Method Article

Développement et caractérisation fonctionnelle des cellules dendritiques tolérogène murin

DOI:

10.3791/57637

⸱

May 18th, 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children's Hospital, University Hospitals, Cleveland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole visant à développer et caractériser les cellules dendritiques tolérogène (TolDCs) et évaluer leur utilité immunothérapeutique.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le système immunitaire fonctionne en maintenant un équilibre serré entre la coordination des réponses contre les antigènes étrangers et maintenir un État ne répondant pas contre des auto-antigènes comme antigènes dérivés d’organismes commensaux. La perturbation de cette homéostasie immunitaire peut entraîner une inflammation chronique et le développement de l’auto-immunité. Les cellules dendritiques (CD) sont les cellules présentatrices d’antigène professionnelles du système immunitaire inné impliqué dans l’activation des cellules naïves T pour initier des réponses immunitaires contre les antigènes étrangers. Cependant, DCs peuvent également être différenciés dans les TolDCs qui agissent pour maintenir et promouvoir la tolérance des lymphocytes T et de supprimer les cellules effectrices qui contribuent au développement des deux conditions d’inflammation auto-immune ou chronique. Le récent progrès dans notre compréhension de TolDCs suggère que DC tolérance peut être réalisée en modulant leurs conditions de différenciation. Ce phénomène a entraîné une croissance considérable dans le développement de thérapies TolDC de nombreux désordres du système immunitaire causées à rompre dans la tolérance immunitaire. Des études dans les modèles murins auto-immunité précliniques ont validé davantage l’immunothérapie utilité de TolDCs dans le traitement des maladies auto-immunes. Aujourd'hui, les TolDCs sont devenus un outil prometteur immunothérapeutique dans la clinique de rétablissement tolérance immunitaire dans divers troubles immunitaires en ciblant les réponses auto-immunes pathogènes tout en conservant l’immunité protectrice intactes. Bien qu’un éventail de stratégies a été proposée par plusieurs laboratoires pour induire la TolDCs, il n’y a aucune cohérence pour caractériser le phénotype cellulaire et fonctionnel de ces cellules. Ce protocole fournit un guide étape par étape pour le développement de la moelle osseuse DCs en grand nombre, une méthode unique permettant de les différencier en TolDCs avec un 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic de triterpénoïdes synthétique difluoro-propyl-amide de l’acide (CDDO-Division) et les techniques utilisées pour confirmer leur phénotype, y compris les analyses des signatures moléculaires essentielles de TolDCs. Enfin, nous montrons une méthode pour évaluer la fonction TolDC en testant leur réponse immunosuppressive in vitro et in vivo dans un modèle préclinique de sclérose en plaques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules dendritiques (CD) font partie intégrante du système immunitaire inné et ont d’abord découvert et caractérisé par Ralph Steinman et Zanvil Cohn en 1973 comme cellules présentatrices d’antigène professionnelle primaire1. DCs ont été démontrés à jouer un rôle important dans l’activation immunitaire en présentant des antigènes transformés à cellules T et cellules B via des complexes majeurs d’histocompatibilité (MHC) dans les organes lymphoïdes secondaires pour relier le système immunitaire inné et adaptatif2. Dans le système immunitaire des mammifères, il y a au moins deux catégories de contrôleurs de domaine qui ont été décrits comme myéloïde DCs et plasmacytoides des contrôleurs de domaine (PDC)3. DCs myéloïdes, aussi connus comme le DCs classiques (CDC), sont caractérisées par l’expression de CD11c et peuvent être différenciées comme immatures DCs (iDCs) in vitro de cellules souches de moelle osseuse ou les monocytes du sang périphérique à l’aide granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF) et IL-4 espèces murines ou humaines, respectivement4.

Activation de « danger » de signaux, tels que les profils moléculaires de micro-organismes pathogènes associés (PAMP) ou profils moléculaires associés aux dommages (DAMP), conduira la maturation iDCs vers DCs immunogènes comme matures DCs (CAM) via liaison différents récepteurs de reconnaissance de modèle la surface DC5. Immunogènes DCs plus amorcer la prolifération des lymphocytes T naïfs et la différenciation par le biais de l’augmentation de MHCII2, ligands costimulation (CD80, CD86, CD40 et)6, cytokines et autres médiateurs solubles7. Une cascade de production pro-inflammatoire médiateur de DCs immunogène est essentielle pour la différenciation des cellules de T médiée par les cytokines. Par exemple, tant IL-12 et IFN-γ sont nécessaires pour de différenciation Th18 et IL-1, IL-6 et IL-23 sont essentiels pour naïve des lymphocytes T polarisation vers de cellules Th179. Bien que matures DCs réagissent aux antigènes étrangers, activation incontrôlée de DC par auto-antigènes susceptible d’entraîner l’ablation de tolérance et favorisent le développement de maladies auto-immunes en générant des cellules autoréactives T dont l’activation mène à la destruction des tissus10 .

Des rapports récents ont fourni une preuve claire de la plasticité de DC, témoigne de leur capacité à interagir avec différents repères au sein de leur microenvironnement de tissu et à se différencier en sous-ensembles distincts effecteur/suppresseur DC. Les médiateurs anti-inflammatoires, comme l’IL-10,11, TGF-β12et13 de la HO-1 ont été démontrés à jouer un rôle important dans l’immunosuppression en induisant tolérogène DCs (TolDCs). Ces TolDCs acquérir des fonctions régulatrices et supprimer la prolifération de lymphocytes T14. En outre, l’absence de Co-stimulation par DCs la production de médiateurs anti-inflammatoires de TolDCs contribuent à l’induction des cellules T régulatrices (Tregs) et aussi efficacement inhibe la différenciation et l’expansion des Th1 et Th1715. Dans passé deux décennies, le potentiel thérapeutique des TolDCs a été rapporté par plusieurs chercheurs. Dans ces études, l’administration de l’ex-vivo généré TolDCs non seulement amélioré les symptômes pathologiques dans différents modèles précliniques de maladies auto-immunes16 mais aussi conduit au développement d’une tolérance immunitaire chez les patients17 ,,18. Fait intéressant, aujourd'hui la thérapie TolDCs a été considérée comme une approche alternative ou complémentaire pour des maladies auto-immunes dans plusieurs essais cliniques, y compris de type 1 diabète sucré19, polyarthrite rhumatoïde,20, 21, sclérose en plaques (MS)22,23,24et de la maladie de Crohn25.

Il existe une variété de protocoles qui ont été employés pour développer TolDCs et plusieurs laboratoires ont signalé des méthodes pour la production et la caractérisation phénotypique de TolDCs. Ces méthodes peuvent être utilisées de façon reproductible générer TolDCs in vitro de progéniteurs hématopoïétiques et de les maintenir stablement dans un état in vivode la tolérogène26,27,28,29. L’iDCs peut être converti en TolDCs par l’exposition à divers agents pharmacologiques immunomodulateurs ou cytokines anti-inflammatoires. Par exemple, la vitamine D3 est un agent pharmacologique bien connu connu pour augmenter la production d’IL-10 et de supprimer la sécrétion d’IL-12 de contrôleurs de domaine et d’accroître ainsi leur fonction immunosuppressive30. En outre, lorsque les contrôleurs de domaine sont exposés à des stimuli inflammatoires puissants, tels que les lipopolysaccharides (LPS), plusieurs agents pharmacologiques telles que dexaméthasone31et32de la rapamycine corticostéroïdes33 ont démontré qu’induisent les Phénotype TolDC en réduisant l’expression de CD40, CD80, CD86 et MHCII34DC en surface. IL-10 et TGF-β sont les cytokines anti-inflammatoires plus étudié pour induire la tolérance de DC35 et l’exposition simultanée à la fois de ces cytokines auraient dû être divulgués pour induire un phénotype tolérogène dans DCs36.

Depuis le tolérogène que DC est défini par des caractéristiques fonctionnelles plutôt que par des marqueurs phénotypiques, il y a un grand besoin d’élaborer une méthode cohérente pour la caractérisation fonctionnelle et cellulaire des TolDCs. En outre, un protocole rigoureux et cohérent doit être établi d’évaluation cohérents et de caractérisation du phénotype tolérogène DC si l'on veut efficacement et de façon reproductible comparer la capacité des nouveaux agents d’induire le phénotype TolDC dans la laboratoire. Ici, nous fournissons un protocole détaillé avec les méthodes étape par étape pour isoler les pays en développement insulaires de progéniteurs hématopoïétiques de souris et d’analyser par la suite l’efficacité d’un nouvel agent en cours d’évaluation pour leur capacité à convertir des pays en développement insulaires en TolDCs, fournissant une robuste caractérisation phénotypique et fonctionnelle des TolDCs in vitro et in vivo. Cette description inclut une méthode élaborée pour caractériser la TolDCs de leurs ligands surfaces, profil des cytokines et fonctions immunosuppressive in vitro. Nous fournissons également un exemple d’une méthode pour étudier l’application thérapeutique potentielle de ces TolDCs dans un modèle préclinique de MS, encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE). Ce protocole établi aide les chercheurs à évaluer la capacité des nouveaux agents pour promouvoir l’induction de TolDCs et facilitera les efforts visant à élargir le champ de développement thérapeutique TolDC.

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Protocol

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Toutes les études ont été effectuées conformément aux procédures approuvées de la Case Western Reserve University School of Medicine animalier institutionnel et Comité d’urbanisme.

1. préparer la moelle osseuse des cellules dendritiques (BMDCs)

  1. Stériliser tous les instruments chirurgicaux par autoclavage et réaliser l’expérience en classe II hotte biologique de sécurité avec les procédures de sécurité appropriées.
  2. Euthanasier souris C57BL/6 8-10 semaines d’âge à l’aide de CO2 chambre. Placez votre souris sur une planche de dissection et rincer avec de l’éthanol à 70 %. L’accise OS fémur et du tibia-péroné à l’aide de ciseaux chirurgicaux et placez-les avec 70 % d’éthanol dans une boîte de Petri de 10 cm.
  3. Utiliser des lames chirurgicales et pinces à disséquer les tissus loin autant que possible sur le couvercle de la 10 cm culture plat et isoler les tibias et fémurs de les placer avec 70 % d’éthanol dans une boîte de Petri de 6 cm.
  4. Lames chirurgicales permet de couper les deux extrémités des tibias et des fémurs. Utiliser 3 mL de PBS en seringue de 3 ml avec une aiguille de 23G pour vider le contenu de la moelle osseuse d’un bout d’os dans un tube conique contenant 12 ml de PBS. Répétez cette opération 3 fois pour chaque extrémité des os.
  5. Centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 5 min.
  6. Retirez le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 ml de tampon lyse de ACK pendant 5 minutes éliminer les globules rouges.
  7. Ajouter 9 ml de PBS pour diluer le tampon de lyse ACK et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
  8. Retirez le surnageant et remettre en suspension avec 10 ml de milieu de culture (RPMI 1640 plus L-glutamine, 10 % FBS, 1 % des aminoacides non essentiels (100 x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoéthanol et 5 % la pénicilline/streptomycine).
    NOTE : Niveau d’endotoxine doit être inférieure à 0,1 UE/ml en BF.
  9. Passer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule 40 μm et prendre 20 µl de suspension cellulaire et mélanger avec 80 µl du bleu pour compter le nombre de cellules vivantes en utilisant cytomètre trypan.
  10. Ajuster le nombre de cellules à 1 x 106 cellules/ml à 15 ng/ml GM-CSF et 10 ng/ml IL-4.
  11. Plaque de 3 ml de 1 x 106 cellules/ml dans chaque puits de la plaque 6 puits et incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité dans l’incubateur à CO2 .
    Remarque : Les cellules de la moelle osseuse de souris est d’environ 3-5 x 107 cellules, ce qui indique qu’il peut être placé entre 2 à 3 plaques 6 puits.
  12. Le jour 3, supprimer tous les 3 ml de milieu de culture de chaque puits, ajouter 2 ml de PBS frais dans chaque puits, et puis doucement agiter la plaque afin d’enlever toutes les cellules non adhérentes.
  13. Remplacer les 3 ml milieu de culture fraîche avec 15 ng/ml GM-CSF et 10 ng/ml IL-4 dans chaque puits. Incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité dans l’incubateur à CO2 .
  14. Le jour 5, ajouter directement un autre milieu de culture frais 3 ml avec 15 ng/ml GM-CSF et 10 ng/ml IL-4 dans chaque puits. Incuber les cellules à 37° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité dans l’incubateur à CO2 .
    Remarque : Le volume total dans chaque puits est maintenant 6 ml.
  15. Jour 7, mettre la plaque entière sur la glace pendant 10 minutes. Pipetez doucement le milieu de culture dans chaque puits pour déloger le faiblement adhérentes BMDCs comme pays en développement insulaires en suspension.
    Remarque : Les macrophages adhérentes sont encore attachées à la plaque. Procédures et doucement à basse température sont la clé pour éviter l’activation de DC pour affecter davantage les expériences.
  16. Centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 5 mn et remettre en suspension avec milieu de culture frais pour d’autres expériences.
    Remarque : BMDCs peuvent être identifiées avec l’anticorps CD11c marqués par fluorescence par cytométrie en flux et nous avons montré notre stratégie de blocage de BMDCs pour d’autres expériences dans la Figure 1.

2. caractériser les gènes TolDC et profil protéique

  1. Plaque de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml par puits en puits-plaque 6 milieu de culture dans la présence ou l’absence de 100 à 400 nM CDDO-Division pour l’incubation de 1 h à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité dans l’incubateur à CO2 .
    NOTE : CDDO-Division, un synthétique triterpénoïdes, est un facteur nucléaire (2 dérivés érythroïdes) - like - 2 inducteur de facteur (Nrf2) et inhibiteur du facteur nucléaire-κB (NF-κB). Appliquer des autres agents d’induction de TolDCs de pays en développement insulaires, tels que l’IL-10, vitamine D3, dexaméthasone ou la baie 11-7085 et modifier cette étape pour une condition optimale pour chaque agent.
  2. Ajouter 10 ou 100 ng/ml de LPS pour incubation 4-24 heures pour induire la CAM (temps d’incubation est différent en raison de la mesure d’ARNm ou protéines).
  3. Doucement le milieu de culture dans chaque puits, déposer et récolter la suspension cellulaire à l’aide de la pipette 1 ml. Centrifuger à 300 x g pendant 5 mn recueillir les cellules et le surnageant, respectivement.
  4. Analyser les ligands surfaces des granulés de cellules par cytométrie en flux, tels que les stimulateurs ligands : CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL ou ligands inhibitrices : PD-L1, L2-PD, ILT3 ILT4.
  5. Isoler l’ARN à partir des granulés de cellule et d’analyser les ARN et les échantillons surnageants pour les niveaux de profil et des gènes et des protéines de cytokine par PCR en temps réel quantitative (qRT-PCR) et ELISA, respectivement.
    NOTE : par exemple, des cytokines inflammatoires : TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 et IL-23 ou anti-inflammatoires cytokines : IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 et HO-1.

3. évaluer la fonction de TolDCs In Vitro et In Vivo

  1. Analyse de syngénique prolifération de lymphocytes T
    1. Stériliser tous les instruments chirurgicaux par autoclavage et réaliser l’expérience en classe II hotte biologique de sécurité avec les procédures de sécurité appropriées.
    2. Préparer le tampon Mac à l’aide de 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM EDTA dans 500 ml de PBS. Stériliser le tampon en le filtrant à travers un filtre de 0,2 µm.
      Remarque : Conservez le tampon sur la glace au cours de l’expérience suivante.
    3. Pour obtenir des CD4+ T cellules, euthanasier des souris transgéniques de OT-II T-cell receptor (TCR) âgés de 8 à 10 semaines à l’aide de CO2 chambre. Placez votre souris sur une planche de dissection et rincer avec de l’éthanol à 70 %. Isoler la rate du côté gauche de l’abdomen à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux.
    4. Mettre la rate avec 2 ml de PBS dans une boîte de Petri de 6 cm et utiliser l’arrière du poussoir de la seringue de 3 ml à mâcher la rate en passant une passoire de cellule 40 μm.
    5. Recueillir la suspension cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
    6. Resuspendre le culot dans 400 μl de tampon de MACS.
    7. Ajouter 100 μl de CD4+ T Cell biotine-anticorps Cocktail à 4° C pendant 5 minutes.
      Remarque : Le cocktail d’anticorps se lie sur les autres types de cellules sauf CD4 des cellules+ T, tels que CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC classe II, Ter-119 et TCRγ/δ.
    8. Ajouter 300 μl de tampon de MACS et 200 µL de perles anti-biotine (Table des matières) à 4° C pendant 10 minutes.
    9. Place la colonne composée de sphères ferromagnétiques (Table des matières) et filtre de pré-séparation ensemble dans le magnétique sur le terrain et le rincer avec 3 ml de tampon de MACS.
    10. Ajouter 9 ml de tampon de MACS dans les cellules et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
    11. Resuspendre le culot dans 3 ml de tampon de MACS et appliquez sur la colonne. Collect intermédiaires contenant CD4+ T des cellules.
    12. Laver la colonne avec un autre 3 ml de tampon de MACS et également recueillir l’accréditif.
    13. Pour obtenir DCs pan splénique, euthanasier souris C57BL/6, 8-10 semaines d’âge à l’aide de CO2 chambre. Placez votre souris sur une planche de dissection et rincer avec de l’éthanol à 70 %. Isoler la rate du côté gauche de l’abdomen à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux. Mettre la rate dans une boîte de Petri de 6cm contenant 2 ml de solution de collagènase D (collagénase de 2 mg/ml D dissous dans HBSS contenant du calcium, magnésium).
    14. Injecter 1 ml de solution de collagènase D à la rate deux fois avec une seringue de 1 ml et une aiguille 25G. Couper la rate en petits morceaux avec des petits ciseaux.
    15. Agiter et laisser incuber à température ambiante pendant 25 minutes.
    16. Ajouter 500 μl d’EDTA 0,5 M à température ambiante pendant 5 minutes.
      Remarque : Les étapes de 3.1.13-3.1.14 sont essentiels pour accroître le rendement des contrôleurs de domaine.
    17. Maintenant utiliser l’arrière du poussoir de la seringue de 3 ml à émincer la boue rate en passant une passoire de cellule 40 μm et recueillir la suspension cellulaire par centrifugation à 300 g pendant 5 mn.
    18. Resuspendre le culot dans 350 μl de tampon MACS, 50 µl de réactif de blocage de FcR et de 100 μl de Pan biotine-anticorps cellules dendritiques Cocktail à 4° C pendant 10 minutes.
      Remarque : L’anticorps cocktail contre les antigènes qui ne sont pas exprimées par les contrôleurs de domaine.
    19. Laver les cellules en ajoutant 9 ml de tampon de MACS et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
    20. Resuspendre le culot dans 800 μl de tampon de MACS et ajouter 200 µL de anti-biotine perles à 4 ° C pendant 10 minutes.
    21. Répétez les étapes de 3.1.9-3.1.11 de recueillir des contrôleurs de domaine.
    22. Laver la colonne avec un autre 3 ml de tampon de MACS deux fois et aussi recueillir l’accréditif.
    23. Traiter les 2 x 105 DCs/ml en présence ou en absence de lymphocytes T de 100 à 400 nM CDDO-Division à 37 ° C pendant 1 h séparément, étiquette le CD4+ (1 x 107/ml) avec 1 μM CFSE à 37 ° C pendant 15 minutes, laver avec du PBS et réajuster le volume pour obtenir la concentration finale de 2 x 106 T cellules/ml.
    24. Ensuite, dans une plaque à 96 puits, co-culture 100 μl des cellules dendritiques traitées avec le même volume de CD4 marqué CFSE+ T cells, tous deux prélevés dans les étapes ci-dessus pour obtenir 01:10 ratio. Maintenant ajoutez 100 ng/mL le peptide d’ovalbumine (OVA) 323-329 par puits et mesure l’intensité CFSE des cellules T par cytométrie en flux après 2-3 jours d’incubation.
      Remarque : Le nombre de cellules et le rapport des contrôleurs de domaine et T ont été optimisés en cellules de nos précédents travaux37.
  2. Induire le passif EAE en injectant BMDCs pulsé avec la myéline Oligodendrocyte glycoprotéine (MOG) (35-55)
    1. Plaque de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml par puits de 6 puits-plaque avec milieu de culture en présence ou en absence de 100 à 400 nM CDDO-Division pour incubation 1hr.
    2. Ajouter 10 ng/ml de LPS pour incubation 24 hrs.
    3. Ajouter 100 μg/ml de MOG (35-55) pour incubation 4 hrs.
    4. Récolter la suspension cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
    5. Resuspendre le culot cellulaire avec du PBS et compter les cellules.
    6. Injecter par voie sous-cutanée de 200 μl de 2 x 106 cellules à des souris C57BL/6 femelles âgés de 8 à 10 semaines (100 μl dans chaque patte arrière).
    7. Le jour de l’injection de BMDC et 48 heures. plus tard, injecter 200 ng de la toxine coquelucheuse (PTX) dans chacune des souris.
    8. Répétez les étapes 3.2.6-3.2.7 une fois par semaine pendant 4 semaines consécutives.
    9. Évaluer les symptômes cliniques de l’EAE quotidiennement en utilisant les critères standard37 (0,5 limp queue, queue 1-boites, faiblesse modérée 2 patte, patte 3 grave faiblesse, paralysie de la patte 4-complet, état 5-quadriplégie ou moribond, 6-mort).

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Results

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La différenciation et la sélection de BMDCs :

Cellules souches de la moelle osseuse ont été cultivés en milieu RPMI complet en présence de GM-CSF et d’IL-4 à se différencier en pays en développement insulaires pendant 7 jours (Figure 1 a). Jour 1, les cellules ont de petite taille et morphologie sphérique. Laver avec du PBS avant le remplacement du milieu frais le jour 3 aidé des ce...

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Discussion

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Cet article décrit un protocole efficace qui peut être utilisé pour reproductible pour générer des pays en développement insulaires et à les différencier par la suite dans TolDCs, et nous proposons que cela peut servir à évaluer la capacité des nouveaux agents de la cible moléculaire pour induire la TolDC phénotype. Comme décrit dans le présent rapport, nous avons suivi une séquence dans laquelle nous avons tout d’abord analysé TolDC expression de ligands surfaces par cytométrie en flux, suivie d’une évaluation du profil...

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Reata Pharmaceuticals pour la fourniture de CDDO-Division. Nous reconnaissons également l’appui de la Jane et Lee Seidman Chaire Innovation de Cancer pédiatrique (John Letterio). Ce travail a été soutenu par le ministère de la défense [W81XWH-12-1-0452] ; l’Initiative de recherche Cancer adultes Angie Fowler adolescents et les jeunes au cas Comprehensive Cancer Center ; et le diplômé Callahan Scholar Award pour Wei Hsi-Ju de F.J. Callahan Foundation.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CDDO-DFPA (RTA-408)Reata Pharmaceuticalsen synthèse maisonCulture cellulaire
Souris GM-CSFPeprotech Inc.315-03Différenciation BMDC
Souris IL-4Peprotech Inc.214-14Différenciation BMDC
Lipopolysaccharides (LPS)Sigma Aldrich Inc.L2880Culture cellulaire
&bêta-mercaptoéthanolSigma Aldrich Inc.516732Culture cellulaire
Toxine coquelucheuse (PTX)R& D systems3097EAE
induction MOG (35&ndash ; 55) peptide21stCentury Biochemicalsin house synthesisEAE
induction Trypan blueGibco, Life Technologies15250-061Culture cellulaire
RPMI-1640 plus L-glutamineThermoFisher Scientific11875-093Culture cellulaire
Acide aminé non essentiel (100X)ThermoFisher Scientific11140050Culture cellulaire
HEPESThermoFisher Scientific15630080Culture cellulaire
pénicilline/streptomycineThermoFisher Scientific15140122Culture cellulaire
40 μ ; Filtre cellulaire mCorning352340Isolement cellulaire
PE conjugué CD80BD Biosciences557227Cytométrie en flux
PE conjugué CD86BD Biosciences555665Cytométrie en flux
PE conjugué-L1BioLegend124307Cytométrie en flux
APC conjugué MHCIIMiltenyi Biotec Inc.130-112-388Cytométrie en flux
CD11c conjuguée APCBD Biosciences340544Cytométrie
en flux Isotype apparié PEMiltenyi Biotec Inc.130-091-835Cytométrie en flux
Isotype apparié APCMiltenyi Biotec Inc.130-091-836Cytométrie en flux
CFSEBioLegend423801Essai de prolifération des lymphocytes
T Kit d’isolement de cellules pandritiquesMiltenyi Biotec Inc.130-100-875Essai de prolifération des lymphocytes T
Réactif bloquant FcRMiltenyi Biotec Inc.130-100-875Essai de prolifération des lymphocytes T
Cocktail de biotine-anticorps à base de cellules dendritiquesPan Miltenyi Biotec Inc.130-100-875Essai de prolifération des lymphocytes T Microbilles
anti-biotineMiltenyi Biotec Inc.130-100-875Essai de prolifération des lymphocytes
T CD4+ Kit d’isolement des lymphocytesT Miltenyi Biotec Inc.130-104-454Essai de prolifération des lymphocytes
T CD4+ Cocktail de biotine-anticorpsMiltenyi Biotec Inc.130-104-454Essai de prolifération des lymphocytes T Microbilles
anti-biotineMiltenyi Biotec Inc.130-104-454Essai de prolifération des lymphocytes T Tampon
de lyse ACKThermoFisher ScientificA1049201Différenciation BMDC
1 ml seringueBD Biosciences309626Essai de prolifération des lymphocytes T
3 ml SeringueBD Biosciences309588Différenciation BMDC
25G aiguilleBD Biosciences309626Essai de prolifération des lymphocytes T
Aiguille 23GBD Biosciences309588BMDC différenciation
BSASigma Aldrich Inc.A2058Essai de prolifération des lymphocytes
T EDTAThermoFisher Scientific15575020Essai de prolifération des lymphocytes T
LS ColumnMiltenyi Biotec Inc.130-042-401Essai de prolifération des lymphocytes T
Filtre de pré-séparationMiltenyi Biotec Inc.130-095-823Essai de prolifération des lymphocytes T
collagénase DSigma Aldrich Inc.11088858001Essai de prolifération des lymphocytes T
HBSSThermoFisher Scientific14025076Essai de prolifération des lymphocytes T
peptide d’ovalbumine (OVA) 323&ndash ; 329Sigma Aldrich Inc.O1641Essai de prolifération des lymphocytes T
Souris IFN-&gamma ; Sonde TaqManThermoFisher ScientificMm01168134_m1qRT-PCR
Souris IL-12a Sonde TaqManThermoFisher ScientificMm00434165qRT-PCR
Souris IL-12 p70 DuoSet ELISAR& D systemsDY419-05ELISA
Souris EDN-1 ELISARayBiotechELM-EDN1-1ELISA
TNF-&alpha ; Sonde TaqManThermoFisher ScientificMm00443258qRT-PCR
Souris TNF-&alpha ; Kit ELISA QuantikineR& D systemsMTA00BELISA
IL-6 TaqMan sondeThermoFisher ScientificMm00446190qRT-PCR
Souris IL-6 Quantikine ELISA KitR& D systemsM6000BELISA
IL-23A Sonde TaqManThermoFisher ScientificMM01160011qRT-PCR
Souris IL-23 DuoSet ELISAR& D systemsDY1887-05ELISA
IL-4 Sonde TaqManThermoFisher ScientificMm99999154_m1qRT-PCR
IL-10 Sonde TaqManThermoFisher ScientificMm01288386_m1qRT-PCR
TGF-&beta ; Sonde TaqManThermoFisher ScientificMm01178820_m1qRT-PCR
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Anticorps anti-&bêta ;-actineAbcamab8226Western blot
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