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Article de méthode

Induction de Syndrome néphrotique chez la souris par Injection rétrooculaire de la doxorubicine et la prévention de la rétention de Volume par LIBERATION PROLONGEE aprotinine

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DOI :

10.3791/57642

⸱

6 mai 2018

 , 
1Department of Internal Medicine, Division of Endocrinology, Diabetology, Vascular Disease, Nephrology and Clinical Chemistry, University Hospital Tübingen, 2Institute of Diabetes Research and Metabolic Diseases (IDM) of the Helmholtz Center Munich, University Tübingen, 3German Center for Diabetes Research (DZD), University Tübingen

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici l’induction de syndrome néphrotique expérimental chez la souris 129S1/SvImJ par injection rapide rétrooculaire de la doxorubicine. Nous traitons également néphrotiques souris avec des boulettes de libération prolongée contenant aprotinine pour inhiber l’activité de la protéase sérine urinaire et prévenir la rétention sodée.

Résumé

Syndrome néphrotique est la manifestation la plus extrême de la maladie rénale protéinurie et caractérisée par la forte protéinurie, hypoalbuminémie et œdème dû à une rétention de sodium et l’hyperlipidémie. Afin d’étudier la physiopathologie de ce syndrome, rongeur modèles ont été développés basée sur l’injection de substances toxiques comme la doxorubicine podocyte endommageant. Chez les souris, seulement quelques souches sont sensibles à ce modèle. Chez les souris de type sauvage de 129S1/SvImJ, l’administration de la doxorubicine par une injection intraveineuse rapide pour le sinus rétrooculaire induit un syndrome néphrotique expérimental qui présente tous les symptômes de la maladie humaine, y compris l’oedème et la rétention de sodium. Après l’apparition d’une protéinurie, pièce souris augmenté activité de protéase de sérine urinaire qui aboutit à l’activation du canal sodique épithélial (ENaC) et rétention sodique. Inhibition pharmacologique des protéases à sérine urinaire par le traitement avec LIBERATION PROLONGEE aprotinine abroge l’activation de l’ENaC et empêche la rétention sodée. Ce modèle est idéal pour étudier la physiopathologie de la proteasuria, i.e., l’excrétion des protéases à sérine active qui provoquent l’activation de l’ENaC de la protéolyse de la sous-unité γ. Cela peut être considéré comme le principal mécanisme d’activation de l’ENaC et rétention sodique dans la maladie de rein albuminuriques.

Introduction

Syndrome néphrotique est caractérisé par l’hyperlipidémie, hypoalbuminémie, œdème et protéinurie lourde et peut être considéré comme la manifestation la plus extrême de la maladie rénale protéinurie. Chez les rongeurs, syndrome néphrotique expérimental peut être induit par une injection unique d’anthracyclines ou puromycine qui entraîne des dommages podocyte et ressemble à la maladie humaine changement minimal et glomérulosclérose segmentaire (FSG)1. Après sa première description en 1955 par Frenk et al. 2, néphrose de nucléosides de puromycine (PAN) chez le rat est devenu un modèle standard pour enquêter sur la pathophysiologie du syndrome néphrotique dans nombreuses études3,4,5,6. Chez la souris, le modèle correspondant peut être induit par les anthracyclines doxorubicine7. Cependant, il y a une forte dépendance-souche génétiquement déterminé par au moins deux loci génétiques8. En outre, il y a des différences dans la réponse de protéinurie et cours du syndrome néphrotique9,10. En utilisant 129S1/SvImJ souris et une injection intraveineuse rapide de la doxorubicine via le sinus rétrooculaire, réponses de protéinurie atteignent des valeurs qui sont suffisants pour induire les caractéristiques typiques du syndrome néphrotique, particulièrement des rétention de volume caractérisée par ascite et presque sans sodium urinaire7. Rétention de sodium dans le syndrome néphrotique expérimental a été présumée être le résultat de l’activation du canal sodium épithélial (ENaC) dans le tubule distal par des protéases de sérine aberrantly filtrée comme la plasmine provoquant la protéolyse de la sous-unité γ4 ,11,12. Récemment, ce concept a été prouvé chez les souris néphrotiques étaient protégés du protéolytique ENaC activation et rétention sodée par traitement avec l’aprotinine d’inhibiteur de protéase sérine qui était tout aussi efficace que l’ENaC bloqueur amiloride13. Afin d’assurer la distribution en continu pour le tubule distal, aprotinine a été administré par l’intermédiaire de granulés à libération prolongée par voie sous-cutanée implantée. Les études à venir sont tenus d’identifier les protéases à sérine qui sont responsables de l’activation protéolytique de ENaC dans le syndrome néphrotique qui semble parallèle à la situation de l’homme. À cette fin, un syndrome néphrotique induite par la doxorubicine est un modèle précieux qui peut être utilisé chez les souris de type sauvage ou élargi à des souris génétiquement modifiées. Ses avantages sont le faible coût du médicament, moins complexe, de gestion et de la bonne reproductibilité14.

Dans cet article, nous démontrons l’induction de syndrome néphrotique expérimental par injection intraveineuse rapide de doxorubicine pour le sinus rétrooculaire et l’implantation de pellets de libération prolongée contenant aprotinine pour inhiber la protéase de sérine urinaire activité mesurée avec un dosage chromogénique.

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Protocole

Toutes les méthodes ont été réalisées selon les instituts nationaux de Guide de santé pour les soins et utilisation des animaux de laboratoire et la législation allemande pour le bien-être des animaux, et elles ont été approuvées par les autorités locales (Regierungspräsidium Tübingen).

1. l’induction de Syndrome néphrotique expérimental par Injection de doxorubicine pour le Sinus rétrooculaire

  1. Préparez une seringue 0,5 mL avec une canule de 30G monté en marquant la butée du piston.
  2. Calculer le volume d’injection de la doxorubicine pour mâle (7,25 µL/g poids corporel (PC) égale à la doxorubicin bw 14,5 µg/g) et les souris femelles (6.9 µL/g p.c. égal à 13,8 doxorubicine de bw µg/g) selon le poids du corps depuis le matin.
    Remarque : La dose donnée convient pour l’induction de syndrome néphrotique. Des modifications mineures en posologie conduisent à un cours différent crucial de la néphropathie, atteint d’une maladie rénale chronique légère avec seulement de petits changements dans le taux de filtration glomérulaire (doxorubicine de bw 12,6 µg/g) d’insuffisance rénale aiguë insuffisance (doxorubicine de bw 15,4 µg/g)7, 15.
  3. Réchauffer la quantité calculée de doxorubicine solution (2 µg/µL) dans une chambre chaude à 37 ° C.
    ATTENTION : La doxorubicine est nocive si avalé et peuvent causer le cancer. Toujours porter des gants si vous travaillez avec la doxorubicine et éviter tout contact avec la peau.
  4. Pré-remplir la seringue avec la solution de doxorubicine jusqu’au point de marquage et de régler la balance à zéro. Remplir la seringue avec le volume d’injection et vérifier le volume de la seringue de pesage.
  5. Narcotize la souris profondément avec 5 vol % isoflurane à l’aide d’un vaporisateur et le débit d’oxygène de 2 L/min.
    1. N’utilisez pas de pommade sur les yeux avant l’injection. L’opérateur a besoin d’une vision claire de la cavité orbitale pour effectuer une injection rétrooculaire sûre et réussie.
    2. Évaluer le niveau de l’anesthésie par réflexe pédale et ajuster les anesthésique livraison si nécessaire avant de commencer l’injection.
  6. Placez la souris à un décubitus latéral droit avec le dos tourné vers le corps de l’opérateur et sa tête face à main injection de l’opérateur.
    Remarque : La procédure est décrite pour un droitier, gaucher personnes exécutant l’injection avec la main gauche, il est plus facile de faire la position et injection inversée à droite à gauche.
  7. Saillie avec soin oculaire gauche de la souris de l’orbite en appliquant une pression douce sur la peau, dorsale et ventrale à le œil.
  8. Perforation du sinus gauche rétrooculaire sous l’angle de le œil intérieur (commissure palpébral médial). Éviter tout contact avec le globe oculaire mouse´s.
  9. Légèrement inclinez la seringue et injecter un volume entier en une seule fois. Assurez-vous que le volume est injecté sans résistance et sans aucun signe d’extravasation tels qu’exopthalmus ou fuite au site d’injection.
  10. Étant donné que la doxorubicine est une substance hautement toxique, vérifier bien-être au moins une fois par jour à l’aide d’une feuille de pointage selon Morton et Griffiths et al. 16 et payer une attention particulière au site d’injection. Si des signes d’extravasation aiment exopthalmus, fermeture de la paupière avec facultés affaiblies ou n’importe quel signe de nécrose comme occure de lésions cutanées ou un gonflement après injection ou dans les jours qui suivent la souris doit être euthanasiée.

2. implantation de Pellets de libération prolongée contenant aprotinine

  1. Commander des granulés avec la dose voulue par durée de jour et communiqué à l’avance. Dans le cas d’aprotinine, choisissez une dose de 1 mg par jour d’être libéré sur une période de 10 jours.
    Remarque : Dans cette étude, les granules d’aprotinine contient une dose de 10 mg.
    1. Stocker les granulés dans des conditions sèches et d’éviter toute exposition à l’humidité.
  2. Préparer les éléments nécessaires pour la chirurgie, y compris une paire de ciseaux de cheveux, une paire de ciseaux de préparation de la peau, un scalpel, pinces chirurgicales, deux paires de pinces de tissu, un porte-aiguille et la 15 cm monofile suture non résorbable.
    1. Stérilisation des instruments à l’aide d’un stérilisateur à chaleur pendant 5 min à 240 ° C. Avant d’utiliser les instruments, attendre 5 min avant d’avoir atteint la température de la pièce.
      1. Eviter tout contact des conseils instrument stérilisé aux surfaces non stériles.
      2. Éviter les brûlures par des instruments chauds.
  3. Narcotize souris avec l’isoflurane 5 % suivie de 1,5 % en volume à l’aide d’un vaporisateur et oxygène débit de 2 L/min.
  4. Placez votre souris dans une position couchée sur un dispositif de réchauffement recouverte d’une couche de gaze pour éviter des blessures thermiques à la souris. Température de surface est d’environ 37 ° C.
  5. Protéger les yeux avec l’onguent.
  6. Enlever les poils sur le milieu dans une superficie d’environ 0,5 cm2 à l’aide de ciseaux ou une tondeuse à cheveux et désinfecter la peau glabre avec un désinfectant approprié pour la désinfection de la peau. Supprimer le moins de cheveux que possible afin qu’il reste plus difficile pour la souris atteindre la plaie et le thread se termine plus tard et pour maintenir la température du corps.
  7. Inciser la peau glabre avec un scalpel dans un sens cranio-caudale dans une longueur d’environ 5 mm. préparer une pochette latérale gauche d’environ 1 cm de profondeur dans le tissu conjonctif sous-cutané en utilisant une préparation émoussée.
    1. Évaluer le niveau de l’anesthésie par réflexe pédale et ajuster les anesthésique livraison si nécessaire avant de commencer la chirurgie.
  8. Insérez un pellet de sortie de 10 jours dans la pochette latérale gauche préparée, avec une pincette tissu stérile. Laissez le culot en bas de la poche en position plane.
    1. Eviter tout contact de la pastille de fluide et de l’humidité jusqu'à placé dans la pochette préparée.
  9. Fermer la peau avec des sutures de 2-3. Quitter le filetage très court afin de rendre plus difficile pour la souris ouvrir les sutures en rongeant.
  10. Placez les souris individuellement pour réduire la détresse postopératoire et empêche l’ouverture de la suture en rongeant. Garder en vue la souris jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante après la narcose.
    Remarque : Il est inutile pour la gestion de la douleur postopératoire étant donné que cette intervention est bien tolérée sans aucun signe d’inconfort ou de douleur. Sinon, nous vous recommandons les analgésiques topiques, par exemple une goutte de bupivacaïne sur l’incision avant la fermeture qui fournirait jusqu'à 8 h d’analgésie.

3. évaluation pour modèle Induction, signes de Syndrome néphrotique et bien-être

  1. Recueillir des urines du matin (08:00) dans une tasse de réaction (1,5 mL) tous les jours de la journée de l’injection en massant la vessie.
    1. Mesurer une protéinurie à l’aide d’analyse de protéine de Bradford et normaliser à la créatinine.
      Remarque : Pour l’induction du syndrome néphrotique, protéinurie doit atteindre un seuil de 120 mg/mg de créatinine entre 7 et 10 jours après l’injection de la doxorubicine.
  2. Coup d’oeil pour le développement de l’ascite. Cocher pour l’augmentation de la circonférence abdominale ou flancs surplombantes.
  3. Peser la souris, les boulettes de nourriture et la boisson bouteille dans la matinée (08:00) tous les jours.
  4. Vérifiez bien-être au moins une fois par jour en utilisant une feuille de pointage selon Morton et Griffiths et al. 16

4. mesure de protéase de sérine urinaire avec un dosage chromogénique

  1. Préparer la solution de travail substrat en ajoutant 15 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à une bouteille de 25 mg de substrat chromogène lyophilisé S-2251, ce qui donne une concentration de 2 mM. Dissoudre l’aprotinine dans du PBS pour obtenir une solution d’aprotinine avec une concentration de 2 mg/mL.
    1. Stocker des solutions préparées à-20 ° C. Cela ralentit considérablement l’auto-dégradation de S-2251. N’utilisez pas de vieilles solutions avec une forte teinte de jaune.
  2. Utiliser la solution de travail substrat fraîchement préparé ou décongelées et le réchauffer dans une chambre de chaleur de 37 ° C.
  3. Décongeler les échantillons d’urine à la température ambiante.
    1. Prévenir la dégradation de la protéase en évitant le dégel répétés et la congélation. Conserver les échantillons d’urine à-20 ° C.
  4. Utiliser une plaque 96 puits microwell pour la mesure photométrique. Ajouter 3 µL d’urine non dilué dans chacune des deux puits et ajouter 50 µL de solution de travail substrat avec 3 µL de solution de PBS ou aprotinine dans les puits. Couvrir la plaque avec un film adhésif.
  5. Incuber la plaque de microtitration couverte pendant 60 minutes dans une chambre de chaleur de 37 ° C.
  6. Mesurer la densité optique de chaque puits à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaques.
  7. Prendre la différence entre le diamètre extérieur sans aprotinine et aprotinine comme l’activité urinaire aprotinine sensibles sérine protéase.
    Remarque : Mesure d’un échantillon apparié avec et sans l’aprotinine augmente la spécificité du test car le substrat puisse également être clivé par des autres protéases qui ne jouent pas un rôle physiopathologique.

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Résultats

Après l’induction de la narcose isoflurane, doxorubicine a été rapidement injectée via le sinus gauche rétrooculaire. La totalité du volume de 7,25 µL/g poids corporel a été injecté sans aucune résistance et prouver l’extravasation corriger emplacement par voie intraveineuse de la canule. La souris récupéré de narcose rapidement et n’avaient aucun réduite ce jour-là et par la suite. En particulier, il n’y avait aucun signe de dommages à l’oeil gauche. Après doxorubicine injection, fluide ...

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Discussion

Ici, nous démontrons que doxorubicine injectable par injection de sinus rétrooculaire induit un syndrome néphrotique expérimental chez la souris 129S1/SvImJ avec protéinurie, rétention sodique, hypoalbumenia et l’hyperlipidémie. Cependant, il y a deux questions cruciales qui doivent être prises en compte lors de l’utilisation de ce modèle. Tout d’abord, la modèle induction est strictement dose-dépendante et déviations de dose doxorubicine aussi petite que 0,3 µg/g affectent la réponse de la souris15

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été financée par une subvention de la Fondation de recherche allemande (DFG, AR 1092/2-1).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
fournitures
BD Micro FINE + U-40 (0,30 mm x 8 mm)BD Deutschland GmbH, Heidelberg, AllemagnePZN : seringue 07468060
ETHILON*II (5/0, 16 mm, 3/8c, 45 cm)Johnson& Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Allemagne)EH7823Hsuture
NomSociétéNuméro de catalogueComments
réactifs
aprotinin (6000 KIU/mg)LOXO, Heidelberg, AllemagneCAS 9087-70-1
Bepanthen, Augen- und NasensalbeBayer Vital GmbH, Leverkusen, AllemagnePZN : Pommade 1578681
Chromogenix S-2251HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, Essen, Allemagne82 0332 39substrat chromogène
doxorubicine (2.0 µ ; g/µ ; L)Cell Pharm, Bad Vilbel, AllemagneCAS 25316-40-9doxorubicine
isofluran CP (1 mL/mL)CP-Pharma, Burgdorf, AllemagneCAS 26675-46-7d’isofluran
à libération prolongée entraînée par matrice (sur mesure)Innovative Research of America, Sarasota, FLX-999pellet
NameCompanyNuméro de catalogueComments
equipment
ELx808 Absorbance MikroplateReader BioTek, Bad Friedrichshall, GermanyELx808lecteur de microplaques
MICROSTERIL - 436B.M.S., Trescore Balneario, ItalyGAL/436stérilisateur
Four d’hybridation/ shakerGE Healthcare UK Limited, Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, UKRPN 2511chambre chauffante
Thermo MAT Pro 10 W, 15x25 cm, Lucky ReptileImport Export Peter Hoch GmbH, Waldkirch, Allemagne61201dispositif de réchauffement de souris
pastilles

Références

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