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Article de méthode

Autoportant montage électrochimique pour enrichir les bactéries Anode-respirants sur place

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DOI :

10.3791/57632

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24 juillet 2018

 ,  ,  , 
1International Center for Materials Nanoarchitectonics, National Institute for Materials Science, 2Department of Earth Sciences, University of Southern California, 3Department of Applied Chemistry, The University of Tokyo

Dans cet article

Résumé

Sur le site microbienne enrichissement ou in situ des techniques culturales peuvent faciliter l’isolement de difficile-à-culture microbiennes taxons, surtout des milieux de faible biomasse ou géochimique extrême. Nous décrivons ici un montage électrochimique sans utiliser de source d’alimentation externe pour enrichir des souches microbiennes capables de transport d’électrons extracellulaire (EET).

Résumé

Respiration anaérobie couplée avec le transport des électrons à des minéraux insolubles (dénommé extracellulaire transport d’électrons [EET]) est considérée comme critique pour la production d’énergie microbienne et la persistance dans de nombreux environnements souterrains, en particulier ceux manque d’accepteurs d’électrons terminal soluble. Alors que les microbes EET compatibles ont été avec succès isolés provenant de divers milieux, la diversité des bactéries capables de EET est encore mal compris, surtout en difficile à l’échantillon, basse énergie ou des environnements extrêmes, comme bon nombre de sous-sol écosystèmes. Nous décrivons ici un système électrochimique sur place afin d’enrichir les bactéries EET-capable, en utilisant une anode comme accepteur terminal d’électron respiratoire. Cette anode est reliée à une cathode capable de catalyser la réduction de l’oxygène abiotiques. En comparant cette approche avec des méthodes d’electrocultivation qui utilisent un potentiostat pour car le potentiel de l’électrode, le système de deux électrodes ne nécessite pas de source d’alimentation externe. Nous présentons un exemple de notre enrichissement sur le site utilisé dans un étang alcalin aux Cèdres, un site de serpentinisation terrestres dans le nord de la Californie. Tentatives préalables de cultiver les bactéries réductrices minéraux ont échoué, ce qui est probablement dû à la nature de faible biomasse de ce site et/ou l’abondance relative faible de métal réduisant les microbes. Avant d’implémenter notre enrichissement de deux électrodes, nous avons mesuré le profil vertical de la concentration d’oxygène dissous. Ceci nous a permis de placer le carbone ressenti anode et plaqué de platine carbone estimaient processus cathodiques à des profondeurs qui appuieraient aérobie et anaérobie, respectivement. Après l’incubation sur place, nous avons enrichi l’électrode anodique en laboratoire et a confirmé une communauté microbienne distincte par rapport à la surface-jointe ou communautés de biofilm normalement observées aux Cèdres. Cet enrichissement a par la suite conduit à l’isolement du premier microbe électrogénique de cèdres. Cette méthode d’enrichissement microbienne sur place a le potentiel d’améliorer considérablement l’isolement de bactéries EET capable de biomasse faible ou difficile aux habitats de l’échantillon.

Introduction

Plusieurs microbes réduction minérale ont démontré d’utiliser les minéraux en phase solide comme accepteur terminal d’électron, par des processus de transport des électrons extracellulaire (EET) qui effectuent des électrons à l’extérieur de la cellule par l’intermédiaire d’enzymes redox1. EET est essentielle, non seulement pour le microbe-minéral mais aussi l’énergie appliquée technologies et procédés environnementaux, tels que les piles à combustible microbiennes2, électrode synthèse3et4de la biorestauration. Nouvelles bactéries EET compatibles sont très recherchés et ont été largement étudiées d’un point de vue fondamentale ou appliquée5. Cependant, nous avons seulement limité aperçu de l’importance écologique ou biogéochimique de ces bactéries. La plupart des microbes EET compatibles ont été isolée après enrichissement d’aqua, sédiments ou des digesteurs anaérobies à l’aide des accepteurs d’électrons solides tels que MnO2, Fe2O3 ou électrodes prêtes en laboratoire6, 7 , 8. Toutefois, ces méthodes produisent souvent des consortiums similaires et potentiellement rater des taxons plus sensibles qui peuvent dominer à faible consommation d’énergie ou de systèmes de faible biomasse, polarisation de la capacité de ces microbes à s’adapter à la lab ou culture axénique environnement9 . Habituellement pour les environnements de faible biomasse, les grandes quantités d’eau provenant d’un site sont filtrées pour concentrer les cellules bactériennes. Cependant, EET-capable bactéries présentent souvent des métabolismes anaérobies et donc exposition oxygène peut également inhiber ou empêcher leur culture. Autres méthodes sur place à concentrer les cellules sans les exposer à l’oxygène pourraient faciliter l’isolement des bactéries EET-capable. Nous rapportons ici les détails de paramétrage concernant une technique électrochimique sur place afin d’enrichir le microbe EET-capable sur une longue période de temps sans la nécessité d’une source d’alimentation externe.

À l’aide de nos expériences d’electrocultivation provenant d’une source hautement alcaline en Californie du Nord, les cèdres10, les auteurs décrivent cette technique électrochimique sur place. La géochimie des ressorts à The Cedars sont affectées par la serpentinisation dans le sous-sol. Les ressorts sont très réductrices, avec la concentration d’oxygène inférieure à la limite de détection sous l’interface de l’eau air mettant en évidence le potentiel de production d’énergie microbienne par EET dans cet environnement anoxique fonctionnellement11. Cependant, il n’y a aucune preuve pour étayer les microbes EET capable des Cèdres (dans les ARNr 16 s ou analyse métagénomique). Même si cet environnement a été caractérisé comme accepteur d’électrons limitée, la possibilité d’utiliser les minéraux insolubles comme accepteurs d’électrons terminal, y compris les minéraux comme le fer, découvrant des minéraux qui résultent de la serpentinisation (c.-à-d., magnétite), n’a pas été intensivement étudié12. Nous avons, par conséquent, déployé notre système électrochimique au camping ressort, un pH élevé aux Cèdres, d’enrichir à EET capable de microbes (Figure1)13.

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Protocole

1. construction d’un système de deux électrodes pour l’Incubation environnementale

  1. Préparation de la matière de l’anode et le traitement du carbone sentaient électrode (Figure 2).
    1. Couper le carbone estimé à dimensions égales selon l’enrichissement désiré de la biomasse. Tremper chaque électrode dans l’éthanol à 90 % pendant 30 min, puis rincer au moins 8 fois avec de l’eau désionisée, sonification pendant 1 min après chaque rinçage.
    2. Laver les électrodes deux fois en 1 M HCl, en remuant pendant au moins 12 h pour chaque lavage.
    3. Sécher les électrodes dans un four tiède (37 ° C) pendant 6 à 12 heures ou jusqu'à ce que libre de liquide.
    4. Fixer les électrodes au fil de titane avec de l’epoxy graphite selon le protocole du fabricant sur une plaque de polytétrafluoroéthylène (surface anti-adhésive).
      NOTE : Nous avons utilisé un fil de titane en raison de sa grande tolérance à la corrosion aérobie.
    5. Faire cuire l’électrode à 120 ° C pendant 6 h.
    6. Tester la résistance entre le fil de titane et carbone de feutre avec un ohmmètre et confirmer que la résistance entre le fil et les électrodes de feutre est inférieure à 5 ohms.
  2. Electroplation de platine sur le carbone sentait destinée à la préparation de l’ouvrage de cathode
    1. Immerger les électrodes feutre carbone, préparés à l’étape 1.1, en 2 M KOH pour un minimum de 12 h dans un récipient en verre.
    2. Pour le nettoyage électrochimique, placer l’électrode comme travail électrode (WE) dans un réacteur à trois électrodes, qui accueille également une référence (RE) et une contre-électrode (EC). Se connecter à nous, RE et CE pour le potentiostat par pinces crocodile. Vérifiez toutes les connexions avec un ohmmètre.
      NOTE : Nous avons utilisé une Ag/AgCl (KCl saturé) électrode et une platine fil comme RE et CE, respectivement.
    3. Poise l’électrode à 1,0 V vs. AG/AgCl pour 600 s dans une solution électrolytique contenant 2 M KOH (en utilisant une quantité suffisante pour immerger l’électrode entier). Sortez de l’électrode du réacteur électrochimique (ce qui est fait de verre). Rincez l’électrode dans l’eau désionisée au moins 8 fois, sonification pendant 1 min après chaque rinçage. Électrodes sèches à 100 ° C pendant au moins 12 h.
    4. Pour préparer la solution de placage, ajouter 100 g d’acide citrique, 5 g de sulfate de sodium et 2 g de dihydrogène hexahydraté de diammonium (IV) pour 1 L d’acide sulfurique 2 M.
    5. Pesée nettoyé et séché les électrodes préparée comme suit 1.2.1–1.2.2 puis couvre l’électrode dans une solution de placage, tel qu’établi à l’étape 1.2.3. Laisser agir l’électrode dans la solution de placage trois fois pendant 30 s de chaque.
    6. Plaquer les électrodes par car le potentiel de l’électrode à -0,2 V vs Ag/AgCl pour 460 s dans solution de placage. Rincer les électrodes deux fois dans l’eau désionisée et jeter les déchets de platine.
    7. Rincer les électrodes dans l’eau désionisée au moins 3 fois, sonification pendant 20 s après chaque rinçage. Rincez au moins trois fois la sonication.
    8. Sécher les électrodes à 100 ° C pendant au moins 12 h. électrode de pesée pour quantifier la platine plaqué sur l’électrode de carbone se sentait.

2. la construction et l’Installation du système de deux électrodes

  1. Enquête du site d’installation pour chaque électrode dans le milieu naturel.
    1. Déterminer la concentration d’oxygène à l’aide d’une sonde d’oxygène dissous (OD).
    2. Vérifier le profil de profondeur de DO dans le site.
      Remarque : Les conditions environnementales souhaitées pour l’anode sont l’anoxie et l’hydratation compatible. Si vous le souhaitez, supprimer l’influence de la photosynthèse oxygénique en protégeant l’anode de la lumière. Les conditions idéales pour le placement de la cathode sont constamment hydratées et près de la surface eau étaient oxiques. Si nécessaire, fixer les flotteurs pour maintenir le contact avec la surface de la cathode.
  2. Construction du système de pile à combustible type 2-électrode d’incubation
    1. Connectez le fil isolé de la longueur désirée et une avance de fil de titane des électrodes (une anode et une cathode plaquée platine) en tournant les deux lignes. Couvrir les raccords avec de la cire résistant à l’eau et protéger davantage en utilisant des tubes de qualité marine chaleur rétractables.
    2. Connectez les deux fils avec une cathode et une anode par une résistance de résistance connue.
      Remarque : Pour les systèmes biologiques, résistances inférieures (10 à 1 000 Ω) donne une activité biologique plus cohérente. Si vous le souhaitez, une résistance de haute résistance empêchera l’activité biologique, comme un contrôle négatif. Pour éviter une corrosion de toutes les connexions entre résistance et fils, nous protégeait avec tubes rétractables de chaleur.
  3. Mesure de tension et de diagraphies de température au fil du temps.
    1. Vérifier la tension entre les extrémités de la résistance pour l’estimation de la production actuelle de la réaction de la pile à combustible.
    2. Mesurer la différence de tension au fil du temps en utilisant un voltmètre de journalisation de données avec les raccordements nécessaires menant à l’anode et la cathode (voir le protocole du fabricant).
      Remarque : L’enregistrement de données de température simultanée est facultative, mais cette information peut aider à relier modifications actuel à abiotiques par opposition aux fluctuations biologiques.
  4. Protection de l’enregistreur de données et connexions électriques
    1. Utiliser un sac fixe et/ou en plastique pour protéger l’enregistreur et toutes les connexions électriques de la pluie.
    2. Fixer le sac en plastique et les câbles hermétiquement pour protéger des vents forts. Un exemple est illustré à la Figure 1.

3. prélèvement de l’échantillon de l’électrode de l’environnement naturel

  1. Pour éviter que la qualité de l’échantillon de l’anode étant endommagé en raison de la contamination de l’oxygène, recueillir l’électrode sous condition anaérobie.
  2. Au moins 30 min avant de prélever l’échantillon de l’électrode, mettre un tube à essai dans un endroit anaérobie. Par exemple, placez séparément le tube à essai et le couvercle au fond de l’étang pour rendre la bouteille à l’intérieur d’anaérobie.
  3. Couper le fil de titane de l’électrode avec un coupe-fil, doucement recueillir l’échantillon de l’électrode dans le tube à essai et fermez-le hermétiquement dans la zone anaérobie. Pour garder l’échantillon propre, conserver l’échantillon à 4 ° C immédiatement après le prélèvement des échantillons.
    NOTE : Sinon, électrodes peuvent être transférés directement à anoxiques (N2 purgés) moyen. Nous avons utilisé un moyen de cèdres (décrit par Suzuki et al. 11) qui a été conçu de la géochimie aqueuse mesuré sur le site et modifié pour fournir des nutriments suffisants pour la croissance microbienne. Ce média a été modifié pour des expériences en laboratoire différents.

4. laboratoire Confirmation pour la Production actuelle et analyse de l’ADN

  1. Confirmation électrochimique pour la capacité de production actuelle de consortiums microbiens y attacher à l’électrode.
    1. Construire un réacteur électrochimique14,15 avec l’électrode échantillonné, un fil de platine et une Ag/AgCl (KCl saturé) électrode comme nous, CE et RE, respectivement, dans une chambre anaérobie. Remplissez le réacteur électrochimique avec milieu de cèdres contenant des donneurs d’électrons des hydrates de carbone solubles.
    2. Équilibre le potentiel de l’électrode à + 0,2 V vs Ag/AgCl et mesure la production actuelle.
  2. Extraction de l’ADN de l’échantillon de l’électrode à l’aide d’un ADN microbien kit (voir Table des matières).
    1. Nettoyer l’intérieur de la boîte à gants anaérobie avec l’éthanol à 70 % et mettre un plat stérilisé sur feuille d’aluminium.
      Remarque : Chambre anaérobie maintient la concentration en oxygène inférieure à 1 ppm en maintenant une atmosphère d’hydrogène à ~ 2-3 % pour piéger l’oxygène en présence d’un catalyseur au palladium.
    2. Ouvrez le réacteur électrochimique dans la boîte à gants, placer l’électrode de l’échantillon sur le plat et couper à une taille de fermer le tube utilisé dans le kit de l’ADN. Aller de l’avant avec le protocole du fabricant.

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Résultats

Production actuelle a été mesurée avec succès pendant environ 3 mois à l’aide d’un enregistreur de données de tension tel qu’illustré à la Figure 3. Ce moment a été choisi car c’était la plus longue période d’incubation stable pour le printemps, en raison de la forte chute des pluies qui affectent le printemps. Une période plus courte pourrait être suffisante, même si un délai plus long pourrait fournir un enrichissement plus fort de la biomasse. Nous avons c...

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Discussion

Dans l’étude décrite, nous montrons l’enrichissement d’un consortium microbien, lié avec in situ la production actuelle. Les tendances observées dans l’actuel soutien l’activité microbienne dans ce système au fil du temps de courte et longue échelles. L’étape critique pour la construction d’un système fonctionnel deux électrodes (type de pile à combustible) identifie et utilisant un emplacement avec une écurie de niveau d’eau et la concentration d’oxygène dans l’environnement. La cathode est exposée à l’oxygène ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Roger Raiche et David McCrory nous permettant d’apporter les cèdres et la consultation sur les lieux pour l’incubation à long terme. Nous remercions également l’équipe de champ des Cèdres au cours de la saison 2013-2014 : Shino Suzuki, Shunichi Ishii, Greg Wanger, Grayson Chadwick, Bonita Lam et Matthew Schechter. Supplémentaires grâce à Shino Suzuki et Gijs Kuenen recherche perspicace et prise en charge de la culture. Ce travail a été financé par une subvention pour jeunes scientifiques A et B de la Japan Society for Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant nombre 17H 04969 et 26810085, respectivement et l’Agence japonaise pour la recherche médicale et le développement (17gm6010002h0002). Financement américain fourni par le US Bureau of Global Naval Research (N62909-17-1-2038) et le Centre pour les enquêtes de biosphère énergie sombre (C-DEBI) (OCE0939564) et la NASA Astrobiology Institute - vie souterraine (NAI-LU) (NNA13AA92A). Partie de ce travail a été réalisée dans le cadre d’une société japonaise pour la Promotion des Sciences : bourse de recherche postdoctorale à court terme pour Annette Rowe (PE15019) à l’Université de Tokyo, dans le laboratoire de Kazuhito Hashimoto.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Feuille de feutre de carbonen/an/aUtilisé pour l’anode et la cathode Fil de
titaneThe Nilaco CooporationTI-451485Utilisé pour la construction d’un système de pile à combustible
Graphite époxyElectrolytica lnc.n/aUtilisé pour connecter les électrodes
et le fil Ti
Four de séchageYamatoDY300cuire l’électrode à
solidifier l’époxy graphite conducteur
Multimètre numériqueFluke616-1454pour vérifier la valeur ohmique
de résistance
Sonde d’oxygène dissousSper Science#  ; 850045pour vérifier la concentration d’oxygène
dans le environnements
RésistanceSodialUtilisé pour construire un système de pile à combustible
Fil conducteurPico81141sUtilisé pour construire un système de pile à combustible
Voltmètre et enregistreur de donnéesT& D corporationVR-71Utilisé pour l’enregistrement de données
Hexachloroplatinate d’hydrogène(IV) Hexahydratewako18497-13-7Utilisé pour l’électropolation
Acide citriqueWako038-06925Utilisé pour l’électropolation
Acide sulfuriqueWako192-04696Utilisé pour l’électropolation
HClWako083-01095Utilisé pour le lavage d’électrodes
Cylindre en verreN/AN/ASur mesure, utilisé comme
couvercle et base en PTFEN/AN/AFabrication sur mesure, utilisé comme couvercle et base du réacteur électrochimique
Caoutchouc buthyleN/AN/ASur mesure, inséré entre chaque composant du réacteur électrochimique
SeptaGL Science3007-16101Utilisé comme orifice d’injection d’un réacteur électrochimique
Électrode d’oxyde dopé à l’indium et à l’étain (ITO)GEOMATECn° 0001Utilisé comme électrode de travail, électrode saturée 5&Omega ;/
sq Ag/AgCl KClHOKUTO DENKOHX-R5Utilisé comme électrode de référence, &Phi ; Fil de platine 0,30 mm
The Nilaco CooporationPT-351325Utilisé comme contre-électrode
NaHCO3Wako191-01305Utilisé pour The Cedars Media (CMS)
CaCO3Wako030-00385Utilisé pour CMS
NH4ClWako011-03015Utilisé pour CMS
MgCl2  ; et taureau ; 6H2OWako135-00165Utilisé pour CMS
NaOH  ;Wako198-13765Utilisé pour CMS
Na2SO4Wako194-03355Utilisé pour CMS
K2HPO4Wako164-04295Utilisé pour CMS
CABSSANTA CRUZSC-285279Utilisé pour l’incubateur CMS
TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.LTI-601SDUtilisé pour la pré-culture
Machine d’autoclaveTOMY SEIKO CO. LTD.LSX-500Utilisé pour la stérilisation du réacteur électrochimique et du milieu
Banc propreSANYOMCV-91BNFUtilisé pour prévenir la contamination du réacteur électrochimique et du milieu par d’autres microbes
SéparateurEppendorf5430RVitesse de rotation jusqu’à 6000× ; g est nécessaire
Générateur d’azote gazeuxPuequ CO. LTD.PNTN-2La bouteille d’azote gazeux peut également être utilisée à la place du générateur de gaz
Spectromètre UV-visSHIMADZUUV-1800Utilisé pour l’optimisation de la densité cellulaire
PotentiostatBioLogicVMP3Utilisé pour la formation de biofilms et les expériences d’effet isotopique cinétique
Circulateur d’eau thermiqueAS ONETR-1AUtilisé pour le maintien de la température du réacteur électrochimique
Cage de FaradayHOKUTO DENKOHS-201SUtilisé pour les expériences électrochimiques
Chambre anaérobieCOYTypeB (Vinyl)POUR réaliser des expériences
en condition anaérobie
Kit d’extraction d’ADN ultra-propreMoBio
pour réacteur électrochimique centrifuge

Références

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