pipeline de T-REx sur le web et un groupe de gènes différentiellement exprimés est identifié. Cette méthode est un outil utile pour faciliter les nouvelles découvertes sur les gènes bactériens impliqués dans les interactions plantes-microorganismes.

Introduction

Les plantes peuvent exsudat jusqu'à 20 % du carbone fixé lors de la photosynthèse par racines dans la rhizosphère1, c'est-à-dire, la zone étroite du sol près des racines. En raison de la plus grande disponibilité des éléments nutritifs, la rhizosphère est un habitat adéquat pour les divers micro-organismes, y compris les bactéries favorisant la croissance des plantes. Les exsudats des racines contiennent une variété de composés inorganiques comme les ions, acides inorganiques, d’oxygène et d’eau. Cependant, la majorité des exsudats racinaires est formée par les matières organiques, qui peuvent être divisés en des composés de faible poids moléculaire et masse moléculaire élevée de composés. Les composés de faible poids moléculaire sont des acides aminés, acides organiques, sucres, composés phénoliques, acides gras et un tableau de métabolites secondaires. Les composés de poids moléculaire élevé sont constitués de mucilage et protéines,2,3. Micro-organismes de la rhizosphère peuvent utiliser certains de ces composés comme source d’énergie pour la croissance et le développement. Les exsudats des racines jouent un rôle important dans le façonnement de la communauté des rhizobactéries puisque les composés de produits végétaux dans les exsudats peuvent influencer le comportement de bactéries associées à la rhizosphère par affecter l’expression de gènes spécifiques.

Comprendre la réaction bactérienne d’exsudats racinaires est une étape clé de décryptage des mécanismes d’interaction plante-microbe. Car la réponse bactérienne aux interactions plantes-microorganismes est le produit de l’expression différentielle des gènes, elle puisse être étudiée par l’analyse du transcriptome. En utilisant cette méthode, des études antérieures identifié plusieurs gènes importants impliqués dans les interactions plantes-microorganismes. Pseudomonas aeruginosa, gènes impliqués dans le métabolisme, le chimiotactisme et type de sécrétion II étaient divulgués pour répondre à la racine de betterave à sucre exsudats4. Fan et al. 5 a étudié la transcriptomique profilage de b. amyloliquefaciens FZB42 en réponse à des exsudats racinaires de maïs. Leurs résultats montrent que les gènes fortement induites par les exsudats racinaires, plusieurs groupes sont occupent de voies métaboliques liés à l’utilisation des éléments nutritifs, chimiotactisme, motilité et non ribosomale synthèse de peptides antimicrobiens et polyketides.

L’exactitude de ces études repose sur la collecte des exsudats racinaires. Plusieurs méthodes ont décrit la collection d’exsudats racinaires à différentes fins, ils exigent des instruments sophistiqués ou ne sont pas exécutées dans des conditions bien contrôlées6,7,8. Par ailleurs, les micro-organismes inhibant la rhizosphère peuvent influencer racine exsudat composition en affectant la perméabilité de la membrane de cellules végétales et endommager les tissus de la racine, notamment dans le cas de consortiums de micro-organismes9. Lors d’enquêtes sur la réponse microbienne d’exsudats racinaires, il est important d’utiliser des conditions bien définies afin d’éviter l’altération des composés par d’autres microorganismes10. En outre, RNA de haute qualité est obligatoire pour RNA-seq basé des études du transcriptome. Toutefois, lorsqu’il s’agit des souches non modèle-bactérienne, les protocoles standard ou les kits commerciaux ont généralement un faible rendement en raison de facteurs inconnus ou propriétés de croissance spécial.

Le protocole décrit ici a été vérifié à l’aide de b. mycoides, qui est une bactérie Gram positive sporulé du phylum des Firmicute. Il est omniprésent dans la rhizosphère des diverses espèces végétales. Plusieurs propriétés promotion de la croissance végétale ont été signalées pour cette espèce, y compris l’induction de résistance systématique (ISR) dans la betterave à sucre11, inhibition du pathogène fonte Pythium pour concombre12, ainsi que d’azote fixation dans la rhizosphère tournesol13. Cependant, les mécanismes moléculaires de ses interactions avec une plante hôte ne sont pas bien étudiés.

L’objectif des expériences présentées ici est d’étudier la réponse de transcriptomique des isolés endosphère b. mycoides aux exsudats racinaires de pommes de terre. En bref, le protocole se compose des étapes suivantes : tout d’abord, recueillir des exsudats racinaires de pommes de terre dans des conditions stériles. Ensuite, extrayez qualité RNA de cellules bactériennes, traités avec les exsudats racinaires. La dernière étape est l’analyse des données avec les webmail T-REx pipeline14. Ce protocole a été utilisé pour identifier les gènes de b. mycoides qui montrent un changement dans les niveaux d’expression au contact des exsudats racinaires et donc pourraient jouer un rôle important dans les interactions plantes-microorganismes.

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Protocole

1. germination des pommes de terre en Conditions stérilisées

  1. Rincer la surface de la pomme de terre à l’eau stérile. Baigner la pomme de terre dans l’éthanol à 70 %, puis à l’hypochlorite de sodium 3 %, de 5 min chacun. Rincer à nouveau à l’eau stérile pour éliminer tout reste d’hypochlorite de sodium.
  2. Préparer le matériel nécessaire pour la germination et la croissance des tubercules de pomme de terre ; stériliser les pots en plastique, paniers de greffe, vermiculite et arrosez-les à l’autoclave à 121 ° C pendant 20 min.
    Remarque : Assurez-vous que tous les matériaux utilisés sont stérilisables en autoclave. Dans le cas contraire, utiliser d’autres méthodes de stérilisation.
  3. Mettre la pomme de terre stérilisées en surface dans le panier de la greffe et placez-la dans un pot stérilisé contenant de la vermiculite humide.
  4. Garder le pot dans une chambre climatique à 24 ° C pendant trois semaines. Réglez-le sur les cycles de 16 h de lumière (120 µmol m-2s-1) et 8 h d’obscurité. Pour éviter des contaminations microbiennes, utilisez une boîte de fibre de verre pour couvrir la casserole.

2. collecte des exsudats racinaires de pommes de terre

  1. Lorsque les pousses pousses, transfert le panier avec les pommes de terre entières dans un bécher stérile plein avec 150 mL d’eau désionisée autoclavé, avec la pomme de terre tubercules placés juste au-dessus de la surface de l’eau et les racines immergées dans l’eau (voir Figure 1). Maintenir le semis dans la chambre climatique et utiliser les mêmes paramètres que précédemment [24 ° C ; cycles de 16 h de lumière (120 µmol m-2s-1), 8 h d’obscurité].
  2. Depuis le deuxième jour, recueillir l’eau contenant les exsudats et remplir le bécher avec de l’eau désionisée stérile. Effectuer l’échantillonnage chaque jour jusqu’au septième jour après le transfert de la plantule.
  3. Stocker chaque échantillon séparément à 4 ° C. Pour chaque échantillon, répandre 100 µL sur un Luria-Bertani (LB, 1 % de tryptone, extrait de levure 0,5 %, 0,5 % NaCl) Gélose pour vérifier les contaminations microbiennes. Jeter les échantillons contaminés.
  4. Combinez les échantillons collectés d’un semis et les concentrer par lyophilisation eux à-40 ° C pour un volume final de 150 mL.

3. croissance des bactéries

  1. Ensemencer une souche de b. mycoides provenant d’un stock de glycérol de-80 ° C sur une gélose LB et incuber la plaque à 30 ° C durant la nuit.
  2. Ensemencer un milieu liquide LB avec une seule colonie de la plaque et développer la culture dans un incubateur à agitation à 200 tr/min pendant la nuit à 30 ° C.

4. le traitement et l’échantillonnage des bactéries

  1. Pour comparer la courbe de croissance de la bactérie traités avec les exsudats racinaires à un témoin négatif, préparer une série de fioles contenant 50 mL de milieu liquide LB. Ajouter 0,5 mL de la culture bactérienne pendant la nuit à tous les flacons et ajouter soit 0 %, 5 %, 10 % ou 15 % (v/v) racine exsudat ou eau désionisée stérile au milieu, respectivement.
  2. Utiliser une culture avec de l’eau désionisée au lieu d’exsudats racinaires comme un contrôle. Mesurer la densité optique à 600 nm (OD600) toutes les 1 h par la suite. Générer une courbe de croissance en traçant les valeurs de600 OD par rapport au temps.
    Remarque : On a vu que 10 % des exsudats racine n’a pas affecté la croissance de b. mycoides (voir Figure 2) ; ce rapport a été utilisé pour des expériences de RNA-seq.
  3. Diluer une culture de b. mycoides nuitée avec 90 mL de préchauffé milieu LB à l’initiale de OD600 de ~ 0,05 dans un flacon de 300 mL. Ajouter 10 mL d’exsudats racinaires à la culture et il incuber à 30 ° C pendant 1 h.
  4. Utiliser un traitement de l’eau désionisée stérile 10 mL sous forme de contrôle. Prélever des cellules de la culture par centrifugation à 9 000 x g pendant 2 min à 4 ° C. Éliminer le liquide surnageant et immédiatement geler le culot dans l’azote liquide, puis conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.

5. les ARN

Remarque : Avant de commencer l’isolement, préparer le workbench, grilles et pipettes en les nettoyant avec une solution de décontamination de RNase (voir Table des matières). Porter des gants en tout temps et s’assurer que tous les tubes, des conseils et des solutions sont sans RNase. Gardez toujours les échantillons sur la glace lorsque cela est possible.

  1. Ajouter 0,1 % (v/v) de diéthyl pyrocarbonate (DEPC) à eau ultrapure (100 µL de DEPC par 100 mL de solution), mélanger bien et gardez-le à température ambiante pendant la nuit. Autoclave le mélange pour inactiver le CPDE après traitement au jour le jour. Cette eau ultrapure traitée DEPC permet de préparer le tampon TE [10 mM Tris-HCl (pH = 8) ; 1 mM EDTA] et une solution de SDS (p/v) de 10 %.
  2. Décongeler les granules cellulaires sur la glace et suspendre chacun à 400 µL de tampon TE (DEPC). Transférer les suspensions dans les tubes de 2 mL bouchon à vis.
  3. Mélangez 300 µL d’alcool isoamylique-chloroforme (24:1 v/v) et 300 µL de phénol (acide phénol, RNA grade), puis laissez le mélange reposer pendant 5 min. Prendre 500 µL de la phase organique supérieure à ajouter aux cellules remises en suspension. Puis ajouter 50 µL de SDS de 10 % et 0,5 g de perles de verre (0,5 µm) dans le tube.
  4. Bien fermer le couvercle et placer le tube dans un homogénéisateur de moulin à billes (voir Table des matières). Effectuer une homogénéisation de pulse 3 × 45 s avec un intervalle de 1 min sur glace.
  5. Centrifuger les échantillons pendant 10 min à 11 000 x g (4 ° C) et transférer la phase supérieure dans un nouveau tube.
  6. Ajouter 500 µL de chloroforme-isoamylique alcool (24:1) à la phase supérieure de l’étape 5.5 et centrifuger le mélange pendant 5 min à 11 000 x g (4 ° C).
    Remarque : Les étapes suivantes ont été modifiés depuis les instructions du fabricant d’un isolement basées sur le filtre commercial verre fibre nécessaire (voir la Table des matières).
  7. Transférer 500 µL de la phase supérieure dans un nouveau tube, ajouter 2 volumes (1 mL) d’un tampon de lyse/liaison et mélangez-le en pipettant également de haut en bas.
  8. Combiner les tubes filtre et collection (à partir du kit d’isolement d’ARN) et déposer le mélange de l’étape 5,7 au tube filtre. Centrifuger les tubes pendant 15 s à 8 000 x g et jeter le cheminement.
  9. Préparer le 1,5 mL tubes de microcentrifuge avec 100 µL de tampon de DNase, 10 µL de la DNase I et 5 µL d’un inhibiteur de RNase (voir Table des matières). Ajouter le mélange de la solution préparée sur le filtre du tube filtre et il incuber pendant 20-30 min à 15-25 ° C.
  10. Effectuez les étapes de lavage selon les instructions du fabricant. Utilisez 50 µL d’un tampon d’élution pour Éluer la RNA.
  11. Enregistrez l’ARN éluée à-80 ° C, puis mettre un film plastique paraffine autour d’elle. Dans le même temps, transférer quelques microlitres de l’échantillon dans un tube de microtubes de 1,5 mL pour effectuer un contrôle de qualité.

6. séquençage et contrôle qualité de l’ARN

  1. Vérifier l’ARN avec un spectrophotomètre microvolume.
    NOTE : Taux d’absorption à 260/280 sera au-dessus de 1,8 et ratios à 260/230 doivent être supérieur au moins 1,8, préférence au-dessus de 2.0.
  2. Exécuter l’ARN purifié dans un instrument d’électrophorèse automatisée à l’aide de l’analyse de RNA recommander kit (voir Table des matières) ; le nombre d’intégrité RNA (RIN) doit être au moins supérieur à 7 à aller de l’avant.
  3. Utiliser un montant total de 3 µg d’ARN par exemple pour générer des bibliothèques avec une préparation de bibliothèque de RNA-Seq nécessaire (voir la Table des matières) suite aux recommandations du fabricant.
    NOTE : Les préparatifs de la bibliothèque ont été séquencés sur une plate-forme de séquençage haut-débit et jumelé-fin lectures ont été générés.

7. analyse en utilisant le T-REx de Pipeline sur le Web

  1. Effectuer un filtrage de qualité grâce au FASTX-Toolkit version 0.0.13 (scores de qualité de programme REDSP de > 20). Taillez les lectures brutes de RNA-Seq de séquences adaptateur via l’outil Trimmomatic.
    Remarque : Toutes les analyses en aval étaient fondés sur des données propres de haute qualité.
  2. Télécharger la base de données du génome de b. mycoides ATCC 6462 NCBI (adhésion NCBI no : CP009692.1) et l’utiliser comme un génome de référence pour la cartographie les lectures propres à l’aide de Bowtie2/2.2.3.
  3. Utilisation HTSeq v0.6.1 pour compter le nombre de lectures mappé à chaque gène et les lectures par kilobases de transcription par million lectures mappés (RPKM) de chaque gène basée sur la longueur du gène et lectures comte mappée à ce gène.
  4. Pour l’analyse des données par le pipeline de T-REx, utiliser la table RPKM comme entrée, ainsi que trois fichiers descriptifs : (i) un fichier de facteurs pour décrire l’expérience en facteurs, (ii) un fichier de contrastes pour définir quels facteurs seront comparées pour l’expression différentielle des gènes et (iii) un fichier de classe pour décrire des groupes de gènes d’intérêt.
    Remarque : Les fichiers descriptifs sont au format in.txt. On trouvera des exemples sur la page Web de T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Une instruction détaillée pour l’analyse de données à l’aide de T-REx se trouvent dans une publication précédente de Jong et al. 14.

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Résultats

Associées aux plantes micro-organismes peuvent influencer positivement la croissance des plantes et la santé. Cependant, les mécanismes d’interactions complexes entre les plantes et leurs symbiotes microbiens ne sont pas entièrement compris. Exsudats racinaires jouent un rôle important dans la régulation de l’activité des rhizobactéries et le comportement, et on suppose généralement que la colonisation microbienne des racines initie avec l’attraction des microbes d’exsudats racinaires. Le...

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Discussion

Interactions plantes-microorganismes ont été hypothétiquement être déterminé par un équilibre finement réglé entre les bactéries et les plantes. Ces interactions sont très complexes et difficiles à étudier dans un système naturel, qui comprend diverses espèces microbiennes, potentiellement servir de consortiums. Cet article décrit un protocole simplifié pour étudier la réponse bactérienne d’exsudats racinaires dans des conditions bien contrôlées. Le profil de transcriptome de rhizobactéries, lors de l’exposition d’exsuda...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

Nous remercions Jakob Viel pour ses précieux commentaires et suggestions. Nous remercions également Anne de Jong pour son aide dans l’analyse bio-informatique. Yanglei Yi et Li Zhibo sont pris en charge par le Conseil de bourse Chine (CSC). Nous remercions NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) pour leur soutien financier à l’OPK.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
hypochlorite de sodiumSigma  ; CAS : 7681-52-9  ;10-15 % de chlore actif
Luria-Bertani (LB) bouillon
incubateurNew Brunswick ScientificInnova 4000
spectrophotomètreThermo Fisher ScientificGenesys 20
d’azote
SigmaG88930.5 µ ; Tube m
de 2,0 ml avec bouchonSans RNase
TubeSans RNase
Homogénéisateur de broyeur à billesBioSpec607Mini_beadbeater
centrifugeuseEppendorf5430
Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC)sigmaCAS : 1609-47-8
Dodécylsulfate de sodium (SDS)sigmaCAS : 151-21-3  ;Solution à 10 % préparée avec de l’eau MQ traitée au DEPC
Tampon10 mM Tris-HCl ; 1 mM EDTA, pH=8
phénolSigmaARN grade
chloroforme-alcool isoamylique  ;préparer 24:1 de chloroforme :alcool isoamylique, conserver à température ambiante
Kit d’isolement d’ARN hautement purRoche11828665001
Solution de décontamination RNaseInvitrogenAM9780RNase-Zap
Instrument d’électrophorèse automatiséAgilent2100Bioanalyseur
Spectrophotomètre de microvolumeThermo Fisher ScientificNanodrop ND-1000
Kit AgilentRNA 6000 Nano  ;
Inhibiteur de RNaseThermo Fisher ScientificRiboLock
Kit de préparationNEBUltrapour Illumina
billes de verre liquide à vis eppendorf de 1,5 ml et 2,0 ml TE Kit d’analyse de la qualité de l’ARN Bibliothèque d’ARN directionnelle

Références

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Réimpressions et autorisations

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