Cytométrie en combinaison avec les clusters visual vous propose une méthode rapide et facile à utiliser pour l’étude des biofilms aquatiques. Il peut être utilisé pour la caractérisation de biofilm, détection des changements dans la structure des communautés biofilm et détection des particules abiotiques incorporé dans le biofilm.
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Article de méthode
Caractérisation des Biofilms aquatiques avec écoulement Cytometry
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les biofilms sont des consortiums dynamiques des micro-organismes qui jouent un rôle clé dans les écosystèmes d’eau douce. En modifiant leur structure de la Communauté, les biofilms réagir rapidement aux changements environnementaux et peut être ainsi utilisés comme indicateurs de la qualité de l’eau. Actuellement, biofilm évaluation repose principalement sur des extrémités intégratives et fonctionnelles, telle que l’activité photosynthétique ou respiratoire, qui ne fournissent pas d’informations sur la structure communautaire de biofilm. Cytométrie en flux et visualisation informatique offrent une méthode alternative, sensible et facile à utiliser pour l’évaluation de la composition de la Communauté, en particulier de la partie photoautotrophes des biofilms d’eau douce. Il faut seulement préparation des échantillons de base, après quoi la totalité de l’échantillon est géré par le cytomètre en flux. L’information optique et à fluorescence de cellule unique est utilisée pour le calcul visualisation et interprétation biologique. Ses principaux avantages par rapport aux autres méthodes sont la vitesse d’analyse et de la nature de la haute teneur en information. Cytométrie en flux fournit des informations sur plusieurs caractéristiques cellulaires et biofilm dans une mesure unique : granulométrie, densité, teneur en pigments, abiotique contenu dans le biofilm et des informations taxonomiques grossiers. Toutefois, il ne fournit pas d’informations sur la composition de biofilm sur le niveau de l’espèce. Nous voyons un potentiel élevé dans l’utilisation de la méthode pour la surveillance environnementale des écosystèmes aquatiques et une évaluation initiale de biofilm, étape qui informe en aval détaillée enquêtes par des méthodes complémentaires et plus détaillées.
Introduction
Les biofilms sont des consortiums dynamiques des micro-organismes qui jouent un rôle clé dans les écosystèmes d’eau douce, allant de la production primaire, cycle des éléments nutritifs et de la purification de l’eau à influencer la distribution des micro-organismes et de leur biodiversité dans l’écosystème 1. lorsque les biofilms sont exposés aux conditions environnementales changeantes ou aux facteurs de stress, tels que les produits chimiques, leur structure de la communauté se déplace rapidement vers plus tolérants à l’espèce2,3. Leur haute sensibilité transforme biofilms en systèmes modèles attrayants pour surveillance environnementale4, toutefois, aucune des méthodes actuelles est parfaitement adapté pour réellement tracer la dynamique d’une communauté de biofilm de manière rapide et facile.
L’ensemble couramment utilisé des méthodes pour caractériser les biofilms consiste à mesurer les paramètres fonctionnels et structurels. Au niveau de l’ensemble de la Communauté, l’activité photosynthétique et respiratoire ainsi que l’activité des enzymes extracellulaires fournit des informations sur l’état fonctionnel du biofilm5,6,7,8 ,,9. Accumulation de biomasse est utilisée comme un indicateur de la croissance globale de biofilm. Des changements structurels sont actuellement mesurés soit en procédant à l’identification d’espèces traditionnelles avec la microscopie photonique ou axée sur les nucléotides techniques (p. ex., électrophorèse en gel en gradient (DGGE), automatisé ribosomique espaceur intergénique en présence analyse (ARISA), métagénomique)10,11,12. Ces méthodes fournissent des informations mais prennent du temps pour effectuer ou exiger de connaissances spécifiques ou sont encore en cours d’élaboration. Enfin, les nouvelles méthodes d’évaluation des substances polymériques extracellulaires (EPS)13,14 et le biofilm architecture1, tandis que sensible, sont de faible débit et n’ont pas encore été mis au point vers des fins de contrôle.
Il est évident que pour une caractérisation complète des biofilms d’eau douce, il est nécessaire de combiner plusieurs méthodes différentes, qui donnent un aperçu de la fonction de biofilm, la composition et l’architecture. Pour la surveillance de l’environnement, d’autre part, une méthode rapide et sensible qui est capable de détecter des changements dans le biofilm et de permettre une interprétation biologique fondamentale des déplacements au niveau fonctionnel et structurels est nécessaire.
Nous avons développé une nouvelle méthode pour la caractérisation de la communauté microbienne de la composante phototrophe de stream biofilms (périphyton), qui est assez rapide pour des fins de contrôle et en même temps fournit suffisamment d’informations sur la communauté de biofilm structure pour permettre une interprétation biologique15. Il est basé sur la cytométrie unicellulaires (FC) des échantillons de biofilm et couplé avec visualisation informatique et fournit des informations sur les propriétés optiques et fluorescentes du biofilm au niveau de la cellule unique.
Le flux de travail après l’échantillonnage de biofilm se compose de préparation de l’échantillon sous la forme de la sonication, de fixation et de filtrage par taille des échantillons suivis d’évaluation de l’échantillon par cytométrie en flux. Les données acquises renseignent sur plusieurs traits cellulaires dans une mesure unique : granulométrie, densité, pigment contenu, contenu abiotique (p. ex. microplastiques) dans le biofilm. Cet ensemble de données est qu’analysé via computational visualisation à l’aide de visual voisin stochastique embedding (viSNE)16, qui permet une interprétation rapide et facile des données. Bien que quelques semaines sont nécessaires pour configurer et optimiser la méthode, une fois mis en place, cela prend seulement quelques heures de collecte des échantillons de biofilm d’interprétation des résultats.
Les principaux avantages de la méthode présentée sur les autres sont la vitesse d’analyse et de la haute teneur en information. En outre, les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs semaines après le prélèvement sans perte de leur optique et propriétés de fluorescence. Cela peut être très utile lorsque la caractérisation d’un grand nombre d’échantillons est nécessaire, comme grand échantillonnages ou programmes de biosurveillance, mais peut aussi fournir une quantité importante d’informations dans les plus petites études exploratoires.
Le protocole présenté repose sur l’analyse de la cytométriques des phototrophes biofilms (périphyton) recueillie à différents sites d’un flux. Beaucoup d’étapes du protocole, par exemple la sélection des sites appropriés pour la pré-écoute, dépendre des objectifs de la recherche et par conséquent ne peut être prescrit. D’autres permettent moins de liberté et nécessitent que le protocole est suivi de près, ceci est rendu clair dans le protocole détaillé ci-dessous.
Le protocole commence par la sélection des sites pour la surveillance environnementale axée sur le biofilm. L’étape suivante consiste à installer le cytomètre en flux (FC) ainsi que ses dimensions permettent la discrimination entre les différents organismes phototrophes vivant dans les biofilms en milieu contrôlé. Cela est effectué par prélèvement d’échantillons de biofilm sur les sites, en identifiant les propriétés fluorescentes de différentes espèces présentes dans le biofilm et de mettre en place le cytomètre de flux avec des lasers et des filtres qui permettent de mesurer à l’optique longueurs d’onde. Une fois que le FC a été mise en place, les biofilms peuvent être recueillies sur les sites périodiquement, les propriétés optiques et fluorescentes des particules présentes dans le biofilm mesurée par cytométrie en flux-et les données analysées par regroupement visuel unique. Pour mieux interpréter les résultats, il est possible de construire une base de données de référence FC d’espèces locales de biofilm-vie et leurs phénotypes et la base de données permet d’identifier les différentes classifications dans les données FC. La validation est possible par le biais de tri basés sur la fluorescence des clusters identifiés des cellules simples utilisant des FACS et axée sur la microscopie des identification taxonomique des espèces présentes. Une représentation schématique du protocole est donnée à la Figure 1.
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Protocole
1. écosystème sélection et échantillonnage de Biofilm
- Sélectionnez un écosystème aquatique d’intérêt et trouver des sites d’échantillonnage où poussent des biofilms. Les parties peu profondes d’un ruisseau et lent à débit d’eau moyen et un lit pierreux pour fixation de biofilm sont appropriées17,18.
- Facultatif : Si le site n’a pas suffisamment de surfaces pour la fixation de biofilm ou de diminuer la variabilité des biofilms dans un site, placer des substrats artificiels pour la fixation de biofilm (par exemple des lames de verre, carreaux de céramique) dans le site, tout en veillant à ce que ils sont placés dans le même sens en ce qui concerne l’écoulement de l’eau et à la même profondeur et intensité lumineuse19.
- Pour déterminer les conditions environnementales sur le site d’échantillonnage, utilisation des instruments portables pour mesurer l’intensité de la lumière, température, conductivité, oxygène et pH juste au-dessus de la surface biofilm doit être prélevé. Au cours de l’échantillonnage, prendre des mesures répétées (3 – 5) afin de calculer les valeurs moyennes.
- En option : Prendre des échantillons d’eau afin de déterminer les paramètres chimiques de l’eau (carbone organique dissous (COD), K+, Na+, Ca2 +, Mg2 +, Cl–, F-, SO42 -, PO42 - , Non32 -, SiO44 -).
- À l’aide de gants de protection, recueillir des pierres comparables (en taille, forme et type) de chaque site (ou des substrats artificiels). Les pierres doivent être exposés aux flux similaire et des conditions de lumière18.
- Filtrer assez cours d’eau sur le site de 0,22 μm filtres, afin qu’il soit prêt pour l’ensemble des échantillons recueillis (p. ex., 15 mL par exemple).
- Utilisez une brosse douce pour enlever le biofilm du substrat dans une fiole (brosse jusqu'à l’élimination de toutes les biofilms) avec 15 mL de flux filtré l’eau20.
- Fixer les échantillons à 0,01 % paraformaldéhyde et 0,1 % de glutaraldéhyde21.
2. détermination des paramètres optimaux cytométriques (FC)
- Transférer des sous-échantillons dans un microscope photonique (utilisant un 40 X / 0.75 objectif ; si nécessaire utilise un objectif à huile 100 × 1,3) et identifier les espèces présentes dans les échantillons22,23.
- Seule espèce ordre identifié des collections de cultures appropriées (p. ex. la phycologie expérimentale et la Culture Collection of Algae à l’Université de Goettingen [EPSAG] ou la Culture Collection of Algae à l’Université de Cologne [CCPA] si surveillance est effectuée dans les écosystèmes européens centraux).
- La seule espèce en continu dans des conditions environnementales similaires (par exemple, la lumière, température, pH) atteignent l’environnement que les biofilm échantillons ont été prélevés. Votre séjour au sein de 1 ° C et 0,5 point de pH des échantillons environnementaux est recommandé.
- Pour détacher/disperser les cellules, mettre 15 mL d’échantillons de la même espèce dans des tubes à centrifuger et mettre les tubes dans le centre d’un bain d’eau et plonger, afin que la surface du liquide de l’échantillon est au même niveau que la surface de la baignoire. Laisser agir les échantillons pendant 1 min à 45 kHz24,25.
- Enregistrer les spectres d’absorption et de fluorescence de la seule espèce à l’aide d’un lecteur. Veuillez vous référer au lecteur de plaque de choix pour obtenir des instructions. Dans cet exemple, plaques polystyrol transparent fond plat de 96 puits ont été chargés avec volume d’échantillon de 200 µL et absorbance mesurée. (Paramètres utilisés : (a) fluorescence scan mode ; étape de longueur d’onde d’émission taille 10 nm, numéro d’analyse d’émission 30, bande passante 20 nm, gagner 100, 25 flashs, 20 US intégration temps ou absorbance (b) en mode scan ; 25 flashs, bande passante 9 nm).
- Mettre en place le cytomètre de flux avec des lasers, dichroïques séparateurs et filtres qui, en combinaison, couvrent toutes ces gammes fluorescentes dans laquelle les différentes espèces ont des propriétés spécifiques. Pour les flux européens centrales, une 405 nm, 488 nm et 638 nm laser produisent des résultats utiles.
- Ajustez le réglage de la tension de la Photomultiplier (ne s’applique pas à tous les cytomètres) et la gamme des fluorescences mesurées afin d’inclure au moins 99 % de tous les événements des échantillons.
- Par ailleurs, s’il dispose des connaissances sur les espèces présentes dans les biofilms, commencez par l’étape 2.2. Si les propriétés fluorescentes sont connues, commencez par étape 2.6.
3. facultative : Préparation d’une base de données de référence cytométriques
NOTE : FC ne permet pas l’identification taxonomique des cellules présentes dans le biofilm. Une base de données de référence de mesure de la FC de la seule espèce connue pour être présent dans les biofilms, cultivées dans des conditions similaires comme les biofilms, peut aider à l’interprétation des données.
-
Référence : monospécifique
- En utilisant les paramètres optimisés de FC mis en place à 2,5 – 7, mesurer les propriétés optiques et fluorescentes de monospécifique (fixe du paraformaldéhyde et glutaraldéhyde et filtré à l’aide de filtres de taille appropriée pour le cytomètre de flux).
- Normaliser les données de la seule espèce de la même manière que les données de biofilms (voir étape 6.1.2).
-
Référence : les cellules endommagées et en décomposition
Un des indicateurs plus importants de la santé de biofilm est la fraction des cellules endommagées/mourant présentes dans le biofilm. Afin de quantifier ces cellules, on peut préparer une référence de la décomposition des cellules.- Prendre les sous-échantillons de 1 mL de biofilms dilués et les centrifuger à température ambiante comprise entre 8 000 x g pendant 10 minutes dans une centrifugeuse de table. Suspendre la pastille qui en résulte dans 1 mL d’éthanol à 90 % et stocker la suspension pendant une nuit à 4 ° C. Répéter le jour suivant.
- Utilisez les paramètres optimisés de FC, mesurer les propriétés optiques et fluorescence des cellules endommagées et en décomposition (fixes et filtrée).
-
Référence : microplastiques
NOTE: si vous êtes intéressé dans la surveillance des particules de microplastic dans les biofilms, vérifier si elles diffèrent suffisamment de particules biotiques en optique et propriétés de fluorescence pour l’identification.- Suspendre les particules microplastic selon les instructions du producteur microplastiques et mesurer leurs propriétés optiques et fluorescentes (à l’aide des paramètres FC de 2,7).
- Ajouter les particules de microplastic à l’exemple de biofilm et laisser toute la nuit à 4 ° C.
- Filtrer la suspension et la mesure avec les mêmes paramètres FC que ci-dessus.
4. préparation des échantillons et stockage
- Une fois que le FC a été mis en place et la base de données de référence FC est prêt, il peut procéder à l’évaluation des échantillons frais de biofilm, recueillis selon les étapes 1.1 – 7. Pour détacher/disperser le biofilm, transfert 15 mL des échantillons de ces flacons (voir étape 1.7) dans des tubes à centrifuger.
- Mettre chaque tube dans le centre d’un bain d’eau et plonger jusqu'à ce que la surface du liquide de l’échantillon au même niveau que la surface de la baignoire. Laisser agir les échantillons pendant 1 min à 45 kHz.
- Fixer les échantillons à 0,01 % paraformaldéhyde et 0,1 % de glutaraldéhyde (stock eau nanopure). Conserver à 4 ° C jusqu’au moment de l’analyse.
- Important : Utiliser la moitié des échantillons pour l’analyse de la cytométrie en flux- et garder la moitié dans le stockage pour la sécurité et pour la validation en option avec fluorescence-lancée de cellules tri et/ou la microscopie photonique (voir la Section 6).
NOTE: stockés dans le réfrigérateur, les échantillons de biofilm fixe doivent conserver leurs propriétés optiques et fluorescentes pendant jusqu'à trois semaines.
5. exécution de l’exemple par le biais de la FC
- Si les échantillons ont été conservés dans le réfrigérateur, les laisser agir rapidement ou pipette plusieurs fois afin de séparer les particules. Filtrer les sous-échantillons avec 50 μm filtres (filtre taille dépend de la largeur du FC capillaire) avant chaque mesure.
- Charger les échantillons individuels (1 à 2 mL, cela dépend du cytomètre de flux utilisé) dans le cytomètre de flux et de mesurer les propriétés optiques et fluorescentes de chaque particule. Recommencez la mesure trois fois par chaque réplicat biologique (trois répétitions techniques).
- Exporter les données de la FC au format .csv.
6. préparation et analyse de corrélation
FC peut analyser plusieurs paramètres (p. ex., zone de signal, hauteur, largeur) pour chaque propriété optique mesurée et la gamme de fluorescence. Exécuter une analyse de corrélation sur les variables mesurées et ne conserver que ces mesures qui ne sont pas fortement corrélées. Habituellement, cette opération supprime tout sauf un seul paramètre FC (p. ex., zone de signal) et peut également supprimer fortement corrélées fluorescents mesures (généralement issus du laser et les voisins de filtres).
-
Exécutez CYT comme une boîte à outils de Matlab :
- Importer les données FC réduites au format .csv de tous les échantillons qui doivent être analysés dans le CYT logiciel16, y compris toutes les techniques et biologiques réplique. (Cliquez sur +, *.csv filtre de fichier, sélectionnez fichiers d’importation).
- Transformer les canaux fluorescents de tous les échantillons à l’aide de la transformation d’arcsinus hyperbolique. La valeur du cofacteur doit être sélectionné ; 150 œuvres pour plus des biofilms phototrophes et cytomètres de flux, mais optimisation pourraient être nécessaires pour les configurations expérimentales particulières et des biofilms hétérotrophes. (Right-Click/transformation/entrez cofacteur 150)
- Pour le contrôle de qualité, comparer visuellement (en CYT) les histogrammes des échantillons individuels et chaque canal optique et à fluorescence pour s’assurer qu’aucune des valeurs aberrantes au niveau technique et biologique de la réplication. Valeurs aberrantes seront manifestera dans les distributions fluorescent/optique sensiblement décalées entre les réplicats. (Sélectionner les données, sélectionnez canal, terrain)
- Variante : exécuter une analyse en composantes principales (PCA) sur les valeurs médianes des distributions fluorescentes et assurez-vous que les réplicats techniques et biologiques cluster ensemble.
- Fusionner la technique se reproduit dans chaque réplicat biologique et sous-échantillon les réplicats biologiques, afin que chacun est représenté par le même nombre de particules (cellules, fragment de cellules et particules abiotiques) et que le nombre total de particules analysées par Barnes-refuge voisin stochastique embedding (bh-SNE) est environ 150 000 (pour une meilleure visualisation des résultats26). (Sélectionner les données, faites un clic droit, fusion/sous-échantillon)
- Pour la comparaison entre les échantillons, il est important de sélectionner seulement les échantillons qui doivent être comparés. Prélever des échantillons et exécutez bh-SNE27. Une fois que l’algorithme est terminé, de nouveaux canaux, nommée bh-SNE1 et bh-SNE2 apparaissent. Voici les coordonnées SNE de toutes les particules analysées, qui peuvent être utilisés pour visualiser les données dans un diagramme de dispersion (carte viSNE). (Sélectionner les données, sélectionner des canaux, clic droit, bh-SNE, oui données normalisées)
- Dans le plan de viSNE, particules positionnés similitude et regroupées en grappes visuellement séparables. Inspecter les propriétés optiques/fluorescent de l’amas et la marque et le nom de ceux qui sont bien séparées et ont des propriétés différentes optiques/fluorescence en utilisant les outils de dessin disponibles dans CYT. (Channel select bh-SNE1, bh-SNE2)
- Facultatif : Si une base de données de référence de la seule espèce microbienne (mesuré avec le même paramètre de cytométrie en flux- et cultivés dans des conditions similaires !) est disponible, exporter les cartes viSNE dans Matlab et projeter la base de données de référence sur les cartes. De cette façon, amas particuliers peuvent être connectés à particulier espèces/groupes taxonomiques (scripts disponibles en téléchargement sur https://github.com/anzezupanic/FC_analysis). (Session/enregistrer)
- Dépannage : Si l’analyse de bh-SNE ne retourne pas les grappes visuellement séparables, mais un seul grand, trop de particules ont été utilisés dans le bh-SNE. Essayez avec moins de particules par échantillon. S’il n’y a pas de grappes, mais des points individuels plutôt clairsemées, augmenter le nombre de particules utilisé.
- En option : Au lieu de compter sur bh-SNE le regroupement, autres méthodes de clustering (p. ex., hiérarchique, axée sur le centre de gravité ou densité fondé de clustering) peuvent être utilisés sur les données normalisées et puis superposées sur la carte de viSNE (https://github.com/ anzezupanic/FC_analysis).
- Une fois que les grappes ont été identifiés, compter le nombre de particules dans chaque cluster appartenant à chaque réplicat biologique dans chaque échantillon. Évaluer les différences entre les échantillons, à l’aide de test ANOVA et de Tukey avec appropriée (p. ex., Holmes) correction de comparaison multiple.
7. facultative : Validation d’interprétation de Cluster à l’aide de tri cellulaire activés par Fluorescence
- Une fois que les grappes ont été identifiés, utilisez cellule activée par fluorescence triant (FACS) pour trier des échantillons si vous le souhaitez, sous réserve que les FACS a une configuration similaire (ou identique) des lasers et des filtres fluorescents.
- Pour chaque cluster identifié, CYT fournit des portes optiques et à fluorescence qui définissent le cluster. Ces portes permet de trier les particules dans chaque cluster avec les FACS et puis identifier les cellules triées au microscope photonique.
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Résultats
Échantillons prélevés sur plusieurs sites d’un ruisseau local en Suisse à l’aide de la procédure présentée ici (Figure 1), ont été analysés. À chaque endroit, trois pierres de tailles similaires (10 à 12 cm) ont été prises, et biofilms ont brossé les pierres. Les échantillons ont été alors sonication, fixe, filtré et ensuite analysés par cytométrie en flux. Le programme d’installation du cytomètre de flux et de la base de données de référence utilisées étaien...
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Discussion
Le protocole décrit ci-dessus est relativement simple à implémenter. Toutefois, les paramètres par défaut présentés ont été montré pour convenir à tous les phototrophe biofilm testé jusqu'à présent, optimisation (comme décrit dans le protocole) est nécessaire pour maximiser les informations obtenues par la méthode. En effet, les propriétés optiques et fluorescentes de biofilms peuvent varier, selon les conditions environnementales (saison, température, composition chimique de l’eau)1. Par conséque...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Le travail présenté a été soutenu par un SNF Ambizione Fellowship (PZ00P2_142533) et une subvention de recherche de Velux (Amplebig). Nous tenons à remercier Bettina Wagner de l’aide avec le travail expérimental.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Multimètre | WTW | MultiLine 3620 IDS | Pour la mesure de la température, du pH, de l’oxygène dissous |
| Nettoyeur à ultrasons | VWR International | 97043-986 | Dimensions du réservoir : 15*14*10 cm |
| Cytomètre en flux | Beckman Coulter | Gallios | Lasers : 405, 488 et 638 nm. Bandes de filtres dans le tableau supplémentaire 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. ; |
| Lecteur de plaques | Tecan | Infinite M200 | utilisé pour sélectionner le réglage approprié du |
| trieur de cellules | Beckman Coulter | MoFlo Astrios Paramètres dans le | tableau supplémentaire 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. ; |
| Microscope à fluorescence | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 |
| objectif LOGICIEL | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | logiciel pour le calcul numérique |
| CYT | Dana Pe’er Lab | Version 1.1 | outil de visualisation interactif gratuit pour l’analyse des données de cytométrie |
Références
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Réimpressions et autorisations
