Techniques de micromanipulation permettant l’analyse de la dynamique morphogénétique et chiffre d’affaires des organismes de réglementation du cytosquelette

Summary

Les auteurs décrivent comment les techniques micro - et photomanipulation comme FRAP et photoactivation permettent la détermination des paramètres de la motilité et la dynamique spatio-temporelle des protéines au sein de la migration des cellules. Afficheurs expérimentales incluent dynamique subcellulaire et chiffre d’affaires de régulateurs de la motilité ou du cytosquelette d’actine sous-jacent.

Abstract

Examen de la dynamique spatio-temporelle des protéines peut révéler leur importance fonctionnelle dans des contextes variés. Dans cet article, il est discutée comment fluorescente récupération après photoblanchiment (FRAP) et techniques de photoactivation peut être utilisée pour étudier la dynamique spatio-temporelle des protéines dans des endroits subcellulaires. Nous montrons aussi comment ces techniques permettent de simple détermination de différents paramètres liés à l’actine du cytosquelette règlement et cellule la motilité. En outre, la microinjection des cellules est en outre décrite comme traitement alternatif (potentiellement précédant ou à compléter les techniques précitées photomanipulation) à déclenchement instantané effets des protéines transloqués sur cellule morphologie et la fonction. Micromanipulation tels que l’injection de protéines ou de l’application locale de médicaments perméable à la membrane plasmique ou inhibiteurs du cytosquelette peut servir comme un outil puissant pour enregistrer les conséquences immédiates d’un traitement donné sur le comportement de la cellule à la cellule unique et subcellulaire niveau. Ceci est illustré ici par induction immédiate de saillie de bord lamellipode cellulaire par l’injection d’une protéine recombinante Rac1, tel qu’établi un quart de siècle il y a. En outre, nous fournissons un protocole permettant de déterminer le chiffre d’affaires de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP)-VASP, une polymérase de filament d’actine s’accumulant en bonne place au lamellipode conseils de cellules B16-F1, employant FRAP et y compris les données associées analyse et ajustement de courbe. Nous présentons également des lignes directrices pour l’estimation des taux de polymérisation de réseau l’actine lamellipode, comme exemplifié par les cellules exprimant EGFP émetteurs β-actine. Enfin, les instructions sont données pour savoir comment étudier les taux de mobilité de monomère de l’actine dans le cytoplasme de la cellule, suivi par incorporation d’actine sur les sites d’assembly de filament rapide, tels que les conseils de lamellipodia, en saillie à l’aide de photoactivation approches. Aucun de ces protocoles est limitée aux composants ou régulateurs du cytosquelette d’actine, mais peut facilement être étendu pour explorer de façon analogue la dynamique spatio-temporelle et fonction des protéines dans diverses différentes structures subcellulaires ou fonctionnelles contextes.

Introduction

Suivi de la dynamique spatio-temporelle des protéines et autres molécules dans les cellules vivantes est devenu un outil indispensable dans de nombreux domaines de la biologie cellulaire et moléculaire. Des techniques de microscopie y compris le transfert d’énergie de fluorescence par résonance (FRET) et durée de vie de fluorescence frette (frette-FLIM) d’imagerie avancées fluorescence, ou permettre de FRAP, perte de fluorescence au photoblanchiment (FLIP) et photoactivation ainsi que beaucoup d’autres pour le temporel et spatial suivi des interactions protéine-protéine, changements de conformation, ainsi que la détermination de la cinétique de diffusion et de la localisation des différentes protéines dans la cellule^1,2. PAF et photoactivation techniques, en particulier, sont largement applicables pour l’examen de la réglementation de l’actine cytosquelette et la migration cellulaire. Ces techniques peuvent être appliquées seul ou en combinaison avec des techniques de micromanipulation supplémentaires telles que la microinjection³et impliquent l’expression de protéines marquées fluorescent. Ils permettent l’estimation de la cinétique de l’association de la protéine riche en actine structures impliquées dans la migration cellulaire, tels que les filopodes ou lamellipodia, le chiffre d’affaires de protéines dans les adhérences focales⁴, ou ramifiées actine réseaux⁵. Elles permettent aussi la détermination des taux de polymérisation de l’actine lamellipode, l’évaluation de la dispersion de l’actine monomérique dans le cytosol, le taux de translocation monomère subcellulaire actine à la polymérisation des filaments d’actine en saillie lamellipodia⁶et autres paramètres.

FRAP est une méthode pour visualiser et quantifier la mobilité des protéines dans une cellule vivante, développé à l’origine dans les années 1970 par Axelrod⁷. Une région d’intérêt (ROI) dans une cellule, peuplée de protéines marquées fluorescent, transitoirement subit un laser de haute intensité, suffisante pour causer la décoloration des molécules fluorophore présents dans cette région pendant une courte période donnée. Les écrus, fluorescent étiqueté protéines situés à l’extérieur le ROI pendant le blanchiment, diffuse et s’infiltrer dans la région blanchie selon leur dynamique spatio-temporelle, causant le déplacement des molécules de photobleached au fil du temps. Le taux de récupération de fluorescence dans les régions blanchies dépend de divers facteurs, dont la taille et le taux de diffusion d’une molécule donnée, et bien sûr son taux de chiffre d’affaires au sein de la putative associés structure blanchie. Ainsi, les protéines solubles va arbitrer la récupération de la fluorescence dans le retour sur investissement blanchie rapidement par le biais de diffusion, tout en protéines étroitement associées aux structures, telles que les adhérences focales, auront plus longs temps de renouvellement, ainsi que leur récupération de fluorescence reposent tous deux sur la diffusion de la fraction soluble de la protéine et dissociation-association cinétique de la fraction de structures liées. Récupération de la fluorescence est généralement acquise et quantifiée jusqu'à atteindre le niveau initial d’eau de Javel avant intensité de fluorescence. Toutefois, cela ne fonctionne pas si une partie de l’intensité de la fluorescence initiale appartient à la fraction dite immobile qui ne peut être réapprovisionné par diffusion ou est régénératrice à des taux très faibles par rapport à la majorité des molécules contenant le mobile fraction. Pour déterminer le taux de renouvellement des protéines, FRAP courbes sont générées, ce qui représente la mesure de la récupération de la fluorescence au fil du temps. Partir de ces courbes de récupération, moitié-délais moyens de récupération de protéines peuvent être calculées. En créant des ajustements de la courbe des données moyennes de FRAP et des analyses par conséquent mathématiques, il est également possible d’en déduire que le taux de roulement moyen de la fraction mobile constitue un composite d’une population homogène de molécules, ou si elle est composée de deux ou plusieurs sous-populations de molécules en retournant au taux différentiels. En plus d’estimer les taux de renouvellement des protéines par des approches quantitatives, la récupération des régions de photobleached en lamellipodia de suivi peut aussi permettre pour une quantification précise des paramètres motilité lamellipode comme flux rétrograde, saillie, et taux de polymérisation de l’actine. Ainsi, FRAP constitue un outil polyvalent pour s’appliquer pour l’évaluation des différents paramètres au sein des structures de cellules vivantes.

Photoactivation est une méthode utilisée pour suivre la diffusion et la mobilité des protéines ou des molécules provenant d’un endroit désigné cellulaire. La technique emploie, par exemple, une variante du type sauvage protéine fluorescente verte (GFP), initialement développé par Patterson et Lippincott-Schwartz⁸, qui est muté d’une manière qui permet sa fluorescence d’augmenter fortement exposés à la la lumière ultraviolette (UV) (environ 400 nm ; ici, 405 nm). Tel que décrit par Patterson et al., chromophores GFP sauvage existent comme une population mixte de phénols neutres et anioniques phénolates, produisant un pic d’absorption importante à environ 397 nm et un mineur à 475 nm, respectivement. Lors de l’irradiation de la protéine avec lumière UV, la population subit photoconversion, oriente vers la forme anionique. Lorsqu’il est excité par 488 nm, la protéine photoconverted/photoactivation montre une augmentation de 3 voies en fluorescence, insuffisante dans la pratique pour faire la distinction entre activé et non activé GFP en raison de la fluorescence de fond intrinsèque élevée. Toutefois, une diminution de l’intensité de l’arrière-plan est parvenue en introduisant une mutation seul acide aminé dans la séquence de la GFP (substitution d’histidine en position 203). Le mutant T203H qui en résulte, également connu comme photoactivatable-GFP (PA-GFP) se caractérise par une réduction significative de l’absorption du pic mineur, qui, après irradiation par les rayons UV, est augmentée de près de 100 fois lorsqu’il est excité par la suite par la lumière 488 nm. Surexpression de protéines PA-GFP-tag est donc une approche largement utilisée, qui permet la détermination de la diffusion et la motilité des molécules dans les cellules. Nous avons déjà appliqué actine PA-GFP-étiquetée pour déterminer le taux de dispersion des monomères d’actine hors régions cytosoliques, permettant non seulement l’exploration de leur mobilité dans le cytosol, mais aussi leur taux d’incorporation dans le saillant actine lamellipode réseau⁶. La littérature plus récente décrit également les protéines roman, photo-convertible qui peuvent en principe être utilisés d’une manière analogue, mais ayant l’avantage potentiel pour être visible déjà avant conversion photo. Exemples pour ce groupe de protéines fluorescentes : Dendra2 et mEos2^9,10,11,12.

Dans cet article, nous expliquons la méthodologie des cellules microinjecting avec des protéines. Nous expliquons plus loin comment cette technique peut être combinée avec FRAP, par photoblanchiment protéines impliquées dans le règlement de l’actine cytosquelette et la motilité, et comment les courbes FRAP et temps de récupération des fractions mobiles peuvent être dérivées. En outre, nous fournissons un exemple de comment la technique de PAF peut être utilisée pour déterminer le taux de polymérisation d’actine des réseaux lamellipode. Nous fournissons également des instructions et des conseils sur la façon d’effectuer des expériences de photoactivation, qui peuvent être utilisés pour déterminer le taux d’incorporation de l’actine dans lamellipodia et mobilité cytosolique de l’actine monomérique. Ces techniques, bien sûr, ne sont pas seulement limitées à suivi des composants de l’actine cytosquelette, mais potentiellement nécessaire adaptation modérée ou d’optimisation, peut être largement appliquée à d’autres types de cellules ou d’enquêter sur les différentes protéines, structures, et paramètres.

Protocol

1. lamelle couvre-objet lavage et la stérilisation

1. Immerger les verres de couverture de 15 mm (diamètre) (no.1) dans un ballon jaugé de 500 mL contenant un mélange de 40 mL 37 % HCl et 60 mL 100 % EtOH (pas plus de 100 lamelles par 100 mL de solution de lavage).
   Remarque : même si fraîchement acheté, lamelles doivent être rigoureusement nettoyés avant d’ensemencer les cellules sur leurs surfaces. C’est parce qu’ils peuvent contenir des couches minces de graisse, qui sont macroscopiquement invisible, mais qui peuvent interférer efficacement avec l’adhérence et la diffusion appropriée des cellules vivantes. Considérant que des films peuvent être efficacement éliminés avec les solutions contenant de l’acide ou de base (voir Fischer et al. ( ¹³), nous utilisons systématiquement le mélange acide/alcool décrit ci-dessus.
2. Agiter le flacon contenant les verres de couverture pendant 30 min sur un agitateur de rotation. Choisissez une vitesse qui permet des couvrir de verres être tourbillonné librement, mais ralentir suffisamment pour éviter la rupture fréquente. La solution pour enlever les morceaux de verre brisé si réutilisant le filtrat.
3. Transférer les verres de couverture dans une fiole contenant au moins 200 mL d’eau stérile et incuber sur un agitateur de rotation, tout en remplaçant plusieurs fois l’eau jusqu'à ce que l’odeur acide a disparu. Plusieurs lavages pendant plusieurs heures sont recommandés pour éliminer complètement les traces de HCL-EtOH.
4. Sécher les verres individuels de couverture sur une feuille de papier filtre.
5. Place les verres de couverture au fond d’un plat de Pétri de 10 cm (diamètre) recouvert de papier filtre et la chaleur sèche-stériliser. Évitez d’autoclavage car cela provoquerait des verres de couverture pour se serrer les coudes.

2. traitement des cellules, Transfection et l’ensemencement sur lamelles couvre-objet

1. Cultiver des cellules de mélanome B16-F1 souris selon les conditions de culture cellulaire standard en DMEM (4,5 g/L de glucose) contenant du sérum de veau foetal de 10 %, 2 mM de glutamine et 1 % la pénicilline-streptomycine à 37 ° C, 7 % CO₂.
2. La croissance de cellules fibroblastes NIH3T3 pour microinjections selon les conditions de culture cellulaire standard (culture de tissu incubateur à 37 ° C, 7 % CO₂) DMEM (4,5 g/L de glucose) contenant 10 % sérum de veau fœtal, pyruvate de sodium 1 mM, x 1 acides aminés non-essentiels MEM , 2 mM de glutamine et 1 % la pénicilline-streptomycine.
3. Pour transfections, la croissance de cellules B16-F1 à la confluence de 100 % dans un plat de 10 cm et le passage à un ratio de 1:5 dans un plat en plastique de 3 cm (diamètre).
4. Le même jour, après que les cellules B16-F1 ont été autorisés à se conformer pendant au moins 6 h, transfecter à 500 ng/plat de photoactivatable PA-GFP-actine ou ADN plasmidique β-actine EGFP-étiquetée. Pour transfections Co d’actine-GFP-PA avec mCherry-codage des vecteurs, mélanger un total de 1 µg d’ADN plasmidique par plat de 3 cm.
5. Transfecter les cellules B16-F1 avec le réactif de transfection (Table des matières). Pour un plat de 3 cm, mélangez 200 µL de 150 mM NaCl contenant 500 ng d’ADN construire avec 200 µL de 150 mM NaCl contenant 1 µL de réactif de transfection (c.-à-d., ADN (µg) : réactif (µL) dont le rapport de 1:2 a été utilisé).
6. Incuber le mélange de transfection pendant 20 min à température ambiante (RT) et pipette goutte-à-goutte sur le plateau de 3 cm contenant les cellules. Doucement agiter le plat pour mélanger et incuber une nuit à 37 ° C, 7 % CO₂.
7. Préparer le tampon enduit de laminine contenant 50 mM Tris, pH 7.4 et 150 mM NaCl.
8. Pour les cellules B16-F1, manteau 15 mm couvercle verres en répandant 150 µL de laminine (25 µg/mL dans un tampon enduit laminine) et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Pour les cellules NIH3T3, enduire les verres de couverture avec la solution de la fibronectine (25 µg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)) et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
9. Laver les verres de couverture laminin - ou la fibronectine-incubés avec du PBS, puis aspirer le PBS et ajouter 2 mL de cellules transfectées.
10. Les cellules transfectées de B16-F1 de graines (à 01:30 ratio d’un plat confluent), le jour après la transfection, sur enduit de laminine lamelles couvre-objet. Les fibroblastes NIH3T3 de graines (à 01:20 ratio d’un plat confluent) sur enduit de fibronectine lamelles couvre-objet.
11. Laissez les cellules à se répandre sur revêtus de laminine ou la fibronectine couverture lunettes du jour au lendemain dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C avant la microscopie. Alternativement, des expériences de microscopie peuvent être lancées le même jour, étant donné que les cellules sont autorisés à se répandre pendant au moins 2 à 3 h.

3. montage de la microscopie imagerie chambre

1. Utilisez un aluminium de RC-26 conductrice de chaleur imagerie chambre pour la microscopie (Figure 1a). Enduire de la graisse de silicone autour du contour de l’ouverture de scellant en plastique à l’aide d’une seringue (Figure 1b).
2. Placez le couvercle en verre avec le cellules côté-vers le haut sur la chambre (Figure 1c).
3. Placez le scellant en plastique sur le dessus du couvercle en verre pour faire un sceau sécurisé entre la lamelle et la chambre. Fixer l’enduit en plastique (en diagonale pour éviter la casse de la lamelle couvre-objet) en vissant les pinces coulissantes dans la chambre afin d’éviter le milieu une fuite (Figure 1d).
4. Pipette 37 ° C préchauffé microscopie moyen dans la zone centrale. Pour support réduit en autofluorescence et donc optimisé pour la microscopie, utiliser la même recette comme décrit ci-dessus, mais avec F12-HAM au lieu de DMEM, contenant en outre 20 mM HEPES pour cultiver des cellules en l’absence de CO₂ (Figure de milieu de culture 1e).
5. Insérez le détecteur de chaleur dans l’emplacement désigné de la chambre et les électrodes de la chambre d’un lien vers un contrôleur de température automatique TC-324B maintenir une température constante de 37 ° C (Figure 1f).
6. Placer une petite goutte d’huile à immersion sur l’objectif et la chambre sur le dessus.
7. Incuber la chambre avec les cellules pendant au moins 10 à 30 min pour leur permettre de récupérer de la chute de température lors du montage et de s’adapter au milieu de la microscopie.
8. Avant le début de la microscopie est, remplacer le milieu de culture dans le réservoir central de la chambre (environ 800 µL) pour éviter une concentration inadéquate des composantes moyennes et sérum dues à l’évaporation moyenne. Séances de microscopie prolongée avec des chambres ouvertes nécessitera un changement systématique du milieu s’évaporant.

4. procédure de microinjection

1. Enrober les lamelles couvre-objet, de préparer les cellules et assembler la chambre d’imagerie tel que décrit ci-dessus.
2. Décongeler une partie aliquote de protéine purifiée à doser (typiquement 10 µL ou moins) et le diluer avec le tampon de microinjection approprié.
   NOTE : Composition du tampon peut varier selon le type de protéines et de cellules, mais prendre soin d’utiliser un pH entre 6,95 et 8.00 et évitez les PBS, comme la plupart des cellules n’aiment pas être injecté avec du PBS.
3. Pour Rac1 microinjection, préparer un tampon contenant 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM MgCl₂, 1 mM TNT. Les ions Mg^{2 +} sont essentielles pour la faible stabilité de GTPase.
   Remarque : Les concentrations de protéine varient normalement entre 0,1 et 1 mg/mL (maximum de 2 mg/mL), dépendant de la protéine, le type d’expérience et la cellule type.
4. Le cas échéant, ajouter un colorant fluorescent, comme inerte dextran (0,5 µg/mL, protéine de 70 kDa) à la solution de protéine, qui peut confirmer la présence d’aiguilles flow avant les injections et permet la documentation d’injections réussies après l’expérience.
   Remarque : L’expérience ici ne vise pas à la suite de la dynamique de Rac1 injecté, qui ne serait possible par fluorescence directe d’étiquetage de la protéine. Couplage des protéines avec les colorants fluorescents ou fusion d’une protéine fluorescente est possible, mais évité ici car il recèle le risque d’interférer avec la fonction de signalisation, en particulier de petites protéines comme la famille Rho GTPase Rac1 (20 kDa).
5. Centrifuger la solution de protéines à 10 000 x g pendant au moins 30 min pour enlever des agrégats de protéines pouvant mener à l’obstruction s’il est présent dans la microinjection capillaire d’aiguille.
6. Charger une aiguille de microinjection (microinjection capillaire) avec 1 µL du mélange de l’injection de l’arrière à l’aide d’une pointe/microloader de pipette souple.
7. Si les bulles d’air sont présentes dans la pointe de l’aiguille, tapoter délicatement le fond de l’aiguille afin des pour enlever. Procéder rapidement pour éviter le dessèchement de l’extrémité de l’aiguille, qui risquent de boucher l’aiguille.
8. Ajustez soigneusement le porte-aiguille sur le périphérique de micromanipulation. Si vous utilisez un microscope inversé pour l’imagerie de contraste de phase, avant le chargement de l’aiguille, assurez-vous il y a suffisamment d’espace pour déplacer l’aiguille monte et descend sans entraver le condenseur de microscope.
9. À visser le microcapillaire sur le porte-aiguille, appliquer (20 – 50 hPa fond pression) à l’aiguille à l’aide d’un appareil à pression microinjection avant la translocation de la pointe de l’aiguille dans le milieu de culture cellulaire.
   Remarque : Activation de la pression lorsque l’aiguille est dans le milieu provoquera dans le milieu étant aspiré par la force capillaire et donc interdire l’injection de la solution d’intérêt.
10. Placez l’aiguille dans le champ de vision (facilitée par l’utilisation d’objectifs de faible grossissement). Un objectif sec 40 pour des expériences de microinjection ont été tenus ici.
11. Placer l’extrémité de l’aiguille macroscopiquement en position verticale par rapport au centre de la lentille de l’objectif (cela accélérera trouver la pointe de l’aiguille). Utiliser le microscope avec optique à contraste de phase pour déplacer l’extrémité de l’aiguille dans le plan horizontal par rapport au champ de vision, sur un plan optique bien-au-dessus de la couche de cellules.
    Remarque : L’aiguille apparaît initialement comme une ombre dans le champ de vision et le plan focal peut alors être ajusté afin de visualiser la pointe. Une fois que la pointe de l’aiguille se trouve, diminuer progressivement le plan optique, suivi de la pointe de l’aiguille vers le bas pour une position proche de la couche de cellules.
12. Vérifier le débit de l’aiguille en passant à un canal fluorescent lors de l’utilisation de dextran fluorescent et régler le débit à l’aide de l’appareil de pression pour obtenir un flux constant de « fond ».
    Remarque : Dans cet article, nous décrivons injection manuelle, qui est véhiculée par effraction à travers la membrane de plasma par contact avec la cellule de surface et doux mouvement de l’extrémité de l’aiguille au cours de l’écoulement constant de l’aiguille. Cela doit être distinguée de dispositifs d’injection automatique accompagnées d’augmentation de pression abaissant et d’aiguille aiguille programmée lors des événements d’injection, qui sont plus appropriées pour l’injection d’un nombre plus élevé de cellules suivie d’une population de cellules plus tard analyse. La méthode décrite ici est optimisée pour l’analyse de la cellule unique par microscopie Time-lapse avant, pendant et après la microinjection.
13. Trouver une cellule d’intérêt et de diminuer progressivement l’aiguille au-dessus de la cellule.
14. Lorsque vous êtes prêt à microinject, piquez l’aiguille progressivement vers la région périnucléaire de cellule à l’aide du pignon fin du joystick micromanipulateur, tout en gardant les cellules à se concentrer.
15. Pour la microinjection, touchez légèrement la membrane plasmique de la cellule, qui peut suffire à pénétrer dans la cellule, ou l’aide de la rupture des membranes transitoire par un robinet très doux sur la configuration de microscope.
    Remarque : Un point blanc à l’extrémité de l’aiguille indique le temps de contact avec la membrane plasmique ; suite à la rupture des membranes, la pointe de l’aiguille se refermer, accompagné d’un léger courant de solution injectable dans la cellule.
16. Arrêter le processus d’injection dès l’écoulement dans la cellule est visible (idéalement au sein de 0,3 s) en se déplaçant vers le haut de la pointe de l’aiguille dans le milieu. Lorsque vous utilisez fluorescent dextran, injections de succès peuvent être immédiatement documentées par fluorescence.
17. Si vous le souhaitez, initier une acquisition d’images de Time-lapse avant ou après la microinjection.
    NOTE : Application locale de médicaments ou inhibiteurs peut être exécutée à toutes les étapes ici, à l’exception de la microinjection événement en soi. Pour des applications locales, la diffusion de la molécule active peut être contrôlée par la pression d’écoulement et accompagnée de fluorescence, et l’extrémité de l’aiguille peut être positionnée à la hauteur désirée. Pour obtenir des exemples d’expériences d’application locale, voir par exemple, petit et Rottner¹⁴ ou Kaverina et al. ¹⁵
18. Après la microinjection, attendre que l’effet de la protéine se produit. Pour différentes protéines et selon le résultat escompté, temps d’incubation peuvent varier. Pour la petite GTPase Rac1, la réaction de formation de lamellipodium peut être mis en œuvre au sein de 1 min ou moins, mais il prend environ 10-15 min en moyenne pour développer pleinement (Figure 1g, h).
19. Juger de la viabilité des cellules après la microinjection.
    NOTE : Injections inappropriées ou nuisibles peuvent causer des dommages cellulaires, ce qui sont souvent accompagné de rétraction cellulaire non-spécifique pointe ou rupture de la membrane plasmique.
    1. Évitez de piquer à travers de la membrane plasmique le haut et le bas, qui peut se produire pour les injections dans les régions plates cellulaires.
       Remarque : Les volumes d’Injection doivent être maintenus à un minimum (idéalement < 5 % du volume cellulaire) et sera généralement dans la plage de femtoliter. Requis des volumes d’injection peuvent également être contrôlés par des changements dans la concentration, mais notez que pour les protéines, les concentrations > 2 mg/mL peut devenir impraticable en raison de fréquent aiguille colmatage. Toutefois, cela dépend aussi de la qualité et le comportement de la protéine purifiée ; par exemple, injection d’actine couplés fluorescent est compliquée par la polymérisation de concentration-dépendante et inévitable dans la pointe de l’aiguille et donc il est rarement exécuté aujourd'hui (voir petit et al. ( ¹⁶).
20. Avant, pendant ou après l’effet de la microinjection, PAF ou photoactivation peut être effectuée sur la même cellule (voir Section 5 et 6).

5. procédure de FRAP

1. Transfecter le type de cellule d’intérêt (ici les cellules B16-F1) avec plasmide ADN codant pour une protéine fluorescent-étiquetées d’intérêt (ici, une version EGFP-tag de β-actine est utilisée). Ensemencez les cellules sur enduit de laminine lamelles couvre-objet (étape 2.10).
2. Assembler la chambre d’imagerie (Section 3).
3. Utilisez les paramètres suivants pour lamellipode région photobleaching : puissance de laser 65 mW (variable selon la source de laser et d’installation expérimentale) ; diamètre de faisceau de laser de 10 pixels ; 1 Mme Javel dwell temps/pixel ; temps d’exposition de 500 ms GFP ; intervalle de temps de 1 500 ms. Les résultats expérimentaux dans le présent document ont été réalisées avec un objectif apochromatique 100 X 1.4NA.
4. Procéder au calage du laser pour assurer l’exactitude des dimensions de la région de photobleached. Avant l’étalonnage, déplacer le champ de vision dans un endroit dépourvu de tout signal de fluorescence des cellules et observer l’image sur l’écran.
5. Sélectionnez le grossissement de l’objectif en cliquant sur le bouton respectif de grossissement et de réduire la puissance du laser (3 à 5 mW) dans le « panneau | Menu d’intensité ». Pour lancer l’étalonnage manuel sur le logiciel Visiview (v2.1.4), sélectionnez le « configurer | FRAP » menu et cliquez sur le « Calibrate | Menu réglage manuel ». Veiller à ce que le laser se distingue par une forte dot. Si non, réorienter ou ajuster le matériel de laser.
6. Effectuer l’étalonnage en guidant manuellement le laser aux coordonnées pré-déterminé logiciel X-Y. Cela indique le logiciel comment cibler spécifiquement le laser sur une région définie par l’utilisateur pour le grossissement actuel.
7. Avant de déclencher le laser, basculez vers le canal de la GFP et démarrer image/time lapse acquisition.
8. Dessinez manuellement la région pour être photobleached sur le canal de la GFP, lors de l’affichage de l’écran.
9. Initier le photoblanchiment par un déclencheur manuel de laser à 405 nm, au moins 3-4 cadres après le début de l’acquisition d’images. Acquérir des images avant photoblanchiment est requis pour la normalisation de l’image dans l’analyse ultérieure des données.

6. procédure de Photoactivation

Remarque : Logiciel, configuration de microscope et les paramètres, à l’exception de la puissance du laser, sont semblables à celles des PAF. Dans photoactivation, une différence importante par rapport à FRAP, est qui une puissance de 405nm-laser nettement inférieure qui employait photoblanchiment doit être utilisée, pour activer PA-GFP sans simultanément le photoblanchiment il.

1. Transfecter conjointement le type de cellule d’intérêt (B16-F1 cellules ici ; voir étape 2.5) avec l’ADN de plasmide codant PA-GFP-actine et une autre protéine fluorescent marqué (par exemple, mCherry ou mCherry-Lifeact).
   Remarque : Dans la plupart des cas, des cellules positives mCherry sera également positives pour le vecteur PA-GFP-actine, ces dernier ne sont normalement pas vu sur le canal GFP avant photoactivation. Pour améliorer les chances que les cellules mCherry-positives sont également positifs pour PA-GFP, utiliser un ratio 1:2 de transfection de mCherry:PA-GFP-actine. Suite à ce protocole, plus de 90 % des cellules exprimant mCherry affiché activation réussie d’actine-GFP-PA.
2. Les semences les cellules B16-F1 sur enduit de laminine lamelles couvre-objet (étape 2.10).
3. Assembler la chambre d’imagerie (Section 3).
4. Avant d’amorcer les expériences de photoactivation, si nécessaire, effectuer la calibration du laser pour l’objectif choisi (point 5.4 – 5.6).
5. La valeur de l’acquisition d’images GFP/488 nm à intervalle de temps 500 ms exposition et 1 500 ms (selon le protocole expérimental).
6. Régler les paramètres de logiciel d’acquisition de films de Time-lapse soit double ou triple-canaux en marquant la place de « Série de longueur d’onde » et en sélectionnant le nombre désiré de canaux dans le « Acquire | Menu de longueur d’onde ». Il est recommandé que les films de laps de temps sont acquises avec contraste de phase et les canaux de la GFP.
   1. Éventuellement aussi inclure le canal mCherry ; Cependant, les cellules avec trop de lumière pourrait inciter photovieillissement. Ceci pourrait être évité avec les charognards de l’oxygène comme Oxyrase¹⁷, même si un traitement efficace nécessite d’étanchéité cellule chambre.
7. Trouver les cellules transfectées sur le canal de mCherry.
8. Avant de déclencher le laser, démarrer image/time lapse acquisition et dessiner manuellement la région pour être photoactivées sur le canal de contraste de phase, lors de l’affichage de l’écran.
9. Ouvrir la photoactivation par un déclenchement manuel du laser 405 nm (intensité réglée entre 5 et 15 mW de la « panneau | Menu d’intensité »), au moins 3-4 cadres après initiation d’acquisition image.

7. analyse et présentation des résultats de la PAF

Remarque : La méthode présentée est utilisée pour enquêter sur le chiffre d’affaires d’une protéine s’accumulant dans les sites d’assemblage de l’actine dynamique, dans le cas présent, VASP, qui associe des sites d’adhérence et de suivre les conseils de lamellipodia en saillie. Nous sommes à analyser son chiffre d’affaires à la pointe de lamellipodium, mais les mêmes principes d’analyse peuvent être appliquées pour enquêter sur le chiffre d’affaires de VASP ou de toute autre protéine et d’autres compartiments subcellulaires.

1. Ouvrez les Time-lapse films dérivés de Visiview sur le logiciel de Metamorph. Dans cet article, Metamorph v7.8.10 a été utilisé.
2. Calculer les valeurs d’intensité pour les régions du photobleached en traçant manuellement des régions respectives sur Metamorph. Dessiner une forme à la pointe de la lamellipodium qui couvre l’ensemble ou une partie de la zone de photobleached et de régler manuellement sa position sur les trames suivantes si nécessaire (par exemple, si le bord est en saillie) en afin de suivre l’évolution de lamellipode intensités de le composant respectif au cours du déplacement de la pointe.
3. Pour la correction de fond et le photoblanchiment acquisition, analyser les régions à l’intérieur et l’extérieur de la cellule. Voir la Figure 2un pour les régions représentatives des intensités mesurées.
4. Tandis qu’un retour sur investissement est sélectionnée, extraire les valeurs d’intensité sur Metamorph en utilisant le menu « mesure | Mesures de la région ». S’assurer que le « Temps écoulé » et « Moyenne intensité » sont sélectionnées dans le menu « Configurer ». Cliquez sur « Open log » et sélectionnez « Dynamic Data Exchange ». Cliquez sur « OK » pour ouvrir une feuille de calcul Excel et cliquez sur le bouton « Ouvrir le journal » à nouveau pour coller les valeurs Metamorph dans Excel.
   Remarque : Ces valeurs sont utilisées pour générer les courbes de récupération de fluorescence.
5. Pour générer des courbes de récupération de fluorescence à la pointe de lamellipodium des régions de photobleached (normalisé à l’intensité de la région avant photoblanchiment), appliquer l’équation suivante :
      Équation 1
   où : FRAP^Tn est l’intensité de région photobleached pour chaque trame d’intérêt après photoblanchiment ; Sur^Tn est une intensité région prise en dehors de la cellule (fond) pour chaque trame d’intérêt après photoblanchiment ; Ins^Tn est deux en moyenne à l’intérieur de la région des intensités pour chaque trame d’intérêt après photoblanchiment (utilisé pour normaliser pour acquisition photoblanchiment au fil du temps) ; FRAP^T-1 est l’intensité de région photobleached avant photoblanchiment ; ^T-1 est une intensité région prise en dehors de la cellule (arrière-plan) avant photoblanchiment ; et Ins^T-1 deux en moyenne à l’intérieur de la région des intensités pour chaque trame d’intérêt avant photoblanchiment.
6. Pour chaque période d’intérêt, utilisez l’équation 1 afin d’obtenir une courbe de récupération de fluorescence contenant toutes les images de temps à être l’objet d’une enquête. La durée est strictement dépendante de la protéine étudiée. Quand inconnu, réaliser des expériences préliminaires pour acquérir le taux de roulement de la protéine.
7. Pour calculer le temps de récupération, collez les valeurs de la courbe de récupération de fluorescence avec l’heure correspondante (en secondes) dans une parcelle de Sigma (v.12) et effectuer une ajustement à l’aide de la courbe du « Dynamic Fit Assistant | Outil de l’exponentielle au maximum ». Sélectionnez mono-exponentielle (single, 3 paramètres) ou bi-exponentielle (double, 4 paramètres) fonctions, selon la meilleure ajustement de la courbe.
8. Utilisez la formule suivante pour la fonction exponentielle-mono :
      Équation 2
9. Utilisez la formule suivante pour la fonction exponentielle-bi :
      Équation 3
10. Coller les paramètres « b » et « d » provenant de Sigma Plot (équation 2 ou 3 équation) dans Excel pour calculer le temps de récupération. Appliquer les équations suivantes :
       Équation 4
    ou
       Équation 5
11. Lorsque la fonction mono-exponentielle se traduit par une ajustement précis de la courbe, s’appliquent seulement l' équation 4.
12. Lorsque la fonction mono-exponentielle n’aboutit pas à une bonne ajustement de la courbe, appliquer la formule bi-exponentielle en résolvant les équation 4 et 5 de l’équation. Considérer les qui en résulte deux mi-temps de récupération comme représentant deux fractions protéiques : un rapide et une fraction échange lente, respectivement.

8. détermination du taux de polymérisation de l’actine lamellipode par FRAP

1. Pour déterminer le taux de polymérisation de l’actine lamellipode, transfecter les cellules B16-F1 avec EGFP émetteurs β-actine, et photobleach la région lamellipode (étape 5,9) à l’aide d’intervalle de temps s 1,5 et l’exposition GFP de 500 ms.
2. Metamorph, ouvrir les films de Time-lapse acquis auprès de Visiview et calibrer le ratio pixel/µm selon l’objectif utilisé par la « mesure | Outil de calibrage distance ».
3. Lire la vidéo Time-lapse et l’arrêter sur le cadre lorsque le recouvrement de fluorescence lamellipode, qui se jette en arrière vers la lamelle sous forme de ligne, a atteint la lamelle et aucune autre écoulement vers l’arrière peut être suivi.
4. Mesurez la distance en µm entre la pointe de la lamellipodium et l’arrière de la fluorescence récupéré. Cette distance correspond à la somme des flux rétrograde et distances de la protubérance.
5. Sinon, pour séparer la partie saillante de flux rétrograde, marquer la pointe lamellipode offrant un cadre d’une ligne avant le photoblanchiment. Utilisation de la ligne comme référence point dans les trames suivantes pour faire référence à la position originale de la pointe de lamellipodium au moment de photoblanchiment ; le point de référence peut être utilisé pour mesurer la distance de protrusion et de flux rétrograde.
6. Notez la durée (en secondes) nécessaire pour la récupération de fluorescence après photoblanchiment se produise. Le temps peut être calculé manuellement de la cadence ou visualisé par Metamorph à travers la « mesure | Outil de mesures de la région ».
7. Calculer le taux de polymérisation de l’actine en utilisant l’équation suivante (avec certains paramètres de l’équation basées sur des mesures de Metamorph étapes 8,4 et 8.6) :
      Équation 6
   où taux de polymérisation de l’actine est en µm/min, distance de flux rétrograde est en µm, lamellipode saillie distance est en µm et est de temps en secondes.

9. analyse des protéines Diffusion et mobilité sur Photoactivation

Remarque : La méthode présentée ici décrit l’analyse de la mobilité de monomère de l’actine en employant la photoactivation de l’actine fusionnée à PA-GFP, tel qu’illustré par la visualisation et la quantification de la diffusion de la protéine dans le cytosol.

1. Pour la mesure de la diffusion de l’actine photoactivatable loin une région cytosolique, ainsi que l’accumulation d’une région lamellipode, utilisez Metamorph pour déterminer l’intensité au fil du temps dans les régions suivantes (illustré à la Figure 3un ) : une région de photoactivation cytosolique (PA) ; une région de lamellipode, dans lequel photoactivation protéines devraient s’accumuler au fil du temps (Lam) ; une région à l’extérieur de la cellule utilisée pour la normalisation de la fluorescence de fond (OUT).
2. Lors de la détermination des possibilités de déplacement de l’actine dans le cytosol, mesurer les régions cytosoliques distinctes (voir Figure 3un, régions R1-R5). Notez que l’acquisition de photoblanchiment ne peut être déterminée de manière similaire à FRAP, due à une augmentation de fluorescence focal - et éventuellement à l’échelle cellulaire lors de l’activation.
3. Transférer les valeurs d’intensité pour toutes les régions de Metamorph dans une feuille de calcul Excel, comme indiqué au point 7.4.
4. Pour l’examen de la vitesse de déplacement de l’actine photoactivatable loin de la région cytosolique de photoactivation ou son taux d’incorporation dans une région lamellipode (tous deux représentés comme intensité pour cent de la région de photoactivation cytosolique au temps 0) , générer des courbes de fluorescence à partir des données à l’étape 9.3. Appliquer les équations suivantes :
      Équation 7
      Équation 8
   où : PA^Tn est l’intensité d’une région de photoactivation cytosolique de chaque cadre d’intérêt après photoactivation ; LAM^Tn est l’intensité d’une région lamellipode pour chaque trame d’intérêt après photoactivation ; LES^AMT suit l’intensité d’une région prise en dehors de la cellule (fond) pour chaque trame d’intérêt photoactivation ; PA^T-1 est l’intensité d’une région de photoactivation cytosolique avant photoactivation ; LAM^T-1 est l’intensité d’une région lamellipode avant photoactivation ; ^T-1 est l’intensité d’une région prise en dehors de la cellule (arrière-plan) avant de photoactivation ; PA^T0 est l’intensité d’une région de photoactivation cytosolique au temps 0 (c'est-à-dire, première image après photoactivation) ; et^T0 est l’intensité d’une région prise en dehors de la cellule (arrière-plan) au temps 0 (c'est-à-dire, première image après photoactivation).
5. Éventuellement, pour une meilleure visualisation des données, normaliser les courbes d’intensité à 0 en soustrayant l’intensité de la première image après photoactivation de chaque trame ultérieur.
   Remarque : La méthode suivante de l’analyse (9,6 – 9,8 étapes) aussi permet de calculer la dispersion cytosolique de photoactivation actine dans le cytosol.
6. Mesurer les intensités pour régions cytosoliques, qui sont placées consécutivement dans la partie distale de la région d’activation.
7. Pour représenter les intensités de ces régions en intensité pour cent de la région de photoactivation au temps 0, appliquer l' équation 8, où les intensités lamellipode sont remplacées avec des intensités pour chaque ROI cytosolique. Nombre de régions et la taille peuvent varier selon la distance de taille et de la dispersion des cellules à mesurer.
8. Pour calculer une valeur quantifiable pour le taux de protéine de photoactivation s’infiltrer dans chaque région cytosolique, collez le temps et les valeurs de la courbe d’augmentation d’intensité de fluorescence pour chaque région dans parcelle de Sigma (similaire à l’analyse de la PAF à la Section 7), utilisez Équation 2 et 4 de l’équation pour calculer le temps de l’intensité de fluorescence pour atteindre un plateau. Comparer les valeurs de_1/2 t entre les différents groupes expérimentaux.

Results

Figure 1 g h montrent des images de contraste de phase d’une cellule de fibroblastes NIH3T3 préalable et 10 min après microinjection de Rac1, qui est une GTPase Rho-famille petite capable d’induire la formation lamellipodia grâce à son interaction avec l’onde complexe. La cellule est tout d’abord visualisée avant la microinjection (Figure 1g), pour confirmer sa viabilité et la morphologie, par exemple, manque de lamellipodia. À 10 min après microinjection, la cellule a clairement changé sa morphologie, ce qui est attendu de ce traitement et indique une injection réussie (Figure 1h).

Pour la simplicité et de clarté, nous fournissent ensuite des résultats exemplaires pour analyse FRAP et photoactivation dans des cellules qui n’ont pas été par ailleurs micro.

Analyse du chiffre d’affaires de VASP EGFP-tag à la pointe de lamellipodium est montré dans la Figure 2a à f. Notez que VASP vise en outre à des adhérences naissantes et focales, petites et allongées points dans la cellule intérieure^18,19. L’intensité de la fluorescence d’une région lamellipode avec une accumulation de VASP claire à l’extrémité a été blanchie et mesurée pour chaque laps de temps, en suivant le contour du ROI avant, pendant et après le blanchiment comme le lamellipodium fait saillie vers l’avant. Comme blanchie EGFP-VASP protéines sont être recyclées par des molécules non blanchi sur ces sites, une reprise graduelle de la fluorescence est observée (Figure 2b). La courbe de récupération FRAP obtenue de cette façon et normalisée à l’intensité de l’eau de Javel (exprimée en 1) peut être vu dans la Figure 2c. Photoblanchiment efficacité peut varier et il était environ 20 % de la valeur avant blanchiment dans cet exemple, tel que déterminé par la valeur à t0 (la première image après photoblanchiment). L’augmentation de la fluorescence atteint un plateau dans l’exemple illustré à près de 80 % de la fluorescence avant blanchiment. Dans une structure statique au cours de l’évolution temporelle de l’expérience, par exemple une adhérence focale, la différence entre l’intensité de l’eau de Javel et la fluorescence de plateau atteint après que récupération est définie comme la fraction immobile (IF, une flèche rouge dans la Figure 2 c, e), alors que la quantité de fluorescence récupérés entre le temps de rétablissement blanchiment est définie comme la fraction mobile (bicéphale flèche verte dans la Figure 2, c, e). Notez que dans une structure change dynamiquement comme la pointe de lamellipodium analysée ici, l’étendue de la fi pourrait non seulement représenter les molécules immobiles, mais dérivent également d’une réduction de la vitesse de la saillie, comme intensité EGFP-VASP est censée dépendre de cela paramètre¹⁸. Pour calculer le temps de récupération, une courbe ajustée a été créée sur le terrain de Sigma (Figure 2d). Dans ce cas, la valeur du paramètre « b » extrait de résoudre l’équation 2 est égale à 0.0754, qui lorsqu’il est appliqué à la fonction logarithmique (équation 4) résultats en une demi-heure prévue de la récupération de 9,19 s (Figure 2d , panneau à droite), qui est relativement rapide dans cette cellule particulière par rapport à la moyenne publiées auparavant⁵. Il est à noter que demi-temps de récupération peuvent parfois varier considérablement de cellule en cellule au sein de la même population. Par conséquent, pour obtenir des résultats représentatifs, nous vous recommandons de déterminer ce paramètre comme la moyenne des cellules au moins 15-20. Pour illustrer le degré de variance, les moyennes arithmétiques de récupération EGFP-VASP était en moyenne de 15 cellules pour chaque point de temps ont été générés (Figure 2e), et la courbe moyenne correspond créée et affichée de manière analogue (Figure 2 ( f).

La vitesse de polymérisation du réseau d’actine lamellipode comprend la somme de protrusion du réseau vers l’avant et de flux rétrograde. FRAP peut être appliqué pour mesurer le taux de polymérisation de l’actine en transfectant les cellules (en l’occurrence B16-F1) avec β-actine EGFP-étiquetée et photoblanchiment une saillie lamellipode région (Figure 2g). Pour l’analyse de la polymérisation de réseau lamellipode actine, la récupération de la fluorescence sur le blanchiment de la β-actine EGFP-étiquetée est évaluée au fil du temps. La polymérisation de progresse de monomères actine barbelé aux extrémités des filaments d’actine lamellipode (qui tous point vers l' avant,²⁰), le réseau est constamment déplacés vers l’arrière et en progressant vers l’avant, le taux qui peut être facilement obtenu grâce à la récupération polarisée de fluorescence après photoblanchiment. Récupération de la fluorescence de la lamellipodium est terminée dès que la zone blanchie a atteint la zone de transition entre la partie arrière de la lamellipodium et la lamelle, qui se caractérise par une plus faible densité de plusieurs faisceaux de filaments horizontaux retournant plus lentement que ce qui est observé dans la lamellipodium. Comme illustré à la Figure 2g, récupération de la fluorescence peut être visualisée comme une ligne horizontale à bord et à refluer vers la lamelle, qui permet de mesurer les distances de protrusion et de flux rétrograde (représentées individuellement dans le panneau à droite de la Figure 2g comme flèches gauche-droite rouge et orange, respectivement).

Nous avons également appliqué photoactivation dans les cellules B16-F1 transfectées avec PA-GFP-actine pour suivre la mobilité des monomères d’actine dans le cytosol et le taux de leur incorporation au sein de la saillie lamellipodia. Comme illustré à la Figure 3a, b, une région cytosolique était photoactivation par l’exposition à un laser à 405 nm, tandis que les images ont été acquises sur la GFP canal chaque 1,5 s pour visualiser la distribution de GFP-étiquetée, photoactivation actine. Actine-GFP Photoactivated peut être vu diffuser hors de la région cytosolique dans la Figure 3b. Le taux de décroissance d’intensité de fluorescence dans la région de cytosolique de photoactivation est représenté sous forme de pourcentage de l’intensité initiale à t0 (première image après photoactivation ; Figure 3 c). photoactivées actine s’intègre également à la pointe de lamellipodia, où les nouveaux monomères d’actine sont ajoutés aux extrémités barbelées croissantes d’élongation des filaments d’actine au cours de la partie saillante. Pour estimer le taux d’incorporation de lamellipode, nous avons mesuré l’intensité de la fluorescence au fil du temps d’une contour/région à deux dimensions d’environ 5 µm de largeur et 1 µm de hauteur ; la région a été repositionnée sans cesse à la pointe de la lamellipodium telle qu’elle dépassait. Incorporation de l’actine était représentée sous forme de pourcentage de l’intensité de la fluorescence de la région de photoactivation cytosolique à t0 (Figure 3d). Fur et élongation des filaments d’actine, nouveaux monomères d’actine ont été incorporés à l’avant lamellipode. Une fraction de ces monomères d’actine provenait stochastique du pool cytosolique où les monomères ont été photoactivées. Cela se traduit par l’augmentation rapide de la fluorescence en lamellipodia dans les 20 premières secondes après la photoactivation. Comme nouveaux monomères sont ajoutées à l’avant lamellipode, flux de monomères actine précédemment constituée avec des filaments vers la lamelle de flux rétrograde. Au fil du temps, le ROI est complètement rempli de monomères fluorescents et un plateau en fluorescence est atteinte (Figure 3d). Une baisse progressive de fluorescence observe alors quand, après la diffusion de photoactivation de monomères dans toute la cellule, monomères d’actine non-photoactivation sont plus ré-ajoutées à l’avant lamellipode. Cette diminution de fluorescence trouveront un nouveau palier, qui sera atteint dès qu’un équilibre dans toute la cellule entre monomères de photoactivation et non-photoactivées est atteint (données non présentées).

La mobilité des monomères d’actine dans le cytosol résulte de la mesure des intensités de fluorescence dans les régions de taille égale, positionné dans la partie distale de la région de photoactivation (illustrée sur la Figure 3un par régions de couleur marquée R1-R5). Comme illustré à la Figure 3e, intensité de la fluorescence dans chacune de ces régions diminue peu à peu loin de la cytosolically région de photoactivation, comme la fraction de monomères d’actine photoactivation devient plus en plus diluée avec non activé monomères (c.-à-d. non fluorescent). En outre, le pic de la fluorescence est atteint plus tard : plus lointain la région mesurée est située dans la région de photoactivation, plus le temps requis pour les monomères d’actine de diffuser dans ces régions. Une valeur représentative pour le degré d’infiltration de monomère d’actine dans chaque région peut être dérivée en quantifiant la moitié du temps d’atteindre le plateau de fluorescence. Plus lointain, la région, la plus longue qu’il faut pour l’actine de photoactivation de diffuser en elle, et donc plus de temps est nécessaire pour le plateau fluorescent à atteindre, conduisant finalement à une valeur supérieure de_1/2 t (Figure 3e).

Figure 1 : Imagerie chambre Assemblée et microinjection procédure. (un) composants de chambre de l’imagerie. (b), Silicone graisse est soigneusement enduit autour de l’ouverture d’un chasseur en plastique. (c), la lamelle est positionné avec la cellule-face vers le haut dans le centre de la chambre d’imagerie d’ouverture. (d) un endroit sûr seal est établie en positionnant l’enduit en plastique sur le dessus de la lamelle et de serrer les attaches latérales. (e) microscopie moyen est reversé dans la fente de la chambre. (f), la chambre d’imagerie est positionné sur la platine du microscope, électrodes et détecteur de chaleur sont liés à une unité de chauffage réglé à 37 ° C, et les cellules sont autorisés à s’adapter pendant au moins 30 min avant le début de la microscopie est. Dans cet exemple, la platine du microscope est également équipée d’un micromanipulateur pour effectuer des microinjections, et l’aiguille de microinjection est plongé dans le milieu de la couche de cellules dans la salle d’imagerie. cellules de fibroblaste (g), An NIH3T3 est visualisé avant microinjection par microscopie à contraste de phase. La Croix rouge dans le compartiment périnucléaire indique l’emplacement de la future microinjection, qui correspond à une région cytoplasmique élevée en raison de la proximité au noyau volumineux. (h) 10 min après microinjection avec Rac1, la cellule réagit par une formation importante de lamellipodia autour de la périphérie de la cellule entière (indiquée par les flèches vertes). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : FRAP permet de déterminer le taux de la polymérisation de l’actine chiffre d’affaires ou lamellipode protéine. (une) représentant exemple de cellule B16-F1 exprimant EGFP-VASP avant photoblanchiment d’une région lamellipode comme indiqué. Contours/formes différemment colorées sont étiquetés pour indiquer quelles régions étaient considérées comme des mesures d’intensité de fluorescence au fil du temps. Remarque le contour rouge marqué avec un point d’exclamation, qui marque une région cytosolique positionnée dans un domaine contenant plusieurs vésicules et volants de surface cellulaire. Zones dynamiques comme ça il faut éviter de sélection des régions de référence de la fluorescence, car elles sont caractérisées par fortes fluctuations à court terme de fluorescence, pouvant causer des résultats inexacts. (b) lamellipode région de la cellule exprime EGFP-VASP avant et après photoblanchiment. La récupération du signal fluorescent après que photoblanchiment au sein de la région ont marqué en violet est visualisée au fil du temps. Flèche indique la pointe d’un microspicules, enrichi pour VASP, probablement en raison de la forte densité des filaments d’actine polymérisation là¹⁹. courbe de récupération (c), un exemple d’un PAF comme dérivé de quantifier l’intensité de fluorescence de la lamellipodium de photobleached (contour violet) b. rouge et lignes vertes à droite indiquent, respectivement, fractions mobiles et immobiles. (d), un ajustement de la courbe de récupération FRAP dans c (panneau de gauche) et un exemple de la méthode de calcul utilisée pour calculer la moitié de la convalescence (panneau de droite). (e), un exemple d’une reprise FRAP courbe dérivé en moyenne les courbes de récupération de fluorescence de 15 cellules, avec des barres de SEM indiquant le degré de variabilité au sein de l’échantillon de population. (f) une courbe d’ajustement dérivé en moyenne le s’adapte à la courbe d’un recouvrement FRAP de 15 cellules (panneau de gauche) et un exemple de la méthode de calcul utilisée pour calculer la moitié de la convalescence (panneau de droite). (g) panneaux Time-lapse de saillie lamellipodium d’une cellule B16-F1 exprimant EGFP émetteurs β-actine, avant et après que blanchiment d’une région lamellipode comme indiqué, suivi par un rétablissement de fluorescence dans le lamellipodium au fil du temps. Sur le panneau de droite, les valeurs mesurées pour saillie et rétrogrades distances sont fournis (en orange et rouge, respectivement). Des calculs sous les panneaux image révèlent comment la somme de protrusion et rétrogrades distances servent à calculer les taux de polymérisation du réseau d’actine lamellipode. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Photoactivation de PA-GFP-actine pour monomère suivi tout au long de la cellule. (un) A exemple représentatif d’une cellule B16-F1 exprimant l’actine-GFP-PA avant de déclencher la photoactivation dans une région cytosolique comme indiqué par le cercle rouge (PA). Contours différemment colorées sont étiquetés pour indiquer quelles régions étaient considérées comme des mesures d’intensité de fluorescence au fil du temps. (b), une illustration de la répartition temporelle des suit PA-GFP-actine photoactivation. Notez la réduction progressive de la fluorescence de la photoactivation, région cytosolique (cercle rouge), comme l’actine de photoactivation diffuse loin de lui. En raison de leur diffusion vers l’avant et à l’Assemblée dans le réseau, monomères d’actine photoactivation sont progressivement améliorés en lamellipodia (région de cyan) et dans le cytosol (différentes régions classés par couleur) dans un mode de fonction de la distance et temps. (c) représentative, temporal déclin de fluorescence dans la région de cytosolique de photoactivation (contour rouge en b). (d), Temporal variations dans l’intensité de la fluorescence dans la région de lamellipode (contour cyan dans b). (e) les courbes représentatives des changements dans l’intensité de la fluorescence des régions cytosoliques (code couleur b) en raison de positionnement à une distance variable de la zone de photoactivation temporelles. Notez comment le mi-temps de parvenir à la fluorescence plateau (indiqué dans la légende à droite) augmentent avec la distance de compte tenu de la région à la région de photoactivation, probablement mise en corrélation avec l’augmentation fois nécessaires pour la diffusion des monomères d’actine dans le région respective. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ici, nous discutons des étapes cruciales dans les techniques décrites dans cet article, et comment ils peuvent être optimisés pour application dans différentes conditions expérimentales.

Microinjection est une méthode qui peut être appliquée pour contrôler dans les cellules des effets instantanés d’introduire les protéines exogènes, inhibiteurs ou drogues. Il peut être particulièrement avantageuse pour déterminer les fonctions des protéines dans les difficiles à transfecter les types de cellules ou dans les situations où l’expression à long terme n’est pas souhaitée. Il est à noter que la survie de certains types de cellules varie en fonction de la matrice extracellulaire, sur qu'elles sont ensemencées. Types de cellule plus endothéliale, épithéliale ou fibroblastes ressemblant, même petits comme poisson keratocytes (voir Dang et al. ²¹ et Anderson Cross²²) peuvent être injectées avec succès. Cependant, il y a des exceptions, telles que les cellules B16-F1 ensemencées sur laminine, qui constituent un système excellent modèle de la migration cellulaire, mais ne sont pas compatibles avec l’injection de ce type de substrat pour raison inconnue. Pour les cellules fibroblastes NIH3T3, nous effectuons régulièrement des injections sur substrat de fibronectine et techniques supplémentaires photomanipulation comme FRAP (même avec photoactivation ; constatées pour les cellules B16-F1 ici) peuvent être réalisées aussi bien dans ces fibroblastes (voir par exemple, Köstler et al. ³). il faut aussi tenir compte que des protéines différentes, selon leurs propriétés fonctionnelles et les objectifs de l’expérience, peuvent prendre des quantités différentes de temps provoque des changements, variant de secondes à heures. Un avantage de cette technique est que la dose/concentration d’agent exogène peut être commandée avec plus de précision au niveau de la cellule unique que par exemple, lorsque vous utilisez la transfection de plasmide. En outre, un marquage fluorescent d’une protéine n’est pas une nécessité pour garantir sa présence dans la cellule, ce qui peut augmenter la flexibilité s’il fallait simultanée multi-canal visualisation des autres protéines fluorescent-étiquetées. Microinjection peut être particulièrement utile pour l’analyse des effets instantanés des protéines spécifiques ou des mélanges de protéines sur des changements dynamiques de la morphologie cellulaire ou le cytosquelette (p. ex., Dang et al. ²¹ pour obtenir un exemple des effets instantanés sur les migrations par l’inhibiteur du complexe Arp2/3 Arpin). Un inconvénient de cette technique est son caractère invasif, qui peut causer des dommages aux cellules ou influencer la morphologie cellulaire. Par conséquent, une considération importante lors de l’exécution des microinjections surveille la viabilité des cellules. La méthode présentée ici s’appuie sur la manipulation manuelle. Dans les conditions testées pour être compatibles avec des injections de succès, tels que les fibroblastes en culture sur substrat de la fibronectine, le protocole d’injection manuelle décrit ici permet à un taux proche de 100 % de réussite ; C’est essentiel quand on combine cette approche avec des expériences de suivi sophistiqués et chronophages y compris vidéo microscopie ou FRAP, tel que publié précédemment³. Cela n’exclut pas que parfois, les cellules individuelles pourraient souffrir d’un événement de microinjection, qui se distingue en toute sécurité par des changements brusques de contraste entre le noyau et le cytoplasme, suivie par la rétraction de bordure de cellule. Ces rares cas expérimentaux sont exclus et donc pas considérée comme pour approfondir les analyses.

Cependant, une approche semi-automatique est aussi couramment utilisée, par exemple employant rapide (< 300 ms) aiguille machine contrôlée par abaissement coïncide avec l’augmentation de la pression d’injection, afin que l’aiguille ne doit pas être placée au-dessus de chaque cellule avant respectifs injection. Le taux de réussite des injections semi-automatique est par définition plus faible que la méthode manuelle décrite plus haut, simplement parce qu’il est optimisé pour la vitesse, suivie de l’analyse de plusieurs cellules qui victorieusement ce traitement ; ainsi, il ne repose pas sur une injection réussie d’une cellule individuelle. Par conséquent, plutôt que de l’analyse de la cellule unique, semi-automatique injections conviennent mieux pour analyser les effets d’injection de cellules plusieurs centaines, par exemple, vidéo microscope à faible grossissement, ou à la fixation de la cellule et la coloration. Quel que soit l’approche détaillée employée, microinjection ne constitue pas un test de point final, mais peut être combinée avec une variété de techniques, y compris les PAF ou photoactivation³.

Pour déterminer le taux de renouvellement des protéines de FRAP, l’intensité du laser doit être optimisée, en fonction des conditions d’installation et de l’imagerie de microscope (grossissement, objectifs, etc., ainsi que le type de cellule, structure et protéine fluorescente pour photobleaching). Notez qu’à la puissance de laser optimale, blanchiment efficace est combiné avec le photovieillissement moins possible, pour éviter le rétrécissement ou remplir de rétraction de la structure dans le cadre de l’analyse (par exemple, lamellipodia ou filopodes) ou même des dommages au niveau cellulaire. Dans l’idéal, devrait être réalisé au moins 70 à 80 % d’efficacité de blanchiment, même si un blanchiment complet peut être entravé par rotation extrêmement rapide de la protéine, dans lequel cas, quoi que ce soit supérieur à 50 % peut être aussi acceptable. Blanchir une puissance optimale pour une structure donnée et le colorant fluorescent doit être testée expérimentalement, à partir d’une laser faible puissance suivie de son augmentation progressive. Bien sûr, n’importe quel colorant fluorescent peut par définition être blanchi avec lumière proche de son pic d’excitation laser (488 nm pour les colorants verts fréquemment utilisées comme FITC ou EGFP). Cependant, lasers à courtes longueurs d’onde, tels que les lasers UV-, livrer des grossissements plus importants et donc peuvent également être utilisés pour le blanchiment efficace des teintures utilisées. Régulièrement, nous employons un laser à diode de 405 nm (120 mW) pour blanchiment de EGFP et colorants fluorescents rouges (par exemple, mCherry), mais avec une efficacité légèrement inférieure dans le cas de ces dernières (données non présentées). Comme la 405 nm-diode peut également être utilisé pour la photoactivation de PA-GFP (voir ci-dessous), il confère ce système avec une flexibilité maximale.

Pour les structures cellulaires B16-F1 et des protéines fluorescentes photobleached ici, 405 nm-puissances entre 65 et 100 mW ont été appliqués. Lorsqu’on analyse une région de photobleached, il est important de considérer si la structure donnée est conservée dans sa forme originale au cours de l’analyse de laps de temps. Par exemple, lorsqu’on analyse le chiffre d’affaires de protéines à lamellipodia conseils, il faut que la courbure de lamellipodia est significativement altérée avec le temps, comme les changements de courbure pourraient conduire à des résultats inexacts si la région/contour analysé n’est pas entièrement couvrir l’intégralité de la structure dans chaque trame mesurée. En outre, il convient de noter que faisceaux intégré dans lamellipodia, comme microspikes, pourrait entraîner des exceptions dans l’intensité de la fluorescence. Comme illustré à la Figure 2b (flèche blanche dans le cadre de temps de 9 s), une structure en forme de microspicules est située à côté de la région de photobleached mesurée, mais reste en dehors de celui-ci pendant toute la durée de la mesure et ne provoque donc pas une inexactitude. Pour l’analyse du chiffre d’affaires de protéine, considérations sont importantes pour choisir l’emplacement et la taille d’analysé les régions sont que leur fluorescence au fil du temps ne devrait pas significativement influencé par des changements dans la morphologie des cellules ou des facteurs autres que dur pour éviter acquisition de photoblanchiment. Par exemple, les structures fournissant une contribution quantitative significative à la structure analysée ne doivent pas bouger hors de la région mesurée lors de l’analyse ; en outre, des entités indépendantes, fluorescentes tels que des structures vésiculaires qui attirent la protéine ne doivent pas entrer le domaine d’intérêt lors de l’analyse. Pour déterminer le taux de polymérisation de l’actine lamellipode, il faut qu’aucune rétractation ou fronçage (c.-à-d., plier vers le haut) lamellipodia ne sont analysés, car cela influencera fortement l’exactitude des résultats. En outre, rétraction des régions lamellipode peut apparaître sous la translocation vers l’arrière rapide, pouvant déboucher sur une surestimation des taux de polymérisation de l’actine lamellipode. Une autre considération est la distance des régions de normalisation intracellulaire (pris comme des positions de référence pour la correction d’acquisition photobleaching) de la position réelle de photoblanchiment, qui doit être suffisamment grand pour éviter direct influence de la zone de photobleached.

Lorsque vous configurez des conditions optimales pour la photoactivation de PA-GFP-étiquetée de constructions, il faut pour éviter le blanchiment instantané lors de photoactivation. Dans notre travail, les meilleurs résultats ont été obtenus avec des puissances laser 5 - 10 fois plus faible que normalement indépendants pour la décoloration des EGFP. Pour l’acquisition d’images de molécules de photoactivation, temps d’exposition et l’intervalle de temps entre les images devraient être optimisées en tenant compte de la taille des régions et des structures d’être photoactivation et analysés, ainsi que la mobilité potentielle de photoactivation protéines dans d’autres endroits subcellulaires. En ce qui concerne tous les types d’imagerie par fluorescence, maintien de la viabilité cellulaire est crucial pour l’obtention de résultats physiologiquement pertinents.

En principe, vert ou rouge photoconversion de protéines fluorescentes comme mEos ou Dronpa variantes¹² constitue une méthode tout aussi puissante dynamique suivant et chiffre d’affaires des structures subcellulaires telles que la lamellipodium (voir, par exemple, Burnette et al. ²³). l’avantage de cette dernière méthode par opposition à PA-GFP serait la possibilité de suivre la dynamique des protéines avant et après conversion avec deux couleurs distinctes, sans le besoin d’exprimer conjointement une protéine fluorescente rouge supplémentaire. Toutefois, dans nos expériences préliminaires, l’étendue des changements de contraste et l’intensité du signal fluorescent obtenu lors de photoactivation de PA-GFP était plus grands par rapport aux sondes photoconverted, peut-être en raison des supérieures caractéristiques spectrales des vert et rouge sondes fluorescentes (données non présentées). Dans tous les cas, des études détaillées sur le chiffre d’affaires de filament d’actine en saillies de cellule-bord comme lamellipodia ou queues d’actine induite par le virus Vaccinia jusqu'à présent seulement parues à l’aide de PA-GFP dérivés^5,6,24.

Lorsqu’on examine dans quelle région de la cellule d’analyser après photoactivation, plusieurs facteurs devraient être pris en compte, dont il est question à l’aide de l’exemple montré ici (incorporation de monomères d’actine à la lisière de la cellule lors de l’activation dans le cytosol), mais peut certainement être extrapolées aux divers problèmes scientifiques analogues. Tout d’abord, lors de la mesure le taux d’incorporation lamellipode cytosolically photoactivation protéines, par exemple, dans des conditions expérimentales distinctes (comme indiqué dans Dimchev al ( ⁶), les tailles des régions cytosoliques et leurs distances aux bords lamellipode devraient être comparables entre les groupes expérimentaux. Il est également important de considérer que, lorsque photoactivating régions cytosolique, l’épaisseur de la cellule est supérieure dans des positions plus près vers le noyau. Activation des régions cellulaires plus épaisses peut résulter en des quantités plus élevées de protéines activées, étant donné que la distribution de la protéine à activer est distribuée homogène dans le cytosol. Enfin, les niveaux d’expression de la protéine doit être activée peuvent certainement être très variables dans des cellules individuelles. En raison de toutes ces considérations de variabilité, il est essentiel de comparer les niveaux d’incorporation des protéines cytosolically activés ailleurs dans la cellule par rapport à la fluorescence totale obtenue lors de l’activation des régions spécifiques.

Nous avons décrit comment la microinjection peut être utilisé comme un outil pour étudier les effets des protéines sur la morphologie des cellules et ont illustré cela en démontrant l’induction puissante des structures lamellipode NIH3T3 cellules fibroblastiques micro avec le petite GTPase Rac1. Nous avons déjà appliqué cette technique pour interférer avec la fonction Arp2/3 dans les cellules micro avec le domaine C-terminal CMA de Scar/WAVE³. Divers paramètres de cellules microinjectés peuvent être analysés par d’autres tests, tels que PAF ou photoactivation. Nous avons décrit comment FRAP et photoactivation peuvent être employées pour étudier la dynamique subcellulaire et la mobilité des monomères d’actine. PAF a été utilisé par notre groupe antérieurement⁵ pour enquêter sur le chiffre d’affaires de protéines localisation à lamellipodia, comme VASP, Abi, cortactin, cofilin et bouchage des protéines ou pour élucider le chiffre d’affaires des composants à créer des adhérences focales en présence et absence de Rac⁴de signalisation. En outre, mesurant les taux de polymérisation de l’actine est possible par photoblanchiment β-actine EGFP-étiquetée⁵, mais des méthodes alternatives existent. Suivi des inhomogénéités fluorescentes vue par les sondes de compatible avec l’imagerie de cellules vivantes étiquetage des filaments d’actine cellulaire, tels que Lifeact²⁵, peut également être employés^6,26. L’avantage ici est que la surexpression de β-actine peut être évitée, qui est capable d’augmenter la protrusion de bordure de cellule et de la migration et donc potentiellement interfère avec le dosage spécifique ou une question expérimentale (voir p. ex., Kage et al. ²⁶; Peckham et al. ²⁷). Toutefois, un désavantage distinct de la sonde Lifeact constitue sa rapide marche/arrêt cinétiques de liaison aux filaments d’actine, de sorte que blanchiment des structures de filament d’actine étiquetés par Lifeact dans les cellules fournit des informations uniquement sur le chiffre d’affaires de la sonde, mais pas le chiffre d’affaires des filaments d’actine, à qui il lie à²⁵. Le suivi des inhomogénéités de fluorescence employées précédemment^6,26 fournit-il un compromis pratique, très semblable au suivi largement utilisé des mouchetures de fluorescence incorporé filamenteux du cytosquelette Ouvrages d’art (voir p. ex., saumon et Waterman²⁸), mais peut-être pas aussi simple à utiliser et aussi précis que PAF des structures de l’actine F EGFP-tag. Photoactivation a été appliquée par nous pour l’estimation des taux d’incorporation de monomères d’actine en saillie lamellipodia, ainsi que sa mobilité dans le cytosol, dans le contexte d’écoute expérimentalement cytosolique actine F niveaux⁶. La technique est utile lorsque examine la mobilité et la distribution des protéines provenant de zones relativement importantes, comme les régions cytosoliques. Toutefois, examinant la distribution des protéines dérivées de photoactivation relativement petites structures ; par exemple, les cônes de croissance pourraient être difficiles en raison du nombre peu élevé de molécules fluorescentes activés, signaux faibles et donc manque de sensibilité. Des techniques alternatives potentielles de photoactivation ou photoconversion de fluorescence (voir ci-dessus) peuvent inclure inverse FRAP, qui s’appuie sur le photoblanchiment toute la cellule sauf le ROI, suivi par le suivi de la mobilité des molécules fluorescentes loin de cette région. La technique ne nécessite pas de surexprimant photoactivatable versions des protéines, mais consistera toujours à une exposition à une dose anormalement élevée de la puissance laser, pouvant causer des effets secondaires indésirables comme le photovieillissement.

De toute évidence, photoactivation et PAF ne peuvent pas distinguer si les protéines sont déplacent comme monomères, dimères ou même de petites oligomères et s’ils se déplacent en association avec des partenaires de liaison supplémentaires. De ce genre peut se renseigner à la place de corrélation de fluorescence spectroscopy techniques²⁹ ou, alternativement, FLIM-FRET³⁰. Néanmoins, FRAP et photoactivation constituent des approches simples pour évaluer directement la dynamique des protéines locales et mondiales dans les cellules, indépendamment de la protéine d’intérêt, localisation subcellulaire ou type cellulaire étudié.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B16-F1 cellules de mélanome de la peau de souris  ;	Collection de cultures de type américain, Manassas, VA	CRL-6323
NIH-3T3 cellules Collection	cultures de type américain, Manassas, VA	CRL-1658
DMEM 4,5 g/L de glucose  ;	Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Allemagne	41965-039
Ham' s F-12 medium	Sigma-Aldrich	N8641
Sérum de veau fœtal  ; (Crédit : FCS)	Laboratoires PAA, Linz, Autriche	A15-102
Sérum fœtal bovin (FBS)	Sigma-Aldrich, Allemagne	F7524	Lot054M3396
MEM Acides aminés non essentiels  ;	Gibco, ThermoFisher Scientific, Allemagne	11140035
L-Glumatine 200mM (100x)	Life Technologies	25030-024
Pen-Strep 5000 U/mL	Life technologies	15070063
Pyruvate de sodium (100 mM)	Gibco, ThermoFisher Scientific, Allemagne	11360-039
Laminin	Sigma-Aldrich	L-2020
Laminin tampon de revêtement  ;			Fabriqué par vous-même : 50 mM de Tris ph7.4, 150 mM
de fibronectine NaCl à partir de plasma humain.	Roche Diagnostics, Mannheim, Allemagne	11 051 407 001
Jetpei	Polyplus Transfection, Illkirch, France	101-10N
Tampon	JetPei Polyplus Transfection, Illkirch, France	702-50	150mM NaCl
PA-GFP-actine plasmide ADNbsp ;			décrit dans Koestler et al.2008
ADN plasmidique d’actine pEGFP-Clontech	, Mountain View, CA, USA
Protéine Rac1 pour micro-injection			Purifiée en version marquée GST et clivée de GST avant l’injection
Tampon			micro-injection Auto-fabriqué : 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT
Dextran, Texas Red, 70 000 MW, Sondes moléculaires fixables à la lysine	, Thermno Fisher Scientific, Allemagne	D1864
Microscope à couverture circulaire 15mm, N°1	Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Allemagne	1001/15
Eppendorf Femtotips Microloader Tips	Eppendorf, Hambourg, Allemagne	5242 956 003
Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips	Eppendorf, Hambourg, Allemagne	930000035
Graisse silicone  ;	ACC Silicones, Bridgewater, Angleterre	SGM494
Chambre d’imagerie à bain de diamant ouvert	en aluminium Warner instruments	RC-26
Régulateur de température automatique	Warner Instruments	TC-324B
Microscope : Axio Observer  ;	Carl Zeiss, Iéna, Allemagne
Appareil photo CoolSnap-HQ2  ;	Photométrie, Tucson, AZ
Source lumineuse Lambda DG4	Sutter Instrucment, Novato, CA
Source laser  ;	Visitron Systems
Micro-injecteur Eppendorf FemtoJet  ;	Eppendorf, Hambourg, Allemagne		Avec compresseur intégré pour l’alimentation en pression
de micromanipulateur Nikon Narishige	Nikon Instruments, Japon
Logiciel Visiview v2.1.4	Visitron Systems, Puchheim, Allemagne
Logiciel Metamorph v7.8.10	Dispositifs moléculaires, Sunnyvale, Californie
Sigma Plot v.12	Systat Software Inc.