Microscopie de lumière-feuille pour la visualisation en trois dimensions des cellules immunitaires humaines

Summary

Nous présentons ici un protocole afin de visualiser les cellules immunitaires noyées dans une matrice tridimensionnelle (3D) collagène microscope à lumière-feuille. Ce protocole précise également comment suivre la migration cellulaire en 3D. Ce protocole peut être utilisé pour d’autres types de cellules en suspension dans la matrice 3D.

Abstract

In vivo, l’activation, la prolifération et la fonction des cellules immunitaires tous se produisent dans un environnement de tridimensionnel (3D), par exemple dans les ganglions lymphatiques ou des tissus. Jusqu'à date, la plupart des systèmes in vitro reposent sur une surface bidimensionnelle (2D), tels que plaques de culture cellulaire ou de lamelles. De façon optimale de reproduire les conditions physiologiques in vitro, nous utilisons une matrice de collagène 3D simple. Collagène est l’une des principales composantes de la matrice extracellulaire (ECM) et a été largement utilisé pour constituer des matrices 3D. Pour l’imagerie 3D, la technologie de microscopie de lumière-feuille récemment développés (également dénommée microscopie illumination seul plan) est décrit avec acquisition haute vitesse, grande profondeur, faible de blanchiment et photocytotoxicité. En outre, microscopie à lumière-feuille est particulièrement avantageuse pour la mesure à long terme. Nous décrivons ici un protocole optimisé comment configurer et gérer les cellules immunitaires humaines, par exemple primaire humains lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et les cellules tueuses naturelles (NK) dans la matrice de collagène 3D pour une utilisation avec la microscopie en lumière-feuille pour l’imagerie de cellules vivantes et échantillons fixes. La procédure d’acquisition d’images et analyse de la migration cellulaire sont présentés. Une attention particulière est donnée pour mettre en évidence les étapes critiques et des facteurs pour la préparation des échantillons et l’analyse des données. Ce protocole peut être utilisé pour d’autres types de cellules en suspension dans une matrice de collagène 3D et n’est pas limité aux cellules immunitaires.

Introduction

La plupart des connaissances sur la migration cellules vient de 2D expériences^1,2,3, qui sont normalement effectués dans un verre ou une surface en plastique d’une culture/imagerie plat. Toutefois, un scénario physiologique exige, dans la plupart des cas, un micro-environnement 3D, dans laquelle la matrice extracellulaire (ECM) joue un rôle décisif. ECM non seulement fournit l’essentiel de la structure 3D afin de maintenir la morphologie cellulaire appropriée, mais offre également des signaux de survie ou des indications directionnelles pour un fonctionnement optimal de nombr....

Protocol

Les recherches menées pour la présente étude avec le matériel humain (chambres de système réduction leucocytaire de donneurs de sang humain) sont autorisé par le Comité d’éthique local (déclaration de 16.4.2015 (84/15 ; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) et suit les directives correspondantes.

1. préparation de la Solution de collagène neutralisée (500 µL)

1. Transférer 400 µL de la solution mère de collagène réfrigérés (10,4 mg/mL) dans un tube stérile de 1,5 mL sous le capot de la culture cellulaire. Lentement, ajouter 50 µL de réfrigérée 10 x PBS (pH de 7,0 à 7,3) à 400 µL de solution mère de collagène réfrigérés. Mélanger la solution de ....

Results

Formation de saillie au cours de la migration des cellules T est un processus très dynamique, qui est dépendante de l’actine. Pour visualiser la formation de saillie de CTL humain primaire, nous transfectées transitoirement une protéine mEGFP fusionné pour étiqueter le cytosquelette d’actine en CTL comme décrit avant¹¹. Un jour après la transfection, les cellules ont été incorporés dans la matrice de collagène. Piles d’images ont été acquises chaque 40 s avec une t.......

Discussion

La plupart des essais in vitro sont réalisées sur une surface 2D, par exemple dans les plaques de culture cellulaire, Pétri ou à lamelles, considérant que l’expérience in vivo des cellules, en particulier les cellules immunitaires, pour la plupart un micro-environnement 3D. Des preuves nouvelles montre que les patrons de migration des cellules immunitaires diffèrent entre 2D et 3D de scénarios¹⁷. En outre, les profils d’expression des cellules tumorales sont également différents .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibricol, solution de collagène bovin	Advanced Biomatrix	;#5133-20ML	Matrice de collagène
0,5 M Solution NaOH	Merck	1091381000	pour neutraliser la solution Fibricol
Agarose à fusion ultra-faible	Affymetrix	32821-10GM	Préparation d’échantillons dans des cellules T CD8 humaines à faible teneur en c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 Cell Kit	Thermo Fisher	11348D	Isolement des lymphocytes T CD8+ primaires humains à partir de PBMC
Dynabeads Activateur T humain CD3/CD28 pour l’expansion et l’activation des lymphocytes	T Thermo Fisher	11132D	Activation des populations de CTL
Interleukine-2 recombinante humaine	Thermo Fisher	PHC0023	Stimulation de CTL
P3 en culture Kit de solution primaire	Lonza	V4XP-30XX	Transfection
Anticorps &alpha ;-PFN1, lapin, IgG	Abcam	ab124904	IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Thermo Fisher	A22284	IF
CellMask Orange Membrane plasmique Stain Thermo	Fisher	C10045	Fluorescent cell
label Tween 20	Sigma	P1379-250mL	IF
Triton X-100	Eurobio	018774	IF
DPBS Solution saline tamponnée au phopsphhate de Dulbecco	Thermo Fisher	14190250	IF
Albumine sérique bovine	Sigma	A9418-100G	IF
Chèvre & alpha ; Rabbit 568, IgG, rabbit	Thermo Fisher	A-11011	IF
Lightsheet Z.1 (Microscopie à feuillet de lumière)	Zeiss	N.A.
Hotte de culture cellulaire	Thermo Fisher	HeraSafe KS
Incubateur de culture cellulaire HERACell 150i  ;	Thermo Fisher	N.A.
Centrifugeuses 5418 et 5452	Eppendorf	N.A.
Pippettes	Eppendorf	3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette pointes	VWR	89079-444, 89079-436, 89079-452  ;
Tubes de 15 mL	Sarstedt	; 62.554.002
Capillaires 50 & micro ; L	VWR (Marque)	613-3373	Zeiss LSFM Préparation d’échantillons
Piston pour capillaires	VWR (Marque)	BRND701934	"Tampons avec pointe en téflon » Préparation d’échantillons LSFM
MColorPhast Pointes de pH	Merck	1095430001	pour tester le pH des seringues neutralisées Fibricol
BD Plastipak 1mL	BD	Z230723  ; ALDRICH	Préparation alternative d’échantillons
Pâte à modeler (Hasbro Play-Doh A5417EU7)	Play-Doh	N.A.
Imaris file converter	Bitplane	disponible à l’adresse http ://www.bitplane.com  ;	Convertir des fichiers d’imagerie au format de fichier Imaris
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)	Bitplane	disponible à l’adresse http ://www.bitplane.com  ;	Analyse de données d’imagerie 3D et 4D