Article de méthode

Isolement de cellules du stroma endométriales humains pour In Vitro décidualisation

DOI :

10.3791/57684

⸱

1 septembre 2018

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Health Sciences, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude présente une procédure validée et optimisée pour l’isolement et la culture de cellules stromales endométriales humaines pour mener l’essai in vitro décidualisation avec. En outre, cette étude fournit une méthode détaillée pour efficacement défiant un gène spécifique à l’aide de siARN dans les cellules du stroma endométriales humains.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La différenciation des cellules stromales endomètre humaines (CSEh) de fibroblastes-comme l’aspect en decidua sécrétoire est une transformation nécessaire pour l’implantation de l’embryon dans la muqueuse utérine de l’utérus maternel. Décidualisation incorrecte a été établie comme une cause de racine d’échec d’implantation et ultérieures déni d’embryon précoce. Comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la décidualisation est donc avantageux d’améliorer le taux de naissances avec succès. In vivo études de décidualisation artificielle limitent souvent due à des dilemmes éthiques associées à la recherche humaine, ainsi que des complications translationnelles dans des modèles animaux. Ainsi, des essais in vitro par culture de cellules primaires servent souvent pour explorer la modulation de décidualisation via les hormones. Cette étude fournit un protocole détaillé pour l’isolement des CSEh et ultérieure décidualisation artificielle par l’intermédiaire de la supplémentation d’hormones dans le milieu de culture. En outre, cette étude fournit une méthode bien conçue pour knockdown aucun gène d’intérêt en utilisant la base de lipides siARN transfections. Ce protocole permet l’optimisation de la pureté de la culture mais aussi de rendement produit, maximisant ainsi la possibilité d’utiliser ce modèle comme une méthode fiable pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents décidualisation et la quantification ultérieure des agents sécrétés par les cellules du stroma endométriales decidualized.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Entre les étapes de la puberté et la ménopause, les femmes en âge de procréer subissent des cycles mensuels de prolifération endométriale hormone réglementés, différenciation et excrétion ultérieure en vue de la grossesse dans un processus appelé menstruation1 ,2. Ces modifications physiques de l’endomètre humain sont nécessaires pour l’implantation de l’embryon appropriée dans la paroi utérine1. Modifications de l’endomètre, y compris les adaptations morphologiques et biochimiques, sont effectuent tout au long du cycle menstruel par l’intermédiaire des hormones stéroïdes ovariens oestrogène et la progestérone (P4)3,4,5. Dans la phase proliférative (ou folliculaire), œstrogène préovulatoire niveaux augmentation, initiant l’épaississement de l’endomètre. Après l’ovulation, la phase sécrétoire (ou lutéale) favorise une augmentation significative des concentrations de P4, induisant la transformation morphologique des cellules du stroma endométriales (ESC) de fibroblastes-comme l’aspect des arrondis, les cellules épithéliales déciduale dans un processus appelé décidualisation4,6. Décidualisation incorrecte a été établie comme des causes profondes pour échec d’implantation et ultérieures début embryon fausse couche4,7,8. Par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la décidualisation est avantageuse pour le diagnostic et le traitement de la perte précoce de la grossesse.

Actuellement, plusieurs méthodes sont utilisées pour examiner les effets sous-jacents de décidualisation sur les cellules du stroma endométriales. In vivo, l’utérus de souris peut être induite artificiellement pour décidualisation via une stimulation mécanique (c.-à-d., grattage) ou injection dans un utérus hormonalement apprêtée9d’huile. Distincte de l’homme, cette stimulation synthétique favorise la différenciation de la lumière utérine en offrant l’apparence de la présence de blastocyste, une étape qui est requise pour l’ouverture de décidualisation rongeurs10,11. En conséquence, en raison de complications translationnelles associées à des modèles animaux et les dilemmes éthiques qui entourent en vivo basé des études chez l’homme, modèles de décidualisation basée sont étudiés avec plus de succès in vitro.

Dans cette étude, les sujets sont recrutés par le placement de publicités dans les deux journaux locaux en anglais et en espagnol. Sujets identifiés comme des candidats appropriés pour cette étude sont présentées rencontrer le coordonnateur de la recherche, dans lequel une divulgation complète des risques potentiels sont discutés. Lors de la confirmation d’une compréhension complète des risques potentiels, le consentement des sujets est atteint sous forme écrite et verbale. Consentement du sujet inclut la permission de (1) subissent une phlébotomie (2) durablement de leurs tissus à des fins de recherches futures et (3) d’accord pour la création de cultures primaires d’après des échantillons de tissus prélevés. Après consentement, les sujets reçoivent un formulaire à remplir dans lequel auto-identification permise d’ethnie et/ou le droit de non-divulgation. Une visite ultérieure est prévue pour atteindre la biopsie de l’endomètre basée sur le cycle menstruel du sujet. Volontaires recrutés pour cette étude reflètent les deux la démographie ethnique et raciale de la région métropolitaine de Saint-Louis, répertoriés par le recensement 2012 et n’impliquant pas la participation d’une population vulnérable, y compris les femmes enceintes, les fœtus, les embryons, enfants de moins de 18 ans d’âge, ou d’autres groupes vulnérables. Conditions d’admissibilité à la participation à la collecte d’échantillons de biopsie incluent (1) être âgés de 18 à 45 ans (2) ayant des cycles menstruels réguliers (25 à 32 jours) (3) n’ayant aucun grossesse actuelle ou l’utilisation de contraceptifs hormonaux/intra-utérine périphérique pendant 30 jours précédant l’inscription (4) n’ayant aucun courante infection vaginale ou les maladies sexuellement transmissibles (5) vu aucun traitements antibiotiques actuels et (6) n’ayant aucun courant frottis de Pap.

Dans cette étude, les cellules stromales endométriales humaines (CSEh) sont cultivées et artificiellement induits in vitro la décidualisation par lorsqu’il s’agit d’hormones (estradiol (E2), l’acétate de médroxyprogestérone (MPA) et adénosine cyclique de subir monophosphate cyclique (AMPc)) au milieu. Dans cette méthode, le degré de décidualisation est modifié basée sur le nombre total de jours de traitement hormonal. Parallèlement à la réorganisation du cytosquelette, la supplémentation hormonale induit des adaptations biochimiques dans lequel les cellules déciduale expérience sécrétoire qualités2,4. L’expression des gènes de hallmark, tels que la prolactine (PRL) et la protéine de liaison d’insuline-like growth factor 1 (IGFBP1), peut être utilisée pour confirmer et quantifier le degré de CSEh décidualisation5,12, 13 , 14. ce qui est important, la viabilité de ce protocole pour mener de précipitation spécifique de gène est également démontrée.

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Protocole

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Toutes les biopsies de l’endomètre humain recueillies pour cette étude ont été obtenus de l’Université de Washington à St. Louis, Département d’obstétrique et gynécologie à l’aide de l’Institutional Review Board (IRB) a approuvé le formulaire de consentement.

1. préparation

  1. Préparer 500 mL de 1 x de Hank Balanced Salt Solution (HBSS) en ajoutant 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine à la bouteille contenant de médias (plus référencée comme HBSS + support).
  2. Préparer 500 mL de milieu d’Eagle modifié de Dulbecco : mélange de nutriments F-12 (DMEM/F12), avec le rouge de phénol, L-glutamine et l’acide-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 15 mM 4 (HEPES) en ajoutant 1 % solution antibiotique-antimycosiques (la concentration finale est 100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine et 0,25 µg/mL Fungizone) aux médias contenant bouteille (plus référencée comme les milieux d’isolement CSEh).
  3. Préparer 500 mL de DMEM/F12 avec rouge de phénol, de L-glutamine et 15 mM HEPES en ajoutant 10 % sérum bovin fœtal (SVF), 1 x Na2HCO3et 1 % la pénicilline (10 000 U/mL) et à la streptomycine (10 000 µg/mL) (Pen Strep) aux médias contenant bouteille (plus référencé en tant que média de CSEh).
  4. Préparer 500 mL de milieu de sérum réduit avec la L-Glutamine, 2,4 g/L de bicarbonate de sodium et HEPES avec 2 % charbon dépouillé sérum de veau fœtal (csFBS) et 1 % Pen Strep aux médias contenant bouteille (encore appelé décidualisation Media).
  5. Préparer 500 mL de phénol rouge gratuit DMEM/F12 en ajoutant 2 % de charbon de bois dépouillé de sérum de veau fœtal (csFBS) dans les médias contenant bouteille (plus référencée comme médias de changement).
  6. Préparer 10 nM estradiol (E2), acétate de médroxyprogestérone 1 µM (MPA) et 50 µM adénosine monophosphate cyclique (AMPc) dans un tube conique polypropylène 15 mL et ajouter à une 2 mL par puits aliquote de médias de décidualisation préalablement préparée pour in vitro dosage de décidualisation (plus référencé comme support de la CBE).
  7. Préparer 50 mL de gel médias avec 90 % de SVF et 10 % de diméthyl sulfoxide (DMSO) dans un tube conique polypropylène de 50 mL (plus référencé comme support de congélation).
  8. Les peser 25 mg de collagénase et 5 mg de DNase I dans un tube en polypropylène 50 mL conique et conserver à-20 ° C.

2. Acquisition de biopsie de l’endomètre humain

  1. Obtenir des échantillons de biopsie de l’endomètre humain recueillis lors de la phase proliférative (jour 9 - 12 jours) du cycle menstruel de la clinique de la CISR a approuvé à HBSS.
  2. Laver des biopsies avec 1 mL de préchauffée à 37 ° C HBSS + moyennes et secouez légèrement pour enlever l’excès sanguin et de la muqueuse.

3. isolement de cellules stromales endométriales humaines (CSEh)

Remarque : Cette procédure d’isolement est réalisée dans un environnement stérile sous une hotte de sécurité biologique.

  1. Transférer la biopsie avec une pince stérilisée dans un tube à centrifuger conique de polypropylène 50 mL contenant 10 mL HBSS fraîches.
  2. Centrifuger la biopsie à la température ambiante à 500 g pendant 90 s.
    1. Si les ruptures de culot cellulaire, re-spin la biopsie à 2 000 x g pendant 90 s.
  3. Retirez le support à l’aide d’une pipette de 1 mL et lavage avec 10 mL de 37 ° C préchauffé les milieux d’isolement de CSEh suivies par centrifugation à 500 g pendant 90 s.
  4. Retirez le support à l’aide d’une pipette de 1 mL et vigoureusement ajouter 3 mL de frais milieux d’isolement de CSEh pour déloger la biopsie.
  5. Décanter la biopsie dans une boîte de Pétri contenant 5 mL de milieux d’isolement de CSEh.
  6. Émincer la biopsie en tant que petits morceaux possible à l’aide de #5 pinces et ciseaux fine point droit pendant environ 20 minutes.
  7. Préparer la DNase I et enzymes collagénase en ajoutant 10 mL de milieux d’isolement CSEh à pré-pesés DNase I (0,5 mg/mL) et collagénase (2,5 mg/mL). Mélanger avec la pipette.
  8. Pipette de coupe les échantillons de tissus à l’aide d’une pipette de 1 mL dans un nouveau tube polypropylène conique de 50 mL. Laver avec 7 mL de milieux d’isolement CSEh et ajouter dans le tube en polypropylène pour acquérir l’ensemble de l’échantillon.
  9. Centrifuger l’échantillon à la température ambiante à 800 x g pendant 2 min. Retirez délicatement le surnageant de pipette.
  10. Filtrer la DNase collagénase solution par le biais de 0,2 µm filtre et j’ai attachés à la seringue de 10 mL directement sur pellet.
  11. Vortexer pendant 10 s pour remettre en suspension les granulés.
  12. Digérer au bain-marie à 37 ° C pendant 1,5 h, vortex pour 10 s soigneusement toutes les 10 min, jusqu'à ce que le tissu est digéré.
  13. Filtrer l’échantillon à travers une passoire de cellule 40 µm empilés sur un tube en polypropylène 50 mL conique pour éliminer les cellules épithéliales et les débris tissulaires.
    Remarque : Les cellules du stroma sont dans le tube en polypropylène 50 mL conique.
  14. Centrifuger le tube polypropylène conique de 50 mL à 800 g pendant 2,5 min à température ambiante. Retirez délicatement le surnageant avec une pipette de 1 mL.
  15. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieux d’isolement de CSEh.
  16. Centrifuger à 800 g pour 2,5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et puis remettre en suspension les cellules dans 6 mL de CSEh Media et pipette avant et arrière pour mélanger.
  17. Couche lentement sur 3 mL de média gradient de densité pour les cellules resuspendues afin de séparer les cellules restantes de sang des cellules stromales, en veillant à ne pas mélanger les couches.
  18. Centrifuger le tube de 15 mL en polypropylène à 400 g pendant 30 min à température ambiante.
  19. Collecter 5 mL du surnageant dans un nouveau tube en polypropylène 50 mL et ajouter une supplémentaire 5 mL CSEh Media pour remettre en suspension les cellules.
  20. Centrifuger à 800 g pour 2,5 min à température ambiante, suivie de la suppression du liquide surnageant et ajout de 6 mL de milieu de CSEh. Vortex l’échantillon de 10 s et mélanger en pipettant également, avance et retour 5 fois.
  21. Aliquote 10 µL de cellules remises en suspension à un tube de microtubes de 1,5 mL pour la numération des cellules.
  22. Ajouter 10 µL de 0,4 % le bleu Trypan tache cellulaire aliquote et mélanger avec la pipette. Charger de 10 µL de l’aliquote et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
  23. Plaque de cellules dans une fiole appropriée dépend du nombre de cellules total dans 15 mL de milieu de CSEh.
    1. Si le nombre total de cellules est inférieur à 1 million, plaque de toutes les cellules dans ballon 25 cm avec 6 mL de CSEh Media. Si le nombre total de cellules est plus de 1 million, plaque de toutes les cellules dans ballon 75 cm avec 15 mL de CSEh Media.
  24. La culture des cellules dans un incubateur à CO 5 %2 à 37 ° C pendant au moins 6 h pour assurer l’adhérence de la cellule appropriée et changer les médias en médias CSEh.
  25. Culture le CSEh isolé dans un 5 % CO2 incubateur à 37 ° C pendant une période de 3 à 5 jours jusqu'à ce que les cellules forment une monocouche atteindre 80-90 % confluence dans un ballon plaqué.
  26. Changer les CSEh médias tous les deux jours.
    1. Médias de CSEh chaud dans un bain d’eau de 37 ° C pendant 15-20 min.
    2. Aspirer les médias de la fiole et ajouter des supports neufs de CSEh dans le ballon (volume de travail : 8 ou 16 mL par flacon de 25 cm ou 75 cm respectivement).
    3. Placer le ballon dans le 5 % CO2 incubateur à 37 ° C jusqu'à ce que la confluence de 80 à 90 % est atteint.
  27. Une fois CSEh devenir confluente de 80 à 90 %, les cellules de transfert de 25 cm à 75 cm flacon ou d’une fiole de 75 cm à trois flacons de 75 cm.
    NOTE : CSEh peut être congelé et stocké pour un usage ultérieur en ce moment d’expérimentation future.

4. gel et de dégel CSEh

  1. Aspirer les médias de la fiole de 75 cm et ajouter 2 mL de trypsine-EDTA.
  2. Incuber dans une étuve à2 CO 5 % pendant 2-3 min à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules se déloger de la fiole.
  3. Ajouter 7 mL de CSEh Media et mélanger bien en pipettant également, avant et arrière.
  4. Centrifuger à 800 g pour 2,5 min et aspirer le surnageant.
  5. Identifier les tubes gel avec lignée cellulaire, la date et le numéro de passage.
  6. Resuspendre le culot dans 5 mL de gel de médias.
  7. Aliquote 1 mL de la CSEh remises en suspension dans chaque tubes tube et transfert pour congélateur-80 ° C.
  8. Transfert des tubes à l’azote liquide dans les 24 heures.
    NOTE : Si vous voulez décongeler des cellules dans un avenir immédiat, stocker des cellules congelées à-80 ° C pendant un mois.
  9. Pour dégeler les CSEh Préchauffer CSEh médias pendant 20 min.
  10. Ajoutez 8 mL de médias de CSEh préchauffé dans ballon 25 cm.
  11. Extraire le tube de gel de la cuve d’azote liquide ou de-80 ° C et plonger le tube dans le bain-marie à 37 ° C pendant 1 à 2 min à dégeler les cellules.
  12. Transférer les CSEh décongelé dans une fiole jaugée de 25 cm avec les médias de CSEh et incuber dans une étuve à2 CO 5 % pendant une nuit à 37 ° C.
  13. Lendemain, changer les médias CSEh et attendre 2 ou 3 jours jusqu'à ce que les CSEh deviennent confluente et cellules de transfert dans ballon 75 cm tel que décrit ci-après dans le Protocole N° 5.
    1. Médias de CSEh chaud dans un bain d’eau de 37 ° C pendant 15-20 min.
    2. Aspirer les médias de la fiole et ajouter des supports neufs de CSEh dans le ballon (volume de travail : 8 ou 16 mL par flacon de 25 cm ou 75 cm respectivement).
    3. Placer le ballon dans le 5 % CO2 incubateur à 37 ° C jusqu'à ce que la confluence de 80 à 90 % est atteint.

5. culture de cellules Stromal endométrial humaines (CSEh)

Remarque : Cette procédure Culturing s’effectue dans un environnement stérile sous une hotte de sécurité biologique.

  1. Préchauffer les CSEh Media à 37 ° C au bain-marie pendant 20-30 min.
  2. Aspirer les médias du flacon et ajouter de l’acide éthylènediaminetétraacétique 0,25 % trypsine (EDTA) (mL 1 flacon de 25 cm ou 2 mL pour ballon 75 cm).
  3. Incuber dans un incubateur à CO 5 %2 à 37 ° C pendant 2-3 min jusqu'à ce que les cellules déloger.
  4. Tapotez doucement les parois du ballon pour déloger les cellules restantes. Ajouter 7 mL de CSEh Media et mélanger bien en pipettant également, avant et arrière.
  5. Ajouter le mélange de cellules dans un tube en polypropylène 50 mL conique et centrifuger à 800 x g pendant 2,5 min à température ambiante.
  6. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans les médias de CSEh.
    1. Ajouter 15 mL pour flacon de 25 cm ou 45mL pour 75 cm ballon (15 mL chaque).
  7. Ajouter 5 mL ou 15 mL de suspension de cellules dans chaque fiole 25 cm ou 75 cm respectivement.
  8. Culture le CSEh isolé dans un 5 % CO2 incubateur à 37 ° C pendant une période de 3 à 5 jours jusqu'à ce que les cellules forment une monocouche atteindre 80-90 % confluence dans un ballon plaqué.
  9. Changer les CSEh médias tous les deux jours.
    1. Médias de CSEh chaud dans un bain d’eau de 37 ° C pendant 15-20 min.
    2. Aspirer les médias de la fiole et ajouter des supports neufs de CSEh dans le ballon (volume de travail : 8 ou 16 mL par flacon de 25 cm ou 75 cm respectivement).
    3. Placer le ballon dans le 5 % CO2 incubateur à 37 ° C jusqu'à ce que la confluence de 80 à 90 % est atteint.

6. humain l’endomètre Stromal Cell (CSEh) placage et Transfection de siARN

Remarque : Cette procédure de transfection est effectuée dans un environnement stérile sous une hotte de sécurité biologique.

  1. Aspirer les CSEh Media de la fiole de 75 cm et ajouter 2 mL de solution de trypsine-EDTA de 0,25 %.
  2. Incuber dans 5 % CO2 incubateur à 37 ° C pendant 2-3 min jusqu'à ce que les cellules déloger.
  3. Une fois que les cellules sont délogés du flacon, ajouter 7 mL de CSEh Media et mélanger doucement en pipettant également, vers l’avant et inverser 5 fois.
  4. Ajouter le mélange de cellules dans un tube en polypropylène 50 mL conique et centrifuger à 800 x g pendant 2,5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et Resuspendre le culot dans 10 mL de CSEh Media.
    Remarque : Si les cellules de plus d’une fiole de placage, tout simplement augmenter le volume de CSEh Media.
  5. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
    1. Aliquote 10 µL de cellules remises en suspension dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
    2. Ajouter 10 µL de 0,4 % le bleu Trypan tacher à cellule aliquote et mélanger en pipettant également vers l’avant et inverser.
  6. Plaque de 0,8 x 105 cellules par puits dans les plaques 6 puits. Après deux jours, les cellules devraient être anastomosé de 60 à 70 % pour la transfection optimale.
  7. Pour chaque échantillon de transfection de siARN, préparer des complexes à l’aide de siARN (60 nanomoles) au réactif de transfection.
  8. Diluer 5 µL de réactif de transfection dans 150 µL de médias libres sériques réduites et incuber pendant 5 min.
  9. Diluer 60 nanomoles de siARN dans 100 µL de médias libres sériques réduites et incuber pendant 5 min.
  10. Après 5 minutes, combiner des siARN dilué avec la solution de réactif de transfection dilué et mélanger doucement en pipettant également vers l’avant et inverser 5 fois.
    Remarque : Si transfectants un ou plusieurs siARN dans plusieurs puits, préparer un mélange maître dans 10 mL tubes en polystyrène.
  11. Incuber les complexes réactif siARN-transfection pendant 5 min à température ambiante.
  12. Durant cette incubation, ajouter 1 mL de médias de changement à chaque puits.
  13. Après 5 min d’incubation, centrifuger les tubes à 500 g pendant 2 min recueillir de solution et ajouter les 250 µL de complexes de réactif de siARN-transfection dans chaque cupule contenant des cellules et des médias.
  14. Mélanger en poussant doucement et incuber les cellules à 37° C dans une étuve à2 CO 5 % pendant 5 h.
  15. Après 5 h, remplacez les médias médias CSEh.
  16. Incuber les cellules à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pendant 2 jours en vue d’un essai in vitro décidualisation avec.

7. essai in Vitro décidualisation avec

Remarque : Cette analyse est réalisée dans un environnement stérile sous une hotte de sécurité biologique.

  1. Préparer les médias CBE avant d’entreprendre le traitement de décidualisation in vitro , tel que décrit dans Camden et al. 3 (voir 1.6).
  2. Aspirer les médias de la post-48 heure ligne transfectée de CSEh incubé à l’étape 6.16.
  3. Ajouter 2 mL d’EPC multimédia dans chaque puits.
    Note : comme un contrôle, laisser un jeu de cellules non traité avec les médias de la CBE. Au lieu de cela, ajouter 2 mL de CSEh Media dans les puits de contrôle.
  4. Incuber les cellules dans 5 % CO2 incubateur à 37 ° C pendant 6 jours.
    1. Modifier les médias CBE toutes les 48 heures.
      1. Réchauffer et préparer les milieux de l’EPC dans un bain-marie à 37 ° C pendant 15-20 min.
      2. Aspirer les médias du puits et ajouter les supports neufs CBE.
      3. Replacez la plaque dans le 5 % CO2 incubateur à 37 ° C.
  5. Après le sixième jour, analyser l’étendue de la décidualisation de cellules stromales via ELISA et qRT-PCR (comme décrit ci-dessous).

8. validation de décidualisation In Vitro utilisant la PCR Quantitative en temps réel (qRT-PCR)

Note : qRT-PCR est complétée comme décrit dans Kommagani et al.10.

  1. Isoler l’ARN total de CSEh utilisant le protocole d’un kit d’isolation d’ARN disponible dans le commerce.
    1. Analyser la quantité de RNA et de la pureté (un260/a280) utilisant un NanoDrop ou une méthode similaire, comme décrit dans Elias-Garcia et al.15.
  2. Synthétiser des ADNc de 1 µg d’ARN total via un protocole de kit de transcription inverse disponibles dans le commerce.
  3. Exécutez une réaction qRT-PCR comme décrit dans un protocole de kit qRT-PCR disponibles dans le commerce.
    1. Effectuer la réaction en utilisant un mélange de maître de la PCR en temps réel disponibles dans le commerce et sondes de gènes spécifiques ainsi que les réglages de système interne (18 s, PRLet IGFBP1).

9. validation de décidualisation In Vitro utilisant ELISA

  1. Quantifier le taux de prolactine sécrétée partir du support de culture de tissus utilisant un kit de prolactine ELISA disponible dans le commerce.

10. validation de décidualisation In Vitro utilisant la coloration de la phalloïdine.

  1. Insérer les lamelles stériles dans chaque puits d’une plaque bien 12.
  2. Répétez les étapes 6.1-6.5.
  3. Plaque de 0,8 x 105 cellules par puits d’une plaque bien 12.
  4. Incuber les cellules dans 5 % CO2 incubateur à 37 ° C pendant 2 jours.
  5. Aspirer les médias.
  6. Répétez les étapes 7.3 à 7.4.
  7. Fixer les cellules à 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à température ambiante pendant 30 min.
  8. Aspirer la solution de fixation et laver 3 fois avec 1 mL de PBS de 5 min chacun.
  9. Ajouter 0,1 % éther de phényle surfactant non ionique polyéthylèneglycol tert-octyl dans du PBS pendant 5 min pour les cellules fixes pour augmenter la perméabilité.
  10. Laver 3 fois avec 1 mL de PBS de 5 min chacun.
  11. Ajouter 100 µL de solution de la phalloïdine par lamelle et laisser incuber à température ambiante pendant 90 min.
    1. Préparer la dilution de 1/100 dans du PBS d’utiliser une solution mère de phalloïdine dans 1 unité par 5 µL.
  12. Laver 3 fois avec 1 mL de PBS de 5 min chacun.
  13. Monter les diapositives avec support de montage contenant 4', 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI).
  14. Observer les cellules en utilisant un microscope confocal.

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Résultats

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Décidualisation CSEh culture

Après isolement, cellules du stroma endométriales humains sont cultivés à une formation monocouche avec confluence de 80 à 90 % et induite pour in vitro décidualisation en traitant avec 10 nM E2, 1µm MPA et cAMP de 50 µM (CBE). Changements morphologiques associées en vitro décidualisation sont visualisées à la Figure 1 a. À la déciduali...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cycle menstruel reproducteur féminin se caractérise par une augmentation de la concentration de progestérone pendant la phase lutéale, induisant ainsi la décidualisation de ESC en rond, épithéliales-comme des cellules sécrétrices3,8. L’initiation de décidualisation est espèces dépendantes. Chez l’homme, décidualisation se fait spontanément sur la hausse de la concentration de progestérone, tandis que les souris exigent blastocyste présence10<...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail est soutenu par un financement du National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) subvention (R00 HD080742) et démarrage de la Washington University School of Medicine fonds de R.K. Nous tenons à remercier la clinique de fertilité de l’Université de Washington pour fournir des échantillons de biopsie de l’endomètre.

Remerciements

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Opti-MEM I (1X) Sérum Réduit MoyenGibco31985-070Pour média de décidualisation
DMEM / F12 (1:1) (1X)Gibco11330-032
Trypan Blue Stain (0.4 %)Gibco15250-061Pour le comptage cellulaire
PureLink RNA Mini KitInvitrogen12183018APour l’isolation/purification de l’ARN
TaqMan 2X Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacitéApplied Biosystems4374967
Contrôle endogène de l’ARNr eucaryote 18STechnologies4319413EPour le contrôle interne de la qPCR
Test d’expression génique TaqMan Sonde de prolactineApplied Biosystems4331182Pour le contrôle interne de la qPCR
Expression du gène TaqMan Dosage : Sonde IGFBP1Applied Biosystems4331182Pour le contrôle interne qPCR
Réactif Phalloidin-iFluor 488 - CytoPainterAbcamab176753
Prolactine humaine ELISA KitInvitrogenEHIAPRL
16 % ParaformaldéhydeAlfa Aesar30525-89-4
Fixateur Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen13778150Réactif de transfection
ProLong Gold réactif anti-décoloration avec DAPIInvitrogenP36935Pour montage
0,25 % Trypsine-EDTA (1X)Gibco25200-056
Pénicilline StreptomycineGibco15140-122
Sérum de bovin fœtal dénudé de charbon de boisSigmaF6765-500ML
Bicarbonate de sodium (7,5 %)Gibco25080-094
Ficoll-Paque PLUS RéactifFisher Scientific45001749
Collagénase de Clostridium histolyticumSigmaC0130-1G
Désoxyribonucléase I du pancréas bovinSigmaDN25-100MG
Médroxyprogestérone 17-acétateSigmaM1629-1GPour Milieu EPC
EstradiolSigmaE1024-1GPour Média EPC
cAMPSigmaA6885-100MGPour Média EPC
Ciseaux à point droit FinOutils scientifiquesfins 15396-00
TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 SondeApplied Biosystems4351372
Sérum de veau fœtal, inactivé par la chaleurGibco10-082-147
Antibiotique-antimycosiqueThermo Scientifique15240062
Hank' s Solution saline équilibrée  ;Corning21-021-cv
50 mL Tube conique en polypropylène FalconCorning352098
Dumont #5/45 ForcepsFine Science Tools11251-35
100 x 15 mm Boîte de Pétri en verreVWR75845-546
Filtre à cellules de 40 micronsMidsci229481
Isotemp 215 Bain-marieFisher ScientificFS-215
Centrifugeuse LSE  ;Corning6755
Humain NCOA2 siRNA  ;DharmaconL-020159-00Sonde qPCR spécifique au gène
Incubateur de CO2 Steri-cycle i160  ;Thermo Scientific51030301
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000Pour la quantification de l’ARN
Phosphate Tamponné Saline  ;Fisher Scientific50146771
75 cm Flacon de culture cellulaire à col inclinéCorning430641U
Plaque de culture cellulaire non pyrogène 6 puitsCorning3506
Contrôleur de pipette UltraCorning4099
PhotoshopAdobe19.0.1.334
Flacon de culture cellulaire à col incliné de 25 cmCorning7200876
Triton X-100SigmaX100-1L
15 mL polypropylène conique Falcon tubeCorning352099
10 mL SeringueBD302995
1300 Series A2 Capot de sécurité biologiqueThermo Scientific1377
accuspin Micro17 centrifugeuseFisher Scientific13100675
7500 Fast système de PCR en temps réelApplied Biosystems3052632
EVOS FL Microscope d’immunofluorescence LifeTechnologies01414-155G-291
Leica Microscope à lumière inverséeLeicaDMi1
IllrustratorAdobe22.0.1.253
Tableurs ExcelMicrosoft2016
Deckglaser 18 mm lunettes de couvertureNeuVitroGG-18
Reichert Bright-Line HémacytomètreSigmaZ359629-1EA
2-mercaptoéthanolFisher BioreagentsBP176-100Pour tampon de lyse de l’ARN
1,2 ml Flacon cryogénique en polypropylène fileté externeCorning430658Pour la congélation des cellules HESC  ;
Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)SigmaD2650-100mLPour fluides de congélation
Life

Références

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Mots-clés

Isolement de cellules stromalestransfection d ARNsiinactivation g niquesuppl mentation hormonalegradient de densitdigestion la collag naseexpression de la prolactiner organisation du cytosquelette

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