Développement et caractérisation fonctionnelle des cellules dendritiques tolérogène murin

Les cellules dendritiques (CD) font partie intégrante du système immunitaire inné et ont d’abord découvert et caractérisé par Ralph Steinman et Zanvil Cohn en 1973 comme cellules présentatrices d’antigène professionnelle primaire¹. DCs ont été démontrés à jouer un rôle important dans l’activation immunitaire en présentant des antigènes transformés à cellules T et cellules B via des complexes majeurs d’histocompatibilité (MHC) dans les organes lymphoïdes secondaires pour relier le système immunitaire inné et adaptatif². Dans le système immunitaire des mammifères, il y a au moins deux catégories de contrôleurs de domaine qui ont été décrits comme myéloïde DCs et plasmacytoides des contrôleurs de domaine (PDC)³. DCs myéloïdes, aussi connus comme le DCs classiques (CDC), sont caractérisées par l’expression de CD11c et peuvent être différenciées comme immatures DCs (iDCs) in vitro de cellules souches de moelle osseuse ou les monocytes du sang périphérique à l’aide granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF) et IL-4 espèces murines ou humaines, respectivement⁴.

Activation de « danger » de signaux, tels que les profils moléculaires de micro-organismes pathogènes associés (PAMP) ou profils moléculaires associés aux dommages (DAMP), conduira la maturation iDCs vers DCs immunogènes comme matures DCs (CAM) via liaison différents récepteurs de reconnaissance de modèle la surface DC⁵. Immunogènes DCs plus amorcer la prolifération des lymphocytes T naïfs et la différenciation par le biais de l’augmentation de MHCII², ligands costimulation (CD80, CD86, CD40 et)⁶, cytokines et autres médiateurs solubles⁷. Une cascade de production pro-inflammatoire médiateur de DCs immunogène est essentielle pour la différenciation des cellules de T médiée par les cytokines. Par exemple, tant IL-12 et IFN-γ sont nécessaires pour de différenciation Th1⁸ et IL-1, IL-6 et IL-23 sont essentiels pour naïve des lymphocytes T polarisation vers de cellules Th17⁹. Bien que matures DCs réagissent aux antigènes étrangers, activation incontrôlée de DC par auto-antigènes susceptible d’entraîner l’ablation de tolérance et favorisent le développement de maladies auto-immunes en générant des cellules autoréactives T dont l’activation mène à la destruction des tissus¹⁰ .

Des rapports récents ont fourni une preuve claire de la plasticité de DC, témoigne de leur capacité à interagir avec différents repères au sein de leur microenvironnement de tissu et à se différencier en sous-ensembles distincts effecteur/suppresseur DC. Les médiateurs anti-inflammatoires, comme l’IL-10,¹¹, TGF-β¹²et¹³ de la HO-1 ont été démontrés à jouer un rôle important dans l’immunosuppression en induisant tolérogène DCs (TolDCs). Ces TolDCs acquérir des fonctions régulatrices et supprimer la prolifération de lymphocytes T¹⁴. En outre, l’absence de Co-stimulation par DCs la production de médiateurs anti-inflammatoires de TolDCs contribuent à l’induction des cellules T régulatrices (Tregs) et aussi efficacement inhibe la différenciation et l’expansion des Th1 et Th17¹⁵. Dans passé deux décennies, le potentiel thérapeutique des TolDCs a été rapporté par plusieurs chercheurs. Dans ces études, l’administration de l’ex-vivo généré TolDCs non seulement amélioré les symptômes pathologiques dans différents modèles précliniques de maladies auto-immunes¹⁶ mais aussi conduit au développement d’une tolérance immunitaire chez les patients^{17 ,},¹⁸. Fait intéressant, aujourd'hui la thérapie TolDCs a été considérée comme une approche alternative ou complémentaire pour des maladies auto-immunes dans plusieurs essais cliniques, y compris de type 1 diabète sucré¹⁹, polyarthrite rhumatoïde,^{20, 21}, sclérose en plaques (MS)^22,23,24et de la maladie de Crohn²⁵.

Il existe une variété de protocoles qui ont été employés pour développer TolDCs et plusieurs laboratoires ont signalé des méthodes pour la production et la caractérisation phénotypique de TolDCs. Ces méthodes peuvent être utilisées de façon reproductible générer TolDCs in vitro de progéniteurs hématopoïétiques et de les maintenir stablement dans un état in vivode la tolérogène^26,27,28,29. L’iDCs peut être converti en TolDCs par l’exposition à divers agents pharmacologiques immunomodulateurs ou cytokines anti-inflammatoires. Par exemple, la vitamine D3 est un agent pharmacologique bien connu connu pour augmenter la production d’IL-10 et de supprimer la sécrétion d’IL-12 de contrôleurs de domaine et d’accroître ainsi leur fonction immunosuppressive³⁰. En outre, lorsque les contrôleurs de domaine sont exposés à des stimuli inflammatoires puissants, tels que les lipopolysaccharides (LPS), plusieurs agents pharmacologiques telles que dexaméthasone³¹et³²de la rapamycine corticostéroïdes³³ ont démontré qu’induisent les Phénotype TolDC en réduisant l’expression de CD40, CD80, CD86 et MHCII³⁴DC en surface. IL-10 et TGF-β sont les cytokines anti-inflammatoires plus étudié pour induire la tolérance de DC³⁵ et l’exposition simultanée à la fois de ces cytokines auraient dû être divulgués pour induire un phénotype tolérogène dans DCs³⁶.

Depuis le tolérogène que DC est défini par des caractéristiques fonctionnelles plutôt que par des marqueurs phénotypiques, il y a un grand besoin d’élaborer une méthode cohérente pour la caractérisation fonctionnelle et cellulaire des TolDCs. En outre, un protocole rigoureux et cohérent doit être établi d’évaluation cohérents et de caractérisation du phénotype tolérogène DC si l'on veut efficacement et de façon reproductible comparer la capacité des nouveaux agents d’induire le phénotype TolDC dans la laboratoire. Ici, nous fournissons un protocole détaillé avec les méthodes étape par étape pour isoler les pays en développement insulaires de progéniteurs hématopoïétiques de souris et d’analyser par la suite l’efficacité d’un nouvel agent en cours d’évaluation pour leur capacité à convertir des pays en développement insulaires en TolDCs, fournissant une robuste caractérisation phénotypique et fonctionnelle des TolDCs in vitro et in vivo. Cette description inclut une méthode élaborée pour caractériser la TolDCs de leurs ligands surfaces, profil des cytokines et fonctions immunosuppressive in vitro. Nous fournissons également un exemple d’une méthode pour étudier l’application thérapeutique potentielle de ces TolDCs dans un modèle préclinique de MS, encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE). Ce protocole établi aide les chercheurs à évaluer la capacité des nouveaux agents pour promouvoir l’induction de TolDCs et facilitera les efforts visant à élargir le champ de développement thérapeutique TolDC.

Toutes les études ont été effectuées conformément aux procédures approuvées de la Case Western Reserve University School of Medicine animalier institutionnel et Comité d’urbanisme.

1. préparer la moelle osseuse des cellules dendritiques (BMDCs)

1. Stériliser tous les instruments chirurgicaux par autoclavage et réaliser l’expérience en classe II hotte biologique de sécurité avec les procédures de sécurité appropriées.
2. Euthanasier souris C57BL/6 8-10 semaines d’âge à l’aide de CO₂ chambre. Placez votre souris sur une planche de dissection et rincer avec de l’éthanol à 70 %. L’accise OS fémur et du tibia-péroné à l’aide de ciseaux chirurgicaux et placez-les avec 70 % d’éthanol dans une boîte de Petri de 10 cm.
3. Utiliser des lames chirurgicales et pinces à disséquer les tissus loin autant que possible sur le couvercle de la 10 cm culture plat et isoler les tibias et fémurs de les placer avec 70 % d’éthanol dans une boîte de Petri de 6 cm.
4. Lames chirurgicales permet de couper les deux extrémités des tibias et des fémurs. Utiliser 3 mL de PBS en seringue de 3 ml avec une aiguille de 23G pour vider le contenu de la moelle osseuse d’un bout d’os dans un tube conique contenant 12 ml de PBS. Répétez cette opération 3 fois pour chaque extrémité des os.
5. Centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 5 min.
6. Retirez le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 ml de tampon lyse de ACK pendant 5 minutes éliminer les globules rouges.
7. Ajouter 9 ml de PBS pour diluer le tampon de lyse ACK et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
8. Retirez le surnageant et remettre en suspension avec 10 ml de milieu de culture (RPMI 1640 plus L-glutamine, 10 % FBS, 1 % des aminoacides non essentiels (100 x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoéthanol et 5 % la pénicilline/streptomycine).
   NOTE : Niveau d’endotoxine doit être inférieure à 0,1 UE/ml en BF.
9. Passer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule 40 μm et prendre 20 µl de suspension cellulaire et mélanger avec 80 µl du bleu pour compter le nombre de cellules vivantes en utilisant cytomètre trypan.
10. Ajuster le nombre de cellules à 1 x 10⁶ cellules/ml à 15 ng/ml GM-CSF et 10 ng/ml IL-4.
11. Plaque de 3 ml de 1 x 10⁶ cellules/ml dans chaque puits de la plaque 6 puits et incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO₂et 95 % d’humidité dans l’incubateur à CO₂ .
    Remarque : Les cellules de la moelle osseuse de souris est d’environ 3-5 x 10⁷ cellules, ce qui indique qu’il peut être placé entre 2 à 3 plaques 6 puits.
12. Le jour 3, supprimer tous les 3 ml de milieu de culture de chaque puits, ajouter 2 ml de PBS frais dans chaque puits, et puis doucement agiter la plaque afin d’enlever toutes les cellules non adhérentes.
13. Remplacer les 3 ml milieu de culture fraîche avec 15 ng/ml GM-CSF et 10 ng/ml IL-4 dans chaque puits. Incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO₂et 95 % d’humidité dans l’incubateur à CO₂ .
14. Le jour 5, ajouter directement un autre milieu de culture frais 3 ml avec 15 ng/ml GM-CSF et 10 ng/ml IL-4 dans chaque puits. Incuber les cellules à 37° C, 5 % de CO₂ et 95 % d’humidité dans l’incubateur à CO₂ .
    Remarque : Le volume total dans chaque puits est maintenant 6 ml.
15. Jour 7, mettre la plaque entière sur la glace pendant 10 minutes. Pipetez doucement le milieu de culture dans chaque puits pour déloger le faiblement adhérentes BMDCs comme pays en développement insulaires en suspension.
    Remarque : Les macrophages adhérentes sont encore attachées à la plaque. Procédures et doucement à basse température sont la clé pour éviter l’activation de DC pour affecter davantage les expériences.
16. Centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 5 mn et remettre en suspension avec milieu de culture frais pour d’autres expériences.
    Remarque : BMDCs peuvent être identifiées avec l’anticorps CD11c marqués par fluorescence par cytométrie en flux et nous avons montré notre stratégie de blocage de BMDCs pour d’autres expériences dans la Figure 1.

2. caractériser les gènes TolDC et profil protéique

1. Plaque de 2 ml de 1 x 10⁶ BMDCs/ml par puits en puits-plaque 6 milieu de culture dans la présence ou l’absence de 100 à 400 nM CDDO-Division pour l’incubation de 1 h à 37 ° C, 5 % de CO₂ et 95 % d’humidité dans l’incubateur à CO₂ .
   NOTE : CDDO-Division, un synthétique triterpénoïdes, est un facteur nucléaire (2 dérivés érythroïdes) - like - 2 inducteur de facteur (Nrf2) et inhibiteur du facteur nucléaire-κB (NF-κB). Appliquer des autres agents d’induction de TolDCs de pays en développement insulaires, tels que l’IL-10, vitamine D3, dexaméthasone ou la baie 11-7085 et modifier cette étape pour une condition optimale pour chaque agent.
2. Ajouter 10 ou 100 ng/ml de LPS pour incubation 4-24 heures pour induire la CAM (temps d’incubation est différent en raison de la mesure d’ARNm ou protéines).
3. Doucement le milieu de culture dans chaque puits, déposer et récolter la suspension cellulaire à l’aide de la pipette 1 ml. Centrifuger à 300 x g pendant 5 mn recueillir les cellules et le surnageant, respectivement.
4. Analyser les ligands surfaces des granulés de cellules par cytométrie en flux, tels que les stimulateurs ligands : CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL ou ligands inhibitrices : PD-L1, L2-PD, ILT3 ILT4.
5. Isoler l’ARN à partir des granulés de cellule et d’analyser les ARN et les échantillons surnageants pour les niveaux de profil et des gènes et des protéines de cytokine par PCR en temps réel quantitative (qRT-PCR) et ELISA, respectivement.
   NOTE : par exemple, des cytokines inflammatoires : TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 et IL-23 ou anti-inflammatoires cytokines : IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 et HO-1.

3. évaluer la fonction de TolDCs In Vitro et In Vivo

1. Analyse de syngénique prolifération de lymphocytes T
   1. Stériliser tous les instruments chirurgicaux par autoclavage et réaliser l’expérience en classe II hotte biologique de sécurité avec les procédures de sécurité appropriées.
   2. Préparer le tampon Mac à l’aide de 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM EDTA dans 500 ml de PBS. Stériliser le tampon en le filtrant à travers un filtre de 0,2 µm.
      Remarque : Conservez le tampon sur la glace au cours de l’expérience suivante.
   3. Pour obtenir des CD4⁺ T cellules, euthanasier des souris transgéniques de OT-II T-cell receptor (TCR) âgés de 8 à 10 semaines à l’aide de CO₂ chambre. Placez votre souris sur une planche de dissection et rincer avec de l’éthanol à 70 %. Isoler la rate du côté gauche de l’abdomen à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux.
   4. Mettre la rate avec 2 ml de PBS dans une boîte de Petri de 6 cm et utiliser l’arrière du poussoir de la seringue de 3 ml à mâcher la rate en passant une passoire de cellule 40 μm.
   5. Recueillir la suspension cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
   6. Resuspendre le culot dans 400 μl de tampon de MACS.
   7. Ajouter 100 μl de CD4⁺ T Cell biotine-anticorps Cocktail à 4° C pendant 5 minutes.
      Remarque : Le cocktail d’anticorps se lie sur les autres types de cellules sauf CD4 des cellules⁺ T, tels que CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC classe II, Ter-119 et TCRγ/δ.
   8. Ajouter 300 μl de tampon de MACS et 200 µL de perles anti-biotine (Table des matières) à 4° C pendant 10 minutes.
   9. Place la colonne composée de sphères ferromagnétiques (Table des matières) et filtre de pré-séparation ensemble dans le magnétique sur le terrain et le rincer avec 3 ml de tampon de MACS.
   10. Ajouter 9 ml de tampon de MACS dans les cellules et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
   11. Resuspendre le culot dans 3 ml de tampon de MACS et appliquez sur la colonne. Collect intermédiaires contenant CD4⁺ T des cellules.
   12. Laver la colonne avec un autre 3 ml de tampon de MACS et également recueillir l’accréditif.
   13. Pour obtenir DCs pan splénique, euthanasier souris C57BL/6, 8-10 semaines d’âge à l’aide de CO₂ chambre. Placez votre souris sur une planche de dissection et rincer avec de l’éthanol à 70 %. Isoler la rate du côté gauche de l’abdomen à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux. Mettre la rate dans une boîte de Petri de 6cm contenant 2 ml de solution de collagènase D (collagénase de 2 mg/ml D dissous dans HBSS contenant du calcium, magnésium).
   14. Injecter 1 ml de solution de collagènase D à la rate deux fois avec une seringue de 1 ml et une aiguille 25G. Couper la rate en petits morceaux avec des petits ciseaux.
   15. Agiter et laisser incuber à température ambiante pendant 25 minutes.
   16. Ajouter 500 μl d’EDTA 0,5 M à température ambiante pendant 5 minutes.
       Remarque : Les étapes de 3.1.13-3.1.14 sont essentiels pour accroître le rendement des contrôleurs de domaine.
   17. Maintenant utiliser l’arrière du poussoir de la seringue de 3 ml à émincer la boue rate en passant une passoire de cellule 40 μm et recueillir la suspension cellulaire par centrifugation à 300 g pendant 5 mn.
   18. Resuspendre le culot dans 350 μl de tampon MACS, 50 µl de réactif de blocage de FcR et de 100 μl de Pan biotine-anticorps cellules dendritiques Cocktail à 4° C pendant 10 minutes.
       Remarque : L’anticorps cocktail contre les antigènes qui ne sont pas exprimées par les contrôleurs de domaine.
   19. Laver les cellules en ajoutant 9 ml de tampon de MACS et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
   20. Resuspendre le culot dans 800 μl de tampon de MACS et ajouter 200 µL de anti-biotine perles à 4 ° C pendant 10 minutes.
   21. Répétez les étapes de 3.1.9-3.1.11 de recueillir des contrôleurs de domaine.
   22. Laver la colonne avec un autre 3 ml de tampon de MACS deux fois et aussi recueillir l’accréditif.
   23. Traiter les 2 x 10⁵ DCs/ml en présence ou en absence de lymphocytes T de 100 à 400 nM CDDO-Division à 37 ° C pendant 1 h séparément, étiquette le CD4⁺ (1 x 107/ml) avec 1 μM CFSE à 37 ° C pendant 15 minutes, laver avec du PBS et réajuster le volume pour obtenir la concentration finale de 2 x 10⁶ T cellules/ml.
   24. Ensuite, dans une plaque à 96 puits, co-culture 100 μl des cellules dendritiques traitées avec le même volume de CD4 marqué CFSE⁺ T cells, tous deux prélevés dans les étapes ci-dessus pour obtenir 01:10 ratio. Maintenant ajoutez 100 ng/mL le peptide d’ovalbumine (OVA) 323-329 par puits et mesure l’intensité CFSE des cellules T par cytométrie en flux après 2-3 jours d’incubation.
       Remarque : Le nombre de cellules et le rapport des contrôleurs de domaine et T ont été optimisés en cellules de nos précédents travaux³⁷.
2. Induire le passif EAE en injectant BMDCs pulsé avec la myéline Oligodendrocyte glycoprotéine (MOG) (35-55)
   1. Plaque de 2 ml de 1 x 10⁶ BMDCs/ml par puits de 6 puits-plaque avec milieu de culture en présence ou en absence de 100 à 400 nM CDDO-Division pour incubation 1hr.
   2. Ajouter 10 ng/ml de LPS pour incubation 24 hrs.
   3. Ajouter 100 μg/ml de MOG (35-55) pour incubation 4 hrs.
   4. Récolter la suspension cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
   5. Resuspendre le culot cellulaire avec du PBS et compter les cellules.
   6. Injecter par voie sous-cutanée de 200 μl de 2 x 10⁶ cellules à des souris C57BL/6 femelles âgés de 8 à 10 semaines (100 μl dans chaque patte arrière).
   7. Le jour de l’injection de BMDC et 48 heures. plus tard, injecter 200 ng de la toxine coquelucheuse (PTX) dans chacune des souris.
   8. Répétez les étapes 3.2.6-3.2.7 une fois par semaine pendant 4 semaines consécutives.
   9. Évaluer les symptômes cliniques de l’EAE quotidiennement en utilisant les critères standard³⁷ (0,5 limp queue, queue 1-boites, faiblesse modérée 2 patte, patte 3 grave faiblesse, paralysie de la patte 4-complet, état 5-quadriplégie ou moribond, 6-mort).

La différenciation et la sélection de BMDCs :

Cellules souches de la moelle osseuse ont été cultivés en milieu RPMI complet en présence de GM-CSF et d’IL-4 à se différencier en pays en développement insulaires pendant 7 jours (Figure 1 a). Jour 1, les cellules ont de petite taille et morphologie sphérique. Laver avec du PBS avant le remplacement du milieu frais le jour 3 aidé des cellules pour former des grappes et également augmenté la population de CD11c+ cellules. Jour 4, BMDCs ont été agrandies à la taille et initié la formation de cluster. Macrophages collés étaient également convertis et observées au bas de la plaque avec une forme allongée. Le jour 5, grosses grappes de tailles des BMDCs sont forment. Jour 6, un grand nombre de BMDCs semi adhérentes et flottantes ont été également observé. BMDCs ont été récoltés le jour 7 et analysés par cytométrie de flux pour l’expression CD11c un marqueur spécifique de DCs murines. Comme sur un terrain de cytométrie de flux représentatif dans la Figure 1 b, environ 83,6 % des BMDCs exprimant CD11c ont été obtenues par cette méthode.

Induction et caractérisation génétique de TolDCs :

Certains des agents connus pour provoquer des TolDCs, tels que de la vitamine D338 et la dexaméthasone39, sont connus pour bas-réguler l’expression des ligands surfaces DC, y compris le CMH II et des molécules de costimulation CD40, CD80 et CD86. En revanche, dans le cadre du LPS soit ou induite par le CD40L maturation de DCs, inhibiteurs de la calcineurine A de cyclosporine et FK506 ont montré aucun effet sur l’expression du CD83, CD80, CD86 et CMH II33. Tel que démontré par l’analyse en cytométrie en flux, l’induction de la TolDC de CDDO-division eut aucun effet significatif sur l’expression du ligand surface induite par LPS de contrôleurs de domaine, y compris CD80, CD86, CMH II, PD-L1 et CD40. (Figure 2).

En outre, l’analyse comparative de transcriptome et cytokines de BMDCs traités avec ou sans CDDO-Division en présence ou absence de LPS dépeint le profil génétique inflammatoire modulé. CDDO-Division traitement a considérablement réduit les gènes de cytokine pro-inflammatoire LPS induits tels que de IFN-γ, IL-12, EDN1 déclarations, TNFα, IL-6 et IL-23 (Figure 3 a-3F). Ce qu’on appelle cytokines pour Th1 (IFN-γ et IL-12) et Th17 (IL-6 et IL-23) la différenciation des cellules. En outre, CDDO-Division traités BMDCs a montré la surexpression des gènes de cytokines anti-inflammatoires telles que IL-4, IL-10, TGF-β et HO-1 (Figure 4 a-4D). Ces gènes anti-inflammatoires sont connus modulateur de l’auto-immunité en promouvant des Th2 (IL-4) et la différenciation des cellules Treg (IL-10 et TGF-β). 40 ici, il est important de noter que le distinctif de l’IL-12−; IL-10+ cytokine production36, l’induction de l' expression de HO-113et l’inhibition de l’EDN-141 induite par le traitement CDDO-Division, sont tous connu pour authentifier les DCs tolérogène fonction.

Caractérisation fonctionnelle et cellulaire de TolDCs in vitro

Prolifération cellulaire T DC est connue pour être déclenché par l’engagement de costimulation ligand de surface ainsi que la sécrétion de cytokines et de médiateurs solubles7. Cependant, TolDCs inhibent les réponses des cellules T par le biais de plusieurs mécanismes : en induisant l’anergie des lymphocytes T, en promouvant activement la suppression des cellules autoréactives et en promouvant la polarisation des cellules naïves T Tregs42. Nous l’avons déjà signalé que la caractérisation fonctionnelle de CDDO-Division induit TolDCs37. L’anergie des lymphocytes t et la suppression des cellules autoréactives T peuvent être analysées indépendamment en vérifiant les marqueurs de surface ou annexine V/7-AAD coloration. Cependant, nous avons confirmé indirectement ce phénotype en mesurant l’indice de prolifération des lymphocytes T. Pour ce faire, nous utilisé des souris transgéniques OTII C57BL/6 cellules T et exposée à des DCs syngéniques extraite de souris C57BL/6 et traités avec ou sans CDDO-Division. Ces contrôleurs de domaine ont été lavés et cultivées conjointement avec CFSE teinté de cellules T avec peptide d’ovules. Nous avons observé une réduction significative de la prolifération des cellules T par DCs pré-traité CDDO-Division, suggérant leur phénotype tolérogène (Figure 5).

In vivo caractérisation fonctionnelle de TolDCs dans un modèle préclinique de l’auto-immunité

Enfin, la fonctionnalité de TolDCs induite par la division peut être testée dans un certain nombre de modèles caractérisés précliniques in vivo auto-immune ou inflammatoires caractéristiques. Depuis, EAE est un modèle murin préclinique largement accepté de la maladie clinique auto-immune du système nerveux central, MS43, nous avons utilisé cela dans notre étude. Afin d’approfondir l' in vivo des fonctionnalités de CDDO-Division induit TolDCs, nous le défia dans un modèle murin préclinique de l’EAE passive. Pour ce faire, les BMDCs ont été cultivées avec ou sans CDDO-Division en présence de LPS et MOG (35-55). Ces cellules ont été injectées puis à plusieurs reprises en tant que protocole régulier représenté dans la Figure 6 a et souris ont été systématiquement observés pour la manifestation de signes cliniques. Comme prévu, LPS et MOG (35-55) pulsée BMDCs ont montré des symptômes cliniques de l’EAE, cependant ; CDDO-Division apprêté BMDCs traités groupe a montré apparition retardée de la maladie avec des symptômes cliniques significativement réduites (Figure 6 b). Ces résultats valident le phénotype immunosuppresseur de TolDCs induite par le traitement CDDO-Division.

Figure 1 : développement et caractérisation phénotypique de BMDCs : (A) cellules de la moelle épinière ont été éliminées de l’os du tibia et du fémur de souris C57BL/6 et plus différenciés à BMDCs. Une formation de cluster cellule appropriée a été suivie par microscopie optique pendant toute la période de différenciation (barres d’échelle, 100 µm). (B) la différenciation BMDCs a été confirmée par l’expression en surface CD11c, telle qu’analysée par FACS. Graphes représentent le pourcentage de l’expansé CD11c+ population de cellules. (C) Gating stratégie de cellules BMDCs. ont été tout d’abord gated pour exclure les débris (FSC vs SSC). Une porte d’exclusion doublet a été utilisée pour porte sur les maillots de corps de cellules (FL2-W vs FL2-A). Dans les cellules de singulet, des cellules vivantes ont été bloqués sur la parcelle 7-AAD (7-AAD vs FSC). Puis les cellules ont été également analysés et gated sur CD11c expression. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : DC cell surface ligand expression est inchangée par CDDO-Division. Les cellules ont été traités au préalable en présence ou en absence de CDDO-Division (200 nM) pendant 1 heure avant la stimulation par le LPS (100 ng/ml) pendant 24 heures. Expression à la surface cellulaire de CD80, CD86, CMH II, PD-L1 et CD40 a été analysée par cytométrie en flux. Ce chiffre a été modifié par Rapports scientifiques 7, numéro d’Article : 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduit et republiée avec autorisation du droit d’auteur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : CDDO-Division altéré le phénotype génétique et protéines des immunogènes DCs. BMDCs ont été préalablement traités en présence ou en absence de CDDO-Division (50-400 nM) pendant 1 heure avant l’addition de LPS (100 ng/ml), et soit récoltée pour l’extraction de l’ARN (4 hrs.) ou le droit de milieu de culture de condition pour 24 heures. ayant précédé le prélèvement pour les analyses de cytokine. Les niveaux d’IL-12 (B), D TNFα, IL-6 (E) et IL-23 (F) ont été mesurés par qRT-PCR et ELISA. Considérant que le niveau d’IFN-γ (A) a été mesuré par qRT-PCR et EDN-1 (C) par ELISA seule. Les résultats sont exprimés en moyenne ± S.D. de trois expériences. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 comparativement aux groupes LPS-traités. Test t de student non appariés. Ce chiffre a été modifié par Rapports scientifiques 7, numéro d’Article : 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduit et republié avec l’autorisation du droit d’auteur. » S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : CDDO-Division induit phénotype TolDCs confirmée par l’expression génique et protéique. BMDCs ont été traités au préalable en présence ou en absence de CDDO-Division (10-400 nM) pendant 1 heure avant l’addition de LPS (100 ng/ml), et les cellules ont été récoltées pour l’extraction de l’ARN après 24 heures. Les niveaux d’IL-4 (A), IL-10 (B) et TGF-β (C) ont été mesurés par qRT-PCR. (D) les lysats de protéines ont été recueillis à 12 heures. pour les analyses et les niveaux de HO-1 et β-actine expression a été déterminée par Western Blot. Les résultats sont exprimés en moyenne ± S.D. de trois expériences. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 comparativement aux groupes LPS-traités. Test t de student non appariés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : CDDO-Division exposés DCs supprimer la prolifération des cellules de T. Contrôleurs de domaine ont été pré-traitées avec CDDO-Division (100-400 nM) pendant 1 heure seulement, puis CFSE lavé et co cultivée avec teinté de lymphocytes T à un 01:10 ratio. (A) spléniques des lymphocytes T et des contrôleurs de domaine ont été isolées à partir des souris transgéniques OTII C57BL/6 et les souris C57BL/6, respectivement. CDDO-Division DCs prétraitées sont cultivés conjointement avec CFSE colorées avec des cellules de T (w /) ou sans (w/o) ajout d’ovules pendant l’incubation. La prolifération des cellules t a été déterminée par cytométrie de flux à jour 2. Graphes représentent le pourcentage de cellules de T par rapport aux nombres T cell division en division. Les données sont une représentation sous forme de 3 expériences indépendantes. Ce chiffre a été modifié par Rapports scientifiques 7, numéro d’Article : 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduit et republiée avec autorisation du droit d’auteur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : MOG amorcée passive induite par le DC EAE est abrogé par le TolDCs. (A) induction de l’EAE par MOG (35-55)-pulsé BMDCs. BMDCs matures ont été traités en présence ou en absence de CDDO-Division (400 nM) et impulsé par la suite avec MOG (35-55) pour 4 heures. Un total de 200 μl de 2 × 106 cellules était administré par injection sous-cutanée dans la région du flanc de souris C57BL/6 fois par semaine pour un total de quatre injections. Chaque fois, PTX était administré par injection intrapéritonéale, immédiatement et à nouveau 2 jours plus tard (0 sur le 4e cycle). B cliniques scores ont été enregistrées après tout quatre injections, à l’aide de critères standards. Toutes les données ont été présentées comme la moyenne ± S.E.M. * P < 0,05. Plusieurs tests t Holm-Sidak analyse (n = 7 souris dans chaque groupe). Ce chiffre a été modifié par Rapports scientifiques 7, numéro d’Article : 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduit et republiée avec autorisation du droit d’auteur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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