Méthode de Culture organotypique pour étudier le développement des tissus embryonnaires de poulet

Résumé

Nous présentons ici un organotypique cultivant protocole pour cultiver des organes embryonnaires de poulet in vitro. En utilisant cette méthode, le développement des tissus embryonnaires de poulet peut être étudié, tout en conservant un haut degré de contrôle sur le milieu de culture.

Résumé

Le poulet embryonnaire est couramment utilisé comme un organisme modèle fiable pour le développement des vertébrés. Son accessibilité et son incubation courte période le rend idéal pour l’expérimentation. Actuellement, l’étude de ces voies de développement de l’embryon de poulet est réalisée en appliquant des inhibiteurs et des médicaments à des sites localisés et à de faibles concentrations en utilisant une variété de méthodes. Culture de tissus in vitro est une technique qui permet l’étude des tissus séparés de l’organisme hôte, tout en contournant en même temps beaucoup de limitations physiques présentes lorsque vous travaillez avec des embryons entiers, tels que la susceptibilité des embryons doses élevées de produits chimiques potentiellement mortels. Nous présentons ici un organotypique cultivant protocole pour cultiver le poulet embryonnaire demi tête in vitro, qui présente de nouvelles opportunités pour l’examen des processus de développement au-delà des méthodes actuellement établies.

Introduction

L’embryonnaire poulet (Gallus gallus) est un organisme d’excellent modèle couramment utilisé dans le domaine de la biologie. Sa période d’incubation est d’environ 21 jours et beaucoup d’oeufs peut être incubés simultanément, rendant les expérimentation rapide et efficace. Peut-être plus important encore, l’embryon est également facilement manipulé, permettant l’étude approfondie des principaux processus de développement et des gènes et des protéines qui animent ces processus.

L’oeil de l’embryon de poulet est un organe complexe qui se développe par l’interaction d’un certain nombre de différents tissus semblables à beaucoup d’autres systèmes de corps. Cette méthode permet l’étude de l’évolution de ces tissus, en particulier à un stade avancé de développement. Par exemple, la rétine multicouche peut être particulièrement intéressante pour ceux qui étudient le développement du système nerveux. Des méthodes alternatives qui permettent l’étude des autres tissus de l’oeil comme la cornée, le corps vitréennes, la lentille, la sclérotique et les paupières sont bénéfiques pour les chercheurs. L’oeil embryonnaire de poulet contient également une série d’os plats, les osselets sclérales, qui peuvent servir de modèle pour l’étude des os intramembranaires induction et l’ossification en vertébrés¹.

Actuellement, il existe un certain nombre de méthodes utilisées pour étudier le développement embryonnaire. Microinjections d’anticorps inhibiteurs ou autres molécules inhibitrices de la^2,3, implanté chirurgicalement des microbilles imbibé d’inhibiteur⁴et électroporation⁵ sont toutes des méthodes pouvant servir à des gènes régulent ou protéines d’intérêt dans un embryon. Des méthodes similaires sont utilisés pour réguler positivement les protéines. Ces méthodes ne sont pas sans leurs limites. Par exemple, lors de l’utilisation de produits chimiques pour modifier le développement embryonnaire, l’effet létal sur l’embryon doit être évalué, et cela limite l’utilisation des méthodes susmentionnées pour les sites localisés d’application à des doses suffisamment bas pour assurer la survie de la embryon.

Culture de tissus in vitro a été utilisée dans un large éventail d’organismes pour étudier le développement et peut être utilisé pour contourner les limitations susmentionnées. Par exemple, les fémurs⁶et plume bourgeons^7,8branches⁹ du poulet ont tous étudiés à l’aide de tissus cultivant des méthodes, comme ont les testicules des souris¹⁰ et les racines et les tiges des plantes¹¹. Ces méthodes accordent aux scientifiques un degré élevé de contrôle sur le développement des tissus, comme la possibilité de varier la température et de modifier la disponibilité des nutriments. L’isolement des tissus de l’embryon entier rend également beaucoup moins sensibles à l’effet létal des produits chimiques, permettant ainsi à des études de manipulation à l’échelle mondiale à des concentrations plus élevées. Un autre avantage notable de la mise en culture in vitro est la préservation de l’environnement cellulaire du tissu ; l’arrangement des tissus reste relativement inchangée, ce qui permet d’étudier les interactions entre les différents tissus types⁹. Ainsi, in vitro culture ouvre portes supplémentaires expérimentale approches non disponible dans des modèles in vivo ou in ovo .

Actuellement, il est particulièrement difficile d’étudier l’évolution de le œil de poulet embryonnaire à l’aide de produits chimiques. Un certain nombre de membranes extra-embryonnaires couvre l’embryon, rendant difficile l’application de microbilles ou produits chimiques ; l’embryon est également très active dans l’oeuf comme elle vieillit, ce qui complique une méthode déjà difficile. Ce protocole permet un accès facile à le œil et des tissus entourant, en éliminant ces obstacles, tout en offrant de nouvelles possibilités d’examiner les processus de développement intérieur de le œil. Ce protocole a été créé pour étudier l’induction des osselets sclérales intérieur de l’oeil embryonnaire.

Protocole

Remarque : Pour les stades de l’embryon, utiliser le Hamburger et Hamilton¹² (HH) mise en scène de table.

1. embryon Incubation

1. Incuber les œufs de poule fécondés dans un incubateur stérile, contrôle de la température à 37 ° C ± 1 ° C et environ 40 % d’humidité.
2. Tournez les oeufs 1 x par jour et laisser incuber à HH34 (fécondation après 8 jours).

2. préparation et stérilisation du matériel

1. Pour 12 embryons, autoclave 2 L d’eau distillée, 1 L de solution saline à poussin 0,85 %, 12 pipettes en verre, 1 boîte de mouchoir en papier, 24 2,5 cm x 2,5 cm carrés de papier-filtre semi poreux et carrés de 24 2,5 cm x 2,5 cm de fil d’acier de maille avec les bords courbés vers le bas. Pour stériliser le matériel, autoclave à 121 ° C pendant au moins 15 min.
   Remarque : L’autoclavage des matériaux peut se faire à l’avance.
2. Stériliser l’incubateur avec l’éthanol à 70 % en l’essuyant les côtés et étagères porte. Placer 2 récipients en plastique contenant autoclavés distillée à l’intérieur de l’incubateur à conserver l’humidité. Préchauffer l’incubateur de culture à 37 ° C ± 1 ° C et environ 40 % d’humidité. S’assurer que l’incubateur est complètement noir ; Si la porte est transparente, couvrez-la de papier d’aluminium.
3. Réchauffer au préalable les 100 mL de milieu nutritif et 1 mL de pénicilline en les plaçant dans l’incubateur de culture.
4. Couvrir l’espace de travail avec du papier essuie-tout et stériliser le banc en vaporisant avec l’éthanol à 70 %. Stériliser 2 paires de pinces, ciseaux de dissection, une lame de rasoir et une cuillère en plastique avec l’éthanol à 70 % de la même manière.
5. Plats de Pétri stérile 100 mm lieu 12 et 24 boîtes de Pétri stériles 35 mm sur le banc pour utilisation. S’assurer que les plats restent dans un sachet stérile jusqu'à utilisation.

3. préparation de l’embryon

NOTE : Partir de là, porter un masque de protection poussière pour éviter de contaminer les cultures. Une infection bactérienne ou fongique va ruiner la culture, et il y a un risque de s’étendre rapidement à toutes les cultures dans l’incubateur.

1. Crack ouvrir le œuf et transférer l’embryon à un 100 mm boîte de Pétri contenant du sérum physiologique poussin à 0,85 %. Stade de l’embryon selon les caractéristiques anatomiques décrites dans le Hamburger et Hamilton, mise en scène de directives¹² et confirmer l’embryon est à HH34.
2. Couper le cou et puis coupent la tête de l’embryon à la ligne médiane à l’aide d’une lame de rasoir stérilisée. À l’aide d’une pince stérile, enlever le cerveau. Le bec laisse intacte.

4. culture Setup

1. 2 place de la Pétri de 35 mm à l’intérieur d’une boîte de Pétri 100 mm.
2. Placer un treillis en acier à l’intérieur de chaque boîte de Pétri 35 mm.
3. À l’aide de pinces, transférer 1 des têtes coupées à un morceau de papier filtre semi poreux de 2,5 cm x 2,5 cm avec le œil vers le haut. S’assurer que le tissu est sécurisé et ne glisse pas éteint en l’inclinant légèrement.
4. À l’aide de pinces, placer soigneusement les tissus de le œil et le filtre en papier sur le dessus de la maille de fil d’acier en 1 des boîtes de Pétri le 35 mm, créant une scène surélevée avec les tissus de le œil sur le dessus.
5. Répétez les étapes 4.3 et 4.4 avec l’autre moitié de tête.
6. À l’aide d’une pipette de verre stérile, ajouter avec précaution le milieu nutritif directement dans chaque boîte de Pétri 35 mm jusqu'à ce qu’il atteigne le niveau du papier-filtre. Ne pas immerger la moitié de la tête dans le milieu nutritif.
7. Ajouter 50 µL de 10 000 U/mL de pénicilline-streptomycine dans le milieu nutritif dans chaque boîte de Pétri.
8. Plier un morceau de papier de soie dans un petit carré et le placer à l’intérieur de la boîte de Pétri de 100 mm. Humidifier avec de l’eau distillée autoclavé.
9. Placez la boîte de Pétri dans l’incubateur stérile, sombre à 37 ° C ± 1 ° C et environ 40 % d’humidité pendant 4 jours.
10. Répétez les étapes 3 et 4 pour chaque embryon.
    Remarque : Le nombre d’embryons nécessaire dépendra de l’expérience spécifique ; Nous décrivons ici le protocole pour 12 embryons.

5. culture entretien

1. Une fois par jour, remplir les contenants de plastique dans l’incubateur avec l’eau distillée froide, stérilisés à l’autoclave.
2. Tous les jours, vérifier toutes les cultures pour des infections bactériennes ou fongiques. Cultures qui se sont désintégrées ou dans lequel le milieu a changé de couleur sont infectés. Jeter toutes les cultures qui sont infectés.

6. fixation

1. Après mise en culture, sortir tous les plats de l’incubateur.
2. À l’aide d’une paire de pinces, retirez délicatement le œil du papier filtre, prenant soin de ne pas pour déchirer le tissu.
3. Fixer le tissu oculaire dans 4 % de paraformaldéhyde dans 1 x tampon phosphate salin pendant la nuit à 4 ° C ou 10 % de formol tamponné neutre durant la nuit à température ambiante.
4. Stocker les tissus à 4 ° C en 1 x solution saline tamponnée au phosphate.

Résultats

En utilisant cette méthode, un oeil embryonnaire de poulet peut être cultivé de jour 8 de son développement (HH34) in vitro pendant 4 jours. Quatre jours de in ovo développement correspond à HH38.

Cette méthode de culture soutient le développement des bourgeons de plumes autour de le œil et des paupières (Figure 1 b). Ces bourgeons de plumes ne sont pas présents dans ovo à...

Discussion

Ce protocole utilise des tissus établie des techniques de culture pour atteindre la croissance d’un oeil de poulet embryonnaire jour 8 (HH34) in vitro pendant 4 jours. Cette méthode de mise en réseau-culture a été initialement décrite par Trowell¹⁵. Nous avons optimisé un protocole de Pinto et Hall 1991 étude¹⁶ utilisant une membrane semi poreuse avec le réseau pour étudier les signaux inductifs entre les couches de tissus séparés des yeux embryonnaires de poulet

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîtes de Pétri pour culture cellulaire de 35 mm	Corning	353001	facile à saisir, polystyrène, non pyrogène
Boîtes de Pétri pour culture cellulaire de 100 mm	de culture tissulaire Corning	353003, polystyrène, papier mouchoir en
papier	apyrogène Kimtech	34155	Essuie-glaces de la marque Kimtech Science, 280 par carton
treillis métallique	n/a	/a	treillis métallique en acier inoxydable (taille de la grille 0,7 mm)
pipettes en verre jetables	VWR	14673-010	Verre borosilicaté jetable 5 3/4"
milieu nutritif	Gibco	12591-038	Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine avec rouge de phénol (BGJB)
pénicilline-streptomycine	Sigma-Aldrich	P4458	10000 unités/mL pénicilline streptomycine solution filtre stabilisé
papier	Whatman	1454 090	papier filtre semi-poreux 90mm
œufs de poule fécondés	Dalhousie University Agricultural College	n/a	peut être obtenu auprès de fermes locales
chlorure de sodium (NaCl)	EMD	SX0420-3	cristaux de chlorure de sodium, qualité réactif
1 L bouteille en verre	VWR	89000-240	1 L bouteille en verre autoclavable en pyrex
éthanol	Fisher Scientific	BP82011	70 % de biologie moléculaire Récipients
tupperware	n/a	n/a n/a	achetés en magasin et stérilisés avec EtOH
lames de rasoir jetables	VWR	55411-050	lames de rasoir industriel à simple tranchant (acier au carbone chirurgical)
cuillères en plastique	n/a	n/a	achetées en magasin et stérilisées avec masque anti-poussière EtOH
	3M	n/a	3M 8500 Comfort Mask
paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	P6148	paraformaldéhyde, qualité réactif, formalin cristallin
tamponné neutre	Fisher Scientific	72210	10 %
tamponné salin (PBS)	n/a	n/a n/a	Saline tamponnée au phosphate 10X pH 7,4 (137mM NaCl, 2,5mM KCl, 4,3mM Na2HPO4, 1,4mM KH2PO4)
15 ml tubes faucon	VWR	21008-216	tubes à centrifuger préstérilisés
pince	FST	n/a	pince fine
sérum salin pour poussins  ;	n/a	n/a  ;	0,85 % de NaCl
papier d’aluminium	n/a	n/a
essuie-tout	n/a	/a	en magasin