Article de méthode

Monocellulaire Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction après Patch-clamp

DOI :

10.3791/57627

⸱

20 juin 2018

 ,  ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit les étapes critiques et les précautions nécessaires afin d’effectuer seule cellule transcription réverse multiplex PCR après patch clamp. Cette technique est une méthode simple et efficace pour analyser le profil d’expression d’un ensemble prédéterminé de gènes d’une cellule unique, caractérisé par des enregistrements de patch clamp.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cortex cérébral se compose de nombreux types de cellules présentant des caractéristiques morphologiques, physiologiques et moléculaires différents. Cette diversité entrave faciliter l’identification et la caractérisation de ces types de cellules, prérequis pour étudier leurs fonctions spécifiques. Cet article décrit le Protocole multiplex unicellulaire transcription réverse polymérase PCR (RT-PCR), qui permet de détecter simultanément l’expression de plusieurs dizaines de gènes dans une seule cellule, après enregistrement en tranches, patch clamp. Cette méthode simple peut être implémentée avec caractérisation morphologique et est largement applicable pour déterminer les caractéristiques phénotypiques de divers types de cellules et de leur environnement cellulaire particulière, comme dans les environs de vaisseaux sanguins. Le principe de ce protocole est d’enregistrer une cellule avec la technique de patch clamp, de récolter et d’inverser transcrire son contenu cytoplasmique, et de déceler qualitativement l’expression d’un ensemble prédéfini de gènes par multiplex PCR. Elle nécessite une conception soignée des amorces de PCR et intracellulaire patch-clamp de la solution compatible avec la RT-PCR. Afin d’assurer une transcription sélective et fiable detection, cette technique requiert également des contrôles appropriés de cytoplasme récolte aux étapes de l’amplification. Bien que nous discutées des précautions doivent être strictement respectées, pratiquement n’importe quel laboratoire électrophysiologique peut utiliser la cellule technique RT-PCR multiplexe.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cortex cérébral se compose de nombreux types de cellules impliquées dans divers processus physiologiques. Leur identification et leur caractérisation, une condition préalable à la compréhension de leurs fonctions spécifiques, peuvent être très difficiles étant donné la grande diversité morphologique, physiologique et moléculaire qui caractérise les cellules corticales types1 ,2,3,4.

Single-cell RT-PCR multiplex repose sur la combinaison de patch clamp et techniques de RT-PCR. Il peut sonder simultanément l’expression de plus de 30 gènes prédéfinis dans les cellules identifiées rhinophore5. L’inclusion d’un traceur neuronale dans la pipette d’enregistrement supplémentaires permet la caractérisation morphologique des cellules enregistrés après la révélation histochimiques6,7,8,9, 10. c’est une technique très utile pour la classification des types neurones basée sur une analyse multivariée de leurs caractères phénotypiques5,9,10,11,12 ,13,14. Monocellulaire de RT-PCR multiplex est également adapté à la caractérisation des cellules non neuronales comme les astrocytes15,16,17et peut être appliqué de manière pratiquement à chaque cerveau structure18, 19,20,21,22,23 et cellule de type, en supposant qu’ils peuvent être enregistrés dans la configuration de la cellule entière.

Cette technique est très pratique pour l’identification des sources cellulaires ou cibles de transmission systèmes7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, surtout quand les anticorps spécifiques font défaut. Il s’appuie sur des enregistrements de patch clamp de cellules identifiées visuellement29et donc permet également le ciblage des cellules dans un environnement cellulaire spécifique8,15,16. En outre puisque la cytoarchitecture du tissu cérébral est conservé dans des tranches de cerveau, cette approche permet également l’étude des relations anatomiques des cellules caractérisés avec éléments neuronaux et non neuronales7,8 , 18.

Puisque cette technique est limitée par la quantité de cytoplasme récolté et de l’efficacité de la RT, la détection des ARNm exprimée au nombre de copies basse peut être difficile. Bien que les autres approches basées sur la technologie RNaseq permettent d’analyser le transcriptome entière de cellules individuelles3,4,30,31, dont ils ont besoin les coûteux séquenceurs haut débit pas nécessairement disponible pour chaque laboratoire. Étant donné que la technique de RT-PCR multiplexe unicellulaire utilise PCR point final, il suffit de thermocycleurs largement disponibles. Il peut être facilement développé dans des laboratoires équipés avec des configurations électrophysiologiques et ne nécessite pas de matériel coûteux. Il peut fournir, dans la journée, une analyse qualitative de l’expression d’un ensemble prédéfini de gènes. Ainsi, cette approche offre un accès facile à la caractérisation moléculaire des cellules individuelles d’une manière rapide.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures expérimentales chez l’animal a eu lieu en stricte conformité avec les règlements Français (Code Rural R214/87 à R214/130) et sont conformes à l’éthique professionnelle de la Communauté économique européenne (86/609/CEE) et la Charte nationale Français sur l’éthique de l’expérimentation animale. Tous les protocoles ont été approuvés par le Comité d’éthique de Charles Darwin et soumis au Ministère Français de l’éducation et de la recherche (approbation 2015 061011367540). L’animalerie de couples est accrédité par les autorités Français (A75-05-24).

1 Considérations préliminaires

Remarque : Pour éviter les contaminations, conforme aux recommandations suivantes avant de cellule unique entreprise RT-PCR après patch clamp.

  1. Ne pas utiliser les plasmides contenant des gènes d’intérêt en laboratoire car ils sont une source potentielle de contamination.
  2. Réserver un banc de laboratoire de la chambre d’électrophorèse sur gel pour préparer les RFT.
  3. Dédiez un ensemble des pipettes et des pointes à filtre aérosols résistants à manipuler l’ADN et l’ARN à des concentrations inférieures à 1 ng/µL. Jamais les utiliser pour analyser les produits PCR.
  4. Toujours utiliser des produits exempts de RNase et de DNase et porter des gants.
  5. Utilisez dédiés produits chimiques pour la préparation des solutions internes patch clamp. Ne jamais utiliser une spatule mais plutôt un poids papier pour peser des poudres.
  6. Utiliser une électrode pH dédiés et solutions étalons de pH, car ils peuvent être une source de contamination (par exemple, RNase).
  7. Capillaires en verre de borosilicate magasin ; 20 conseils de longue, fine et souple µL ; une micropipette de 20 µL ; un expulseur artisanale (support pipette patch clamp attaché à une seringue de 10 mL) ; 500 µL PCR tubes ; 10 µL aérosol résistant aux bouts filtrants ; et mince des marqueurs permanents dans une zone dédiée (Figure 1).

2. amorces

Notez : RT-PCR Multiplex repose sur deux étapes de l’amplification. Au cours de la première PCR, tous les gènes d’intérêt sont conjointement amplifiés en mélangeant toutes les amorces PCR. Pour détecter de manière fiable les transcriptions de cellules individuelles, il est essentiel de concevoir des amorces PCR sélectives et efficaces. L’utilisation des amorces (internes) imbriqués pour le deuxième tour des PCR améliore la spécificité et l’efficacité de l’amplification.

  1. Récupérer les séquences d’ADN messagère organisée de gènes d’intérêt dans la base de séquences de référence NCBI32 ainsi que ceux de leur famille connexe (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
    1. Entrez le nom du ou les gènes et les espèces d’intérêt en tant que requête et cliquez sur la séquence pertinente récupérée.
    2. Pour limiter l’analyse à la séquence codante de la gène (s), cliquez sur Envoyer à (en haut à droite) et sélectionnez les séquences codantes et FASTA nucléotides comme format. Cliquez ensuite sur Créer un fichier et enregistrer la séquence FASTA utilisant une extension de fichier « .nt ».
  2. Utilisez MACAW logiciel33 (Construction d’alignement Multiple & Analysis Workbench) ou tout autre logiciel d’alignement multiple pour déterminer les régions d’homologie.
    1. Cliquez sur fichier de | Nouveau projet... et sélectionnez le type de séquence ADN . Pour importer les séquences de gène, sélectionnez séquence | Importer la séquence... et de charger un fichier « .nt ». Répétez l’opération pour toutes les séquences connexes.
    2. Cliquez et faites glisser toutes les séquences dans la fenêtre schématique pour sélectionner les séquences entières.
    3. Recherchez les régions d’homologie en sélectionnant alignement | Recherche de blocs... (CTRL + S). Sélectionnez la paire de Segment se chevauche dans la Méthode de recherche. Ajuster le Pairwise score seuil à une valeur relativement élevée (par exemple, 1 000) et la seqs. min. par bloc et le nombre total de séquences pour aligner et cliquez sur commencer.
    4. Dans la fenêtre de Résultat de la recherche qui apparaît, sélectionnez le résultat (s) par le plus haut score MP et cliquez sur le lien. Si aucun résultat n’est trouvé, diminuer la Pairwise score seuil et/ou la seqs. min. par bloc.
    5. Pour faciliter la visualisation des régions homologues, sélectionnez alignement | Ombrage | Score moyen.
    6. Sélectionner des parties non couplés des séquences et répétez les 2.2.3–2.2.4 étapes pour déterminer éventuellement les autres régions d’homologie avec une MP-note inférieure.
    7. Pour obtenir les amorces plus spécifiques, sélectionnez les régions où l’homologie de séquence le moins.
  3. Récupérer les séquences de tous les variants d’épissage et répétez les étapes 2.2.1–2.2.6. Sélectionner leurs régions communes pour une détection globale. Envisager d’autres cassettes pour épissure dédié variantes analyses20,34,35,36.
  4. Aligner les séquences d’ADN messagère sur le génome de modèle animal à l’aide de génomes de37 BLAST (base Local Alignment Search Tool) pour déterminer la structure de l’intron-exon des gènes (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. Sélectionnez le génome de souris BLAST en cliquant sur la souris et téléchargez la séquence FASTA récupérée dans la section de la Séquence requête entrée . Dans la Sélection des programmes, sélectionnez l’option optimiser pour des séquences très similaires (megablast), puis cliquez sur le bouton BLAST .
    2. Dans la section Description , sélectionnez l’alignement avec l’identité plus élevée (jusqu'à 100 %). S’assurer qu’elle correspond au gène d’intérêt comme il est indiqué dans les caractéristiques de la section des alignements .
    3. Trier l’alignement de la position de début de requête dans la même section pour obtenir la succession exons de la séquence codante. Notez les positions de début et de fin de toutes les réponses qui correspondent en gros à la position des introns sur la séquence requête (Figure 2 a).
  5. Sélectionnez deux exons différents pour les amorces sens et anti-sens de différencier facilement cDNA de génomique amplification de l’ADN (génomique) basée sur un critère de taille (Figure 2).
    Remarque : L’amplification de l’ADNg peut survenir à une fréquence faible lorsque le noyau est récolté avec le cytoplasme. Ainsi, il est essentiel de concevoir l’intron overspanning paires d’amorces (Figure 2 a). Dans le cas de gènes de l’intron-moins, la collection du noyau est problématique, car elle peut conduire à la confusion potentiellement les résultats. Pour résoudre ce problème, comprendre une série d’amorces visant à amplifier une séquence intronic pour détecter la présence de l’ADNg25. Si le contrôle de génomique est positif, les résultats de tous les gènes de l’intron-moins il faut éliminer.
  6. Pour obtenir une amplification efficace, sélectionnez amorces générant des amplicons d’une longueur idéalement comprise entre 200 et 400 paires de bases (Figure 2).
  7. Pour amplifier simultanément divers ADNc pendant l’étape PCR multiplexe, concevoir des amorces d’une longueur comprise entre 18 et 24 nucléotides et une température de fusion (Tm) entre 55 et 60 ° C.
  8. Pour minimiser la formation de structures secondaires, qui réduisent le rendement de l’amplification, sélectionnez sens et anti-sens amorces avec un minimum en épingle à cheveux et duplex longueurs (Figure 2 b).
  9. Concevoir des amorces internes en utilisant les mêmes critères (pas 2,5 à 2,8).
  10. Vérifier la spécificité des amorces PCR en alignant les amorces sur la base de séquence ARN de référence de l’organisme d’intérêt à l’aide d’un nucléotide BLAST.
    1. Dans BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), cliquez sur nucleotide BLAST. Coller la séquence d’un apprêt à la Séquence requête entrée.
    2. Dans la section Choisissez Rechercher ensemble , cliquez sur d’autres (nr etc.), sélectionnez les séquences d’ARN de référence (refseq_rna) dans l’option de base de données et spécifier l’organisme (p. ex., Mus musculus (taxid:10090) ) de restreindre l’analyse à l’espèce désirée.
    3. Dans la Sélection du programme sélectionnez optimiser des séquences assez semblables (blastn). Dans la section paramètres de l’algorithme , réduire la taille du mot jusqu'à 7 pour augmenter les chances d’obtenir des hits.
  11. Pour concevoir des amorces sélectives, garder seulement ceux dont la séquence est au moins 3 désadaptation avec des ADNc indésirables lorsque cela est possible.
  12. Commander des amorces de morue dessalées à une concentration relativement élevée (par exemple, 200 µM) pour s’assurer que tous les apprêts externes peuvent être mélangés à une concentration finale de 1 µM.

3. préparation des réactifs de RT

  1. 5 x RT-mix : préparer dans de l’eau exempte de RNase 400 µL de solution de mélange de RT (x 5) contenant des amorces aléatoires à 25 µM et dNTPs à 2,5 mM de chaque travail. Conserver ce mélange de travail 20 µL d’extraits dans des tubes de 500 µL.
  2. 20 x le dithiothréitol (DTT) : préparer 1 mL de 0,2 M TNT en RNase-libre de l’eau et stocker en tant que 50 µL d’extraits.
  3. Store 2 500 U d’inhibiteur de RNase (40 U/µL) et 10 000 U de la transcriptase inverse (RTase, 200 U/µL) comme 5 µL d’extraits.
  4. Afin d’assurer une qualité optimale, les réactifs de RT, stocker les aliquotes à-80 ° C. Utilisez-les pour jusqu'à 10 cellules et seulement pour un jour.

4. PCR Validation

  1. Préparer des ADNc en faisant une transcription renversée sur une quantité relativement importante de l’ARN (typiquement 1 µg) extrait total38 de la structure d’intérêt.
    1. Ne pas utiliser les pipettes dédiées pour single cell RT-PCR pour ces étapes préliminaires, mais utiliser les pipettes de la RNase-libre. Diluer l’ARN total à 1 µg/µL.
    2. Dans un tube de PCR 500 µL, ajouter 1 µL d’ARN total dilué et 8 µL d’eau exempte de RNase. Dénaturation à 95 ° C pendant 1 min et refroidir le tube sur la glace.
    3. Ajouter 4 µL de tampon de 5 x RT fournie par le fabricant, 4 µL de solution de mélange de RT, 1 µL de RTase, 1 µL d’inhibiteur de RNase et 1 µL de 200 mM TNT (voir Section 3).
    4. Glissement du tube, le tourner et incuber une nuit à 37 ° C.
    5. Stocker les ADNc à-80 ° C pendant jusqu'à plusieurs années. Préparer une partie aliquote d’ADNc diluées à 1 ng/µL d’équivalents d’ARN totales.
  2. Mélanger et diluer chaque paire d’amorces à 1 µM avec les pipettes dédiés à cellule unique RT-PCR. Utilisez 20 µL de chaque mélange amorces pour 100 µL PCRs.
  3. Sur la glace, préparer pour chaque paire d’amorce un prémélange contenant : eau (q.s., 80 µL), 10 µL de 10 X tampon 1 µL de 100 x dNTPs (50 µM chacun), 500 – 1 000 pg de l’ADNc dilué à 1 ng/µL et 0,5 µL (2,5 U, 5 U/µL) de la Taq polymérase.
  4. Utiliser des tubes PCR qui correspondent étroitement à des puits de la machine PCR pour un contrôle optimal de la température. Verser 2 gouttes (~ 100 µL) d’huile minérale dans le prémélange sans toucher le mur ou le bouchon du tube PCR.
  5. Pour minimiser la formation de dimères-apprêt, effectuez un démarrage à chaud en plaçant les tubes PCR dans le thermocycleur préchauffé à 95 ° C. Après 30 s, expulser rapidement 20 µL du mélange primer sur le dessus de l’huile.
  6. Après 3 min à 95 ° C, effectuez des cycles de 40 (95 ° C, 30 s, 60 ° C, 30 s ; 72 ° C, 35 s) suivie d’une étape d’élongation finale à 72 ° C pendant 5 min.
  7. Analyser les 10 µL de chaque produits PCR en gel d’agarose gel électrophorèse (2 %, poids/volume)39. Si certains produits PCR n’ont pas la taille attendue, re-conception autres amorces (voir Section 2).
    ATTENTION : Le bromure d’éthidium est un produit chimique intercalant qui peut induire des mutations de l’ADN. Consulter le Bureau de la sécurité locale avant de l’utiliser. Toujours porter des gants pour manipuler. Utilisez une solution de la solution (10 mg/mL) du bromure d’éthidium au lieu de la poudre pour minimiser le risque d’inhalation. De même, lumière UV peut être nocive, alors assurez-vous de porter des lunettes de protection UV protection ou un masque. Retirer les gels souillés, conseils, gants et tampon en conteneurs dédiés aux déchets d’éthidium.
  8. Une fois que toutes les paires d’amorces ont été validés individuellement, tester le Protocole multiplex (Figure 3).
    1. Mélanger et diluer tous les apprêts externes ensemble à 1 µM. entreposer les amorces multiplexes mélangent à-20 ° C pendant jusqu'à plusieurs semaines.
    2. Sur la glace, préparer un prémélange contenant : eau (q.s., 80 µL), 10 µL de 10 X tampon, 1 µL de 100 x dNTPs (50 µM de chacun), 500 – 1 000 pg d’ADNc dilués à 1 ng/µL et 0,5 µL (2,5 U, 5 U/µL) de la Taq polymérase.
    3. Glissement du tube PCR, tourner et ajouter deux gouttes (~ 100 µL) d’huile minérale.
    4. Effectuer un démarrage à chaud comme indiqué au point 4.5 avec 20 µL du mélange amorces multiplex. Après 3 min à 95 ° C, exécutez 20 cycles PCR identiques à celles de l’étape 4.6.
    5. Préparer un certain nombre de tubes PCR identiques au nombre de gènes à analyser. Préparer un prémélange comme étape 4.8.2, mais à l’aide de 1 µL du premier produit PCR par gène en tant que modèle. Ajuster tous les volumes selon le nombre de gènes à analyser et à envisager d’utiliser 10 % de volume supplémentaire pour compenser les erreurs de pipetage.
    6. Remuez délicatement, faites tourner le tube, envoyer 80 µL de prémélange dans chaque tube PCR et ajouter deux gouttes (~ 100 µL) d’huile minérale par tube sans toucher le mur ou au plafond des tubes.
    7. Effectuer un chaud commencer (voir étape 4.5) en expulsant 20 µL du mélange amorces internes préparées à l’étape 4.2. Effectuez des cycles PCR 35 identique à étape 4.6.
    8. Analyser les deuxième produits PCR par électrophorèse sur gel d’agarose. Assurez-vous que chaque deuxième PCR génère un amplicon de la taille attendue. Dans le cas des amplifications inefficaces ou non spécifiques, re-conception de nouvelles amorces (étapes 2.5 – 2.12) et les validera (étapes 4.2 – 4,8).

5. préparation et Validation de la Solution de Patch-clamp intracellulaire

Remarque : Le protocole suivant décrit la préparation et validation d’un /gluconate K+basés sur la solution interne, mais pratiquement n’importe quel type de patch-clamp de la solution peut être utilisé tant qu’il ne fasse pas obstacle à l’efficacité de la RT-PCR. Port de gants est obligatoire pour l’obtention d’une solution interne sans RNase.

  1. Pour 60 mL de solution d’enregistrement interne patch-clamp, préparer extemporanément 10 mL de 0,1 M KOH.
  2. Dissoudre 11,4 mg de EGTA (finale de 0,5 mM) à 0,9 mL de 0,1 M KOH.
  3. Ajouter 40 mL de RNase-libre d’eau et dissoudre 2,02 g de K-gluconate (144 mM final), 143 mg de HEPES (10 mM final) et 180 µL de 1 M du MgCl2 (3 mM final).
  4. Ajuster le pH à 7,2 en ajoutant environ 6 mL de 0,1 M KOH.
  5. Ajuster l’osmolarité à 295 mOsm ~ 13 ml d’eau exempte de RNase.
  6. Puisque la solution interne est également utilisée comme un tampon pour la transcriptase inverse, contrôler soigneusement la concentration de Mg2 + . Compenser une concentration plus faible Mg2 + dans la solution interne en ajoutant du MgCl2 par la suite pour atteindre une concentration finale de 2 mM dans la réaction de RT.
  7. Pour spécifier que la cellule récoltée après enregistrement patch clamp, ajouter 2 à 5 mg/mL de la biocytine RNase-libre à la solution interne décrite ci-dessus (étapes 5.1 – 5,5).
  8. Filtrer (0,22 µm taille de pore) la solution interne et conserver à-80 ° C sous le nom de 100 – 250 µL d’extraits.
  9. Pour valider l’utilisation de la solution interne pour single-cell RT-PCR, ajouter 0,5 µL d’ARN total dilué à 1 ng/µL à 6 µL de solution de patch clamp et laisser sur le banc pendant environ 30 min.
  10. Avec une micropipette 2 µL, ajouter 2 µL de 5 x RT-mix, 0,5 µL du DDT x 20, inhibiteur de RNase 0,5 µL et 0,5 µL RTase et incuber une nuit à 37 ° C.
  11. Tourner le tube. Sur la glace ajouter de l’eau (q.s., 80 µL), 10 µL de 10 X tampon et 0,5 µL (2,5 U, 5 U/µL) de la Taq polymérase.
  12. Effectuer 40 cycles de PCR à l’aide d’une série d’amorces validés (étapes de 4,4 à 4,6).
  13. Analyser les produits PCR par électrophorèse sur gel d’agarose (voir étape 4.7) et vérifier qu’ils ont la taille attendue.
    Remarque : En omettant les 0,5 µL d’ARN total et son remplacement par l’eau sans RNase 0,5 µL veillera à ce que la solution interne est exempte de contaminations RNA et/ou de l’ADN.

6. préparation de tranches aiguë

Remarque : Ce protocole décrit la procédure de tranchage pour mineur (c'est-à-diremoins de 28 jours après la naissance) souris mâles et femelles. Autres solutions de découpe, comme base de saccharose artificiel liquide céphalo-rachidien (FSCA) sont également utilisables40.

  1. Préparer 2 L de FSCA contenant (en mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 Glucose et saccharose 15. Pour réduire l’activité glutamatergique au cours de la préparation de tranches, préparer une solution de découpe en ajoutant 1 mM d’acide kynurénique.
  2. Avant de trancher, préparer une trousse de dissection contenant ciseaux iris fine, deux spatules, pinces, ciseaux chirurgicaux, un disque de papier filtre et colle cyanoacrylate.
  3. Utilisez coupe glacée solution saturée d’O2/co2 (95/5 %) et le refroidissement de la chambre de coupe à-20 ° C.
  4. Anesthésier la souris avec un petit papier essuie-tout imbibé d’isoflurane. Après environ 2 min, assurez-vous que la souris est sous anesthésie profonde en vérifiant l’absence de réponse à la patte de pincement.
  5. Rapidement décapiter la souris. Enlever le cuir chevelu et ouvrir le crâne. Extraire le cerveau avec soin et le placer dans un petit bécher rempli d’une solution coupe glacée (~ 4 ° C) oxygénée avec O2/co2.
  6. Enlever la chambre de coupe des conditions de-20 ° C et l’humidité avec une serviette en papier.
  7. Soigneusement disséquer le cerveau pour isoler la zone d’intérêt, collez-la sur la chambre de coupe et ajouter la coupe glacée solution oxygénée avec O2/co2.
  8. Couper des tranches épaisses de 300 µm en utilisant un vibratome. Transférez-les dans une chambre de repos remplie de solution de découpe oxygéné à température ambiante et leur permettre de récupérer pendant au moins 0,5 h.

7. seule cellule RT-PCR après enregistrement Patch-clamp

  1. Le système de perfusion régulièrement avec ~ 100 mL de solution de 30 % H2O2 et rincer abondamment avec de ~ 500 mL d’eau distillée pour éviter la croissance de bactéries, comme c’est une source de contamination de la RNase.
  2. La chloration du filament avec une pipette de patch remplie d’eau de Javel concentré chaque jour de récolte. Ne pas utiliser une micropipette pour remplir la pipette mais plutôt un 20 µL longue, fine et souple embout attaché à une seringue de 1 mL. Ensuite, rincer abondamment à l’eau libre de RNase et séchez-le avec un chiffon de gaz.
  3. Préparer une petite boîte de glace contenant 5 x RT-mix et 20 x DTT aliquotes. Stocker les aliquotes inhibiteur RTase et RNase à-20 ° C dans un refroidisseur de benchtop.
  4. Transférer une tranche dans la chambre d’enregistrement perfusée à 1 à 2 mL/min avec FSCA oxygéné.
  5. Tirez les pipettes de patch (1 à 2 µm ouvrir le diamètre de bout, MΩ de 3 – 5) en verre borosilicate avec des gants et remplir l’un d’eux avec 8 μL de solution interne. N’oubliez pas que les boutons de l’extracteur de pipette sont une source de contamination de la RNase.
  6. Placez la pipette dans le porte-pipette tout en portant des gants neufs et ne touche ne pas le filament avec les doigts.
  7. Approcher la pipette avec une pression positive et effectuer l’enregistrement de cellules entières afin de caractériser les cellules ciblées (Figure 4).
  8. Afin de préserver les ARNm, limiter le temps en configuration cellule entière à 20 min41.
  9. À la fin de l’enregistrement, préparer un tube PCR de 500 µL rempli avec 2 µL de 5 x RT Mix et 0,5 µL de 20 x DTT, pivoter et placez-le sur la glace.
  10. Récolter le cytoplasme de la cellule en appliquant une légère pression négative (Figure 4). Contrôle visuellement que le contenu de la cellule comprend à l’intérieur de la pipette tout en conservant une bonne étanchéité.
    1. Éviter autant que possible, recueillir le noyau si certains gènes d’intron-moins sont considérés. Dans ce cas toujours inclure une série d’amorces visant à amplifier l’ADNg pour détecter la contamination génomique.
    2. Si le noyau est venue près de la pointe de la pipette, relâcher la pression négative et placer la pipette loin du noyau. S’assurer que le joint étanche est préservé et redémarrer pour collecter le cytoplasme dans le nouvel emplacement de la pipette.
  11. Arrêter la récolte lorsque aucun matériau plus n’est à venir et/ou avant de perdre le joint étanche.
  12. Retirer la pipette doucement pour former un patch extérieur-out de limiter la contamination par les débris extracellulaire (Figure 4) et de favoriser la fermeture de la membrane cellulaire pour des analyses histochimiques subséquentes.
  13. Gardez à l’esprit que les boutons, micromanipulateurs, clavier d’ordinateur, ou la souris d’ordinateur sont des sources potentielles de contamination de la RNase. Si ils ont été touchés lors de l’enregistrement, les changer.
  14. Attacher la pipette à l’expeller et expulser son contenu dans le tube PCR en appliquant une pression positive (Figure 1).
  15. Casser l’embout de la pipette dans le tube PCR pour aider à la collection de son contenu.
  16. Brièvement Centrifuger le tube, ajouter 0,5 µL d’inhibiteur de RNase et 0,5 µL de RTase, mélanger doucement, centrifuger à nouveau et incuber une nuit à 37 ° C.
  17. Tourner le tube et le stocker à-80 ° C pendant plusieurs mois jusqu'à l’analyse PCR.
  18. Effectuer la première étape d’amplification directement dans le tube contenant le ~ 10 µL de produits RT en ajoutant de l’eau (q.s., 80 µL), 10 µL de tampon de x 10 et 0,5 µL (2,5 U) de la Taq polymérase. Ensuite, suivez les instructions décrites dans la procédure 4.8.2–4.8.8.

8. coloration histochimique de la cellule enregistrée (en option)

  1. Après les enregistrements électrophysiologiques, maintenir la tranche de 20 min en oxygéné FSCA pour permettre la diffusion de la biocytine dans l’arborescence axonal et dendritique.
  2. Placer la tranche dans un puits d’une plaque 24 puits et fix il nuit à 4 ° C avec 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % à 0,1 M tampon Phosphate.
  3. Laver les tranches 4 fois, 5 min chacun, avec 1 mL de Phosphate Buffered Saline (PBS).
  4. Dans le même bien, permeabilize et saturer la tranche pendant 1 h à température ambiante avec 1 mL de PBS additionné de gélatine de X-100 et de 0,2 % de Triton 0,25 % de peau de poisson d’eau froide (PBS-GT).
  5. Incuber pendant la nuit avec une avidine fluorescent étiqueté diluée au 1/400 à 250 – 500 µL de PBS-GT.
  6. Laver 5 fois, 5 min chacun, avec 1 mL de PBS et monter les tranches.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une validation représentative de RT-PCR multiplex est illustrée à la Figure 3. Le protocole a été conçu pour sonder simultanément l’expression des gènes différents 12. Le vGluT1 du transporteur vésiculaire glutamate a été pris comme un témoin positif de neurones glutamatergiques42. Le GABA de synthèse des enzymes (GAD65 et GAD 67), Neuropeptide Y (NPY) et la somatostatine (SOM) ont été utilisés comme marqueurs de GABAergique interneuro...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Single cell RT-PCR multiplex après que patch clamp peut sonder, simultanément et de manière fiable, l’expression de plus de 30 gènes dans les cellules identifiées rhinophore5. Analyse de l’expression des gènes au niveau de la cellule unique nécessite des amorces PCR hautement efficaces. Une des étapes plus limitants est la collection de contenu de la cellule. Son efficacité dépend du diamètre de l’embout de la pipette de patch, qui doit être aussi large que possible tout en correspondant à la tail...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Dr Alexandre Mourot pour ses commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 01 003 ; ANR-15-CE16-0010 et ANR-17-CE37-0010-03), BLG est pris en charge par la bourse de la Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Nous remercions l’animalerie de le couples (Paris, France).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
MACAW v.2.0.5NCBIAlignement multiple pour la conception d’amorces
DithiothreitolVWR443852A
RT Amorces aléatoiresSigma-Aldrich (Merck)11034731001RT
dNTPsGE Healthcare Life Sciences28-4065-52RT et PCR
RNasin Inhibiteurs de ribonucléasePromegaN2511RT
SuperScript II Transcriptase inverseInvitrogen18064014RT
Taq ADN polyméraseQiagen201205PCR
Huile minéraleSigma-Aldrich (Merck)M5904-5MLPCR
Amorces PCRSigma-Aldrich (Merck)PCR / dessalées et diluées à 200 µ ; Tubes M
, 0,5 mL, bouchon platThermoFisher ScientificAB0350RT et PCR
BT10 Series - 10 & micro ; L Filtre TipNeptune ScientificBT10RT et PCR
BT20 Series - 20 & micro ; L Pointe de filtreNeptune ScientificBT20RT et PCR
BT200 Series - 200 & micro ; L Pointe FiltranteNeptune ScientificBT200RT et PCR
BT1000 Series - 1000 & micro ; L Filtre TipNeptuneScientific BT1000.96RT et PCR
DNA Thermal CylcerPerkin Elmer Cetus
PCR Bromure d’éthidiumSigma-Aldrich (Merck)E1510-10MLÉlectrophorèse sur gel d’agarose
Tampon Tris-Borate-EDTASigma-Aldrich (Merck)T4415-1LÉlectrophorèse sur gel d’agarose
UltraPure AgaroseTechnologies16500-500Électrophorèse sur gel d’agarose
et Phi ; X174 DNA-Hae III DigestNEB (New England BioLabs)N3026SÉlectrophorèse sur gel
d’agarose EDA 290KodakÉlectrophorèse sur gel d’agarose
Électrophorèse Alimentation EPS 3500Pharmacia BiotechÉlectrophorèse sur gel d’agarose
Unité d’électrophorèse horizontale Midi Modèle SHU13Sigma-Aldrich (Merck)Électrophorèse
sur gel d’agarosePapier lisse à l’aspect satinéFisherbrand1748BPatch clamp solution interne
Potassium HydroxydeSigma-Aldrich (Merck)60377Patch clamp solution interne
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime ;,N&prime ;-acide tétraacétiqueSigma-Aldrich (Merck)E3889Patch clamp solution interne
HEPESSigma-Aldrich (Merck)H4034Patch clamp solution interne
D-gluconate de potassiumSigma-Aldrich (Merck)G4500Solution interne patch clamp
Solution de chlorurede magnésium Sigma-Aldrich (Merck)M1028Solution interne patch clamp
5500 Osmomètre à pression de vapeurWescorSolution interne
patch clamp BiocytinSigma-Aldrich (Merck)B4261Patch clamp solution interne
SaccharoseSigma-Aldrich (Merck)S5016Préparation des tranches
D-(+)-Glucose monohydratéSigma-Aldrich (Merck)49159Préparation des tranches
Chlorure de sodiumSigma-Aldrich (Merck)S6191Préparation des tranches
Chlorure de potassiumSigma-Aldrich (Merck)60128Préparation des tranches
Bicarbonatede sodium Sigma-Aldrich (Merck)31437-MPréparation des tranches
Phosphate de sodium monobasiqueSigma-Aldrich (Merck)S5011Préparation des tranches
Solution de chlorurede magnésium Sigma-Aldrich (Merck)63069Préparation des tranches
Solution de chlorure de calciumSigma-Aldrich (Merck)21115Préparation
Acide kynuréniqueSigma-Aldrich (Merck)K3375Préparation des tranches
IsofluranePiramal Healthcare UKPréparation des tranches
VT 1000SLeica Biosystems14047235613Préparation
des tranches Solution de peroxyde d’hydrogèneSigma-Aldrich (Merck)H1009Nettoyage de la configuration des pinces Capillaires
verre à paroi mince avec filamentWorld Precision InstrumentsTW150F-4Patch Clamp
PP-83NarishigePatch
Clamp Eppendorf MicroloaderEppendorf5242956003
Patch Clamp BX51WI Microscope droitOlympusPatch Clamp
XC-ST70/CE CCD N/B CAMÉRA VIDÉOSonyPatch Clamp
Axopatch 200B AmplificateurMolecular DevicesPatch Clamp
Digidata 1440Molecular DevicesPatch Clamp
pCLAMP 10 suite logicielleMolecular DevicesPatch Clamp
10 mL seringueTerumoSS-10ESExpelling
E Series avec corps droit (support)Phymep64-0997Expulser
Phosphate de sodium dibasiqueSigma-Aldrich (Merck)S7907Révélation histochimique
Phosphate de sodium monobasiqueSigma-Aldrich (Merck)S8282Révélation histochimique
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich (Merck)P6148Révélation histochimique
Triton X-100Sigma-Aldrich (Merck)X100Révélation histochimique
Gélatine de peaude poisson d’eau froideSigma-Aldrich (Merck)G7041Révélation histochimique
Streptavidine, Alexa Fluor 488 conjuguéThermoFisher ScientificS11223Révélation histochimique
Plaque 24 puitsGreiner Bio-One662160Révélation histochimique
Life des tranches en

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
  3. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
  4. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
  5. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
  6. Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
  7. Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
  8. Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
  9. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
  10. Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  11. Karagiannis, A., et al. Classification of NPY-expressing neocortical interneurons. J.Neurosci. 29 (11), 3642-3659 (2009).
  12. Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B. Beyond the frontiers of neuronal types. Front Neural Circuits. 7, 13(2013).
  13. Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
  14. Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
  15. Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
  16. Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
  17. Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
  18. Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
  19. Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
  20. Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
  21. Gallopin, T., et al. Identification of sleep-promoting neurons in vitro. Nature. 404 (6781), 992-995 (2000).
  22. Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
  23. Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
  24. Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
  25. Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
  26. Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
  27. Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
  28. Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
  29. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  30. Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
  31. Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
  32. O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
  33. Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
  34. Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
  35. Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
  36. Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
  37. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  38. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  39. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
  40. Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
  41. Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
  42. Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
  43. Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
  44. Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
  45. McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
  46. Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
  47. Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
  48. Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
  49. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
  50. Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
  51. Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
  52. Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
  53. Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
  54. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  55. Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
  56. Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
  57. Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
  58. Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
  59. Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
  60. Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
  61. Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
  62. Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
  63. Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
  64. Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
  65. Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
  66. Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

RT PCR sur cellule uniqueenregistrement par patch clampPCR multiplexer colte du cytoplasmeanalyse de l expression g niquePCR Hot Startlectrophor se sur gel d agarosepr paration de coupes c r bralesenregistrement lectrophysiologique

Articles connexes