Nous présentons ici une méthode robuste pour reprogrammer les fibroblastes embryonnaires primaires dans les cardiomyocytes fonctionnelles par le biais de la surexpression de GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 et miR-133 (GHMT2m) aux côtés de l’inhibition de la signalisation TGF-β. Notre protocole génère des cardiomyocytes raclée dès transduction après 7 jours avec jusqu'à 60 % efficacité.
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Article de méthode
Suppression de la signalisation profibrotiques potentialise médiée par les facteurs reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris dans les Cardiomyocytes induites
Dans cet article
Résumé
Résumé
TRANS-différenciation d’une cellule somatique type en un autre a un potentiel énorme à modéliser et à traiter des maladies humaines. Études antérieures ont montré que la souris embryonnaires, fibroblastes dermiques et cardiaques peuvent être reprogrammés dans fonctionnelles induites cardiomyocyte-cellules (SGIC) par le biais de la surexpression des facteurs cardiogénique transcription GATA4, Hand2, Mef2c, et Tbx5 in vitro et in vivo. Toutefois, ces études antérieures ont montré une efficacité relativement faible. Afin de rétablir la fonction cardiaque après une blessure, mécanismes qui régissent la reprogrammation cardiaque doivent être élucidés afin d’accroître l’efficacité et la maturation du SGCI.
Nous avons démontré précédemment que l’inhibition de la signalisation profibrotiques considérablement augmente l’efficacité de la reprogrammation. Nous détaillons ici, les méthodes pour atteindre une efficacité de reprogrammation de jusqu'à 60 %. En outre, nous décrire plusieurs méthodes dont la cytométrie en flux, imagerie par immunofluorescence et imagerie calcique pour quantifier l’efficacité et la maturation des fibroblastes reprogrammés reprogrammation. En utilisant le protocole détaillé ici, études mécanistes peuvent être menées pour déterminer les régulateurs positifs et négatifs de reprogrammation cardiaque. Ces études peuvent identifier des voies de signalisation qui peuvent être ciblés pour promouvoir la reprogrammation de l’efficacité et de maturation, ce qui pourrait mener à des thérapies nouvelles pour traiter les maladies du cœur humain.
Introduction
Cardiopathie ischémique est des principales causes de décès chez les États-Unis1. Environ 800 000 américains d’expérience un premier ou récurrente infarctus du myocarde (MI) par année1. Suite MI, la mort de cardiomyocytes (CMs) et la fibrose cardiaque, déposés par les fibroblastes cardiaques activés, atteinte cardiaque fonction2,3. Progression de l’insuffisance cardiaque suite MI est largement irréversible en raison de la mauvaise capacité de régénération des adultes CMs4,5. Alors que les traitements clin....
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Protocole
Toutes les expériences nécessitant des animaux ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à la Campus médical d’Anschutz UC Denver et d’institutionnels animalier.
1. isolement de MEFs
- Acheter enceintes souris C57BL/6, à E13. Navire du jour au lendemain.
- Euthanasier la mère selon les protocoles IACUC approuvés (ex : ~1.3 L/min CO2 jusqu'à ce que l’animal apparaît mort suivie de dislocation cervicale)
- La mère de pulvérisation avec l’éthanol à 70 % et ouvrir la cavité abdominale. Enlever la corne utérine contenant des embryons et placer dans un plat de 10 cm avec du PBS stérile.
- Faites un....
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Résultats
À l’aide de la stratégie de reprogrammation décrite ci-dessus et dans la Figure 1 b, nous avons généré SGIC avec environ 70 % des cellules exprimant cardiaque troponine T et environ 55 % de cellules exprimant cardiaque α-actinine, quantifiée par cytométrie de flux à jour 9 suite à la transduction du GHMT2m (Figure 2 a et B). En outre, la majorité des cellules expriment cardiaque troponine T, troponine I et α-acti.......
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Discussion
La présente étude décrit une stratégie hautement efficace pour reprogrammer directement des fibroblastes dans le SGCI fonctionnel via la livraison de GHMT2m reprogrammation facteurs combinés avec la suppression des voies de signalisation pro-fibreuses. À l’aide de la cytométrie en flux, imagerie par immunofluorescence, calcium d’imagerie et battant les globules, nous montrons la majorité des cellules dans le présent protocole subissent une reprogrammation réussie et adopter sort de lignée CM. Nous avons déjà montré que l.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Cette recherche a été financée par des fonds de programme de la Fondation Webb-Waring Boettcher Biomedical Research, American Heart Association scientifique Development Grant (13SDG17400031), Université du Colorado et la médecine remarquable début de carrière Scholar Program, University of Colorado Division de cardiologie Nyle de Barlow endowment et R01HL133230 NIH (à kaki). A.S.R était soutenue par les NIH/NCATS Colorado CSTC Grant nombre TL1TR001081 et une bourse pré-doctorale auprès du Consortium de l’Université du Colorado pour la recherche sur la fibrose & traduction (CFReT). Cette recherche a été également pris en charge par la subvention de soutien Cancer Cente....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 | Souris Charles River’s Laboratory | 027 | Pour l’isolement des cellules MEF |
| Platinum E (PE) Cell | Biolabs, INC | RV-101 | Pour la production de rétrovirus |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022. FS | Composant des milieux iCM, PE et de croissance |
| Milieu 199 | Life Technologies | 11150-059 | Composant du milieu iCM |
| Sérum fœtal bovin | Gemini | 100106 | Composant du milieu iCM, PE et milieu de croissance |
| Sérum de cheval | Gemini | 100508 500 | Composant du milieu iCM |
| MEM Acides aminés essentiels, 50X | Life Technologies | 11130051 | Composant de l’iCM Milieu |
| Pyruvate de sodium Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Composant du milieu iCM et pour l’imagerie calcique |
| Acides aminés non essentiels MEM, 100X | Life Technologies | 11140050 | Composant du milieu iCM |
| vitaminique MEM, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Composant du milieu iCM |
| Insuline-Transferrine-Sélénium | Gibco 41400045 | Composant du milieu iCM | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Composant du milieu iCM |
| Péniciline-Streptomycine | Gibco | 15140-122 | Composant du milieu iCM, PE et de croissance |
| GlutaMAX (supplément de L-glutamine) | Gibco | 35050-061 | Composant du milieu iCM, PE et de croissance |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Composant du milieu PE |
| Dichlorhydrate de puromycine | Life Technologies | A11138-03 | Composant d’un milieu PE |
| 0,25 % Trypsine/EDTA | Gibco | 25200-056 | Pour détacher les cellules des boîtes de culture |
| A-83-01 | R& D Systems - Tocris | 2939/10 | Traiter les cellules pour inhiber la signalisation TGF-&bêta ; - favorise une reprogrammation à haute efficacité. Utilisation à 0,5 & micro ; M |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | Pour la dilution et le stockage de l’A-83-01 et du composant du milieu de congélation |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | Pour l’enrobage des plats sur plaque MEF |
| FuGENE 6 Réactif de transfection | Promega | E2692 | Réactif de transfection |
| Opti-MEM Milieu sérique réduit | Gibco | 11058-021 | Réactif |
| de transfectionpBabe-X Myc-GATA4 | Plasmide contenant un facteur de reprogrammation | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmide contenant un facteur de reprogrammation | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmide contenant un facteur de reprogrammation | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmide contenant du facteur de reprogrammation | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmide contenant facteur de reprogrammation | ||
| pBabe-X miR-133 | Facteur de reprogrammation contenant un plasmide | ||
| pBabe-X GFP | Facteur de reprogrammation contenant du plasmide | ||
| Polybrène (bromure d’hexadiméthrine) | Sigma | H9268-5G | Pour l’induction virale. Utilisation à une concentration de 6 & micro ; g/mL |
| Filtre à vide + bouteilles (0,22 & micro ; m pores) | Nalgene | ; 569-0020° nbsp ; | Pour les médias filtrants |
| Seringues | Bd Vacutainer Labware ; | 309654 | Pour la filtration virale |
| 0,45 & micro ; m Filtres | Celltreat | 229749 | Pour la filtration virale |
| 70 & micro ; crépines à cellules m | Falcon ; | 352350 | Pour l’isolement MEF et la cytométrie en flux |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Pour la fixation et la perméabilisation de cellules pour la cytométrie en flux |
| perm/wash ; | BD | 554723 | Pour le lavage des cellules pour la cytométrie |
| en flux DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | Pour le lavage des cellules |
| Albumine sérique bovine | VWR | 0332-100g | Pour la cytométrie en flux et l’imagerie calcique |
| Sérum de chèvre Sigma ; | G9023 | Pour bloquer les cellules pour la cytométrie en flux | |
| Sérum d’âne | Sigma | D9663-10mg | Pour bloquer les cellules pour la cytométrie en flux |
| Troponine de souris T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Cytométrie en flux |
| Souris &alpha ;-actinine | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Cytométrie |
| en flux Rabbit Connexin 43 | Sigma ; | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponine I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, souris | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, souris | Life Technologies | A-31571 | Cytométrie en flux 1:200 |
| Cytomètre en flux ZE5 27 couleurs ; | Bio-RAD | Pour FACS | |
| Paraformaldéhyde | sigma | P6148-500mg | Pour la fixation des cellules pour IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Pour la perméabilisation des cellules pour IF |
| EVOS&trade ; Système d’imagerie couleur FL | Thermo Scientific | AMEFC4300 | pour IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | Pour l’imagerie calcique |
| KCl | VWR | 395 | Pour l’imagerie calcique |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | Pour l’imagerie calcique |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | Pour l’imagerie |
| glucose | sigma | G7528-250g | Pour l’imagerie calcique |
| HEPES | sigma | H4034-500g | Pour l’imagerie calcique |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | Pour l’imagerie calcique |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | Pour l’imagerie calcique |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | Pour les transitoires calciques de rupture dans les iCM - utilisation à 10 & micro; M |
| Isoprotérénol | sigma | I6504-1g | Pour augmenter le nombre de transitoires calciques dans les iCM - utilisation à 1-2 & micro ; M |
| Marianas Spinning Disk Microscope confocal | 3i | Pour l’imagerie calcique | |
| éthanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| eau de Javel | Clorox | ||
| 50 mL tubes coniques | GREINER BIO-ONE | ||
| 15 mL Tubes coniques | GREINER BIO-ONE | ||
| 15 cm Boîtes de culture cellulaire | Falcon | ||
| Boîtes de culture cellulaire de 10 cm | Falcon | 353003 | |
| de 60 mm Plaques de culture | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| Plaques de culture cellulaire 6 puits | GREINER BIO-ONE | 657160 ; | |
| Plaques de culture cellulaire 12 puits | GREINER BIO-ONE | 665180 ; | |
| Plaques de culture cellulaire 24 puits | GREINER BIO-ONE | 662160 ; |
Références
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
- Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D.
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Réimpressions et autorisations
