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Article de méthode

Phantoms de graisse-eau pour la Validation de l’imagerie par résonance magnétique : un protocole Flexible et évolutif

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DOI :

10.3791/57704

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7 septembre 2018

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1Vanderbilt University Institute of Imaging Science (VUIIS), Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Biomedical Informatics, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Physical Medicine and Rehabilitation, Vanderbilt University Medical Center, 4Department of Biomedical Sciences, Grand Valley State University, 5Department of Radiology & Radiological Sciences, Vanderbilt University Medical Center, 6Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 7Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

Dans cet article

Résumé

Le but de ce travail est de décrire un protocole pour la création d’un fantôme de graisse-eau pratique qui peut être personnalisé pour produire les fantômes avec différents pourcentages de matières grasses et des volumes.

Résumé

Comme les nouvelles techniques sont développées à l’image du tissu adipeux, les méthodes pour valider ces protocoles gagnent en importance. Fantômes, répliques expérimentales d’un tissu ou un organe d’intérêt, offrent une solution économique et flexible. Cependant, n’ayant pas accès à l’équipement coûteux et spécialisé, construction stables fantômes avec des fractions de matières grasses élevées (p. ex.., > niveaux 50 % fraction gras tels que ceux observés dans le tissu adipeux brun) peut s’avérer difficile en raison du caractère hydrophobe des lipides. Cet ouvrage présente un protocole détaillé, à faible coût pour la création de fantômes de 5 x 100 mL avec des fractions de matières grasses de 0 %, 25 %, 50 %, 75 % et 100 % à l’aide de fournitures de laboratoire de base (plaque chauffante, gobelets, etc.) et des composants facilement accessibles (eau distillée, agar, soluble dans l’eau agent tensio-actif, benzoate de sodium, agent de contraste gadolinium-diethylenetriaminepentacetate (DTPA), huile d’arachide et liposolubles agent tensio-actif). Le protocole a été conçu pour être flexible ; Il peut être utilisé pour créer des fantômes avec différentes fractions de matières grasses et un large éventail de volumes. Fantômes créées avec cette technique ont été évalués dans l’étude de faisabilité qui a comparé les valeurs de grosse fraction de graisse-eau résonance magnétique aux valeurs cibles dans les fantômes de construit. Cette étude a donné un coefficient de corrélation de concordance de 0,998 (intervalle de confiance à 95 % : 0.972-1,00). En résumé, ces études démontrent l’utilité de graisses fantômes pour la validation de tissu adipeux, techniques d’imagerie dans un éventail de tissus cliniquement pertinentes et les organes.

Introduction

Intérêt pour quantifier le tissu adipeux et du contenu triglycérides des modalités d’imagerie, telles que l’imagerie par résonance magnétique (IRM), s’étend sur plusieurs domaines. Domaines de recherche comprennent l’étude des dépôts de tissus adipeux blanc et brun et ectopique stockage des lipides dans les organes et les tissus tels que le foie1, pancréas2et le muscle squelettique3. Comme ces nouvelles techniques de quantification adipeuse sont développés, méthodes sont nécessaires pour confirmer que les paramètres d’imagerie sont valides pour la recherche et applications cliniques.

Fantômes, répliques expérimentales d’un tissu ou un organe, fournissent un outil flexible et contrôlée de faible coût, pour développer et valider de techniques d’imagerie4. Plus précisément, fantômes peuvent être construits pour se composent de la graisse et l’eau dans un rapport ou la graisse fraction volumique (FF) comparable à celui du tissu d’intérêt clinique. Cliniquement, les valeurs de FF dans les tissus et organes peuvent varier considérablement : FF dans le tissu adipeux brun se situe entre 29,7 % et 93,9 %5; le foie moyen FF chez les patients de stéatose est de 9,0 % 18,1 ±6; le FF pancréatique chez les adultes à risque pour le type 2 diabète se situe entre 1,6 % et 22,2 %7; et dans certains cas de maladie avancée, patients atteints de dystrophie musculaire peuvent avoir des valeurs de la FF de près de 90 % dans certains muscles8.

Parce que les molécules non polaires tels que les lipides ne se dissolvent pas bien dans les solutions composés de molécules polaires tels que l’eau, créant des fantômes stables avec une cible haute FF reste difficile. Pour FF jusqu'à 50 %, nombreuses méthodes existantes peuvent servir à créer les eau graisse fantômes9,10,11,12. Autres méthodes qui atteignent FFs supérieurs généralement nécessitent des équipements coûteux comme un homogénéisateur ou une cellule ultrasonique disruptor13,14. Bien que ces techniques fournissent une feuille de route pour la hautes fantômes FF, contraintes d’équipement et des quantités variables de détails expérimentaux limitent les efforts déployés pour créer des fantômes d’eau graisse robuste et reproductible.

S’appuyant sur ces techniques précédentes, nous avons développé une méthode pour construire des fantômes les eau graisse stable et rentable à travers une valeurs de plage personnalisable de FF. Ce protocole détaille les étapes nécessaires pour faire 5 x 100 mL de graisses fantômes avec des valeurs de la FF de 0 %, 25 %, 50 %, 75 % et 100 % à l’aide d’une plaque unique. Il peut facilement être ajusté pour créer divers volumes (10 à 200 mL) et les pourcentages de graisse (0 à 100 %). L’efficacité de la technique du fantôme a été évaluée dans les valeurs de MRI FF faisabilité étude comparant graisse-eau pour les valeurs cibles de FF dans les fantômes construites.

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Protocole

1. préparer le poste de travail et des matériaux

  1. Respecter toutes les règles de sécurité de laboratoire. Porter des gants et des lunettes de protection. Lire la fiche signalétique pour chacun des réactifs utilisés et prendre les précautions appropriées. Examiner les matériaux et liste d’équipement, procédures de gestion des produits chimiques et verrerie précautions.
    ATTENTION : Ce protocole nécessite l’utilisation d’une plaque de cuisson à haute température. Soyez prudent et porter des gants résistant à la chaleur pour interagir avec chaud conteneurs et ne touchez pas la surface de la plaque chauffante.
  2. Dégager l’espace de travail et nettoyer les surfaces avec du désinfectant. Lavez-vous les mains et enfilez les gants.
  3. Stériliser tous les instruments et l’intérieur de tous les pots en verre pour réduire le risque potentiel de contamination et augmenter la longévité du fantôme.
    Remarque : Si le fantôme sera utilisé pendant plus de quelques jours, nettoyer périodiquement la surface de la phantom remplie avec de l’éthanol pour empêcher la croissance bactérienne.

2. préparer la Solution de l’eau

  1. Préparer l’espace de travail pour la solution de l’eau. Positionner le matériel et les équipements suivants sur le banc : diplômé de cylindre, bécher de 400 mL, remuer bar, échelle, 2 bateaux de pesée x, spatule, 2 x 1.0 mL seringues avec aiguille, eau distillée, agent de contraste gadolinium-diethylenetriaminepentacetate (DTPA), agent tensio-actif soluble dans l’eau, agar et benzoate de sodium.
    Remarque : Les seringues peuvent être utilisés avec ou sans aiguilles. Toutefois, à l’aide d’aiguilles améliorera la précision de la mesure et aider à prévenir les éclaboussures quand le contenu est ajouté à l’eau ou l’huile des solutions.
  2. Placer une barre de mélanger dans un bécher de 400 mL. Utiliser un cylindre de 100 ou 200 mL gradué pour mesurer 300 mL d’eau distillée et versez l’eau dans le bécher. Placer le bécher sur la plaque chauffante et fixé à 90 ° C avec un taux de remuer de 100 tr/min.
    Remarque : Des températures élevées sont utilisées dans le présent protocole pour obtenir des résultats rapides. Parce que les solutions ne restent pas sur la plaque chauffante pendant de longues périodes de temps, la température de consigne pour la plaque chauffante ne reflète pas la température de la solution.
  3. Utilisez une échelle étalonnée pour mesurer 0,30 g de benzoate de sodium dans une barque de pesée. Ajoutez le benzoate de sodium à la solution de l’eau.
  4. Utiliser une seringue à 0,6 ml de surfactant soluble dans l’eau. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air. Tenez l’aiguille de quelques millimètres au-dessus du centre de la solution, puis relâcher lentement le surfactant soluble dans l’eau pour éviter les éclaboussures sur les parois du bécher.
  5. À l’aide d’une seringue propre, mesure 0,24 mL de l’agent de contraste gadolinium-DTPA. Ajoutez-le dans le bécher, utilisant la même technique qu’à l’étape 2.4.
    NOTE : Gadolinium-DTPA est utilisé pour ajuster les propriétés de détente de la phantom MRI pour correspondre à celles du tissu d’intérêt. Le lecteur peut régler le volume de gadolinium-DTPA ajouté pour mieux correspondre aux propriétés de relaxation du tissu d’intérêt.
  6. Mesure 9,0 g d’agar dans une barque de pesée. Lentement, verser l’agar avec une spatule dans le bécher avec de l’eau.
  7. Une fois que tout a été ajouté à la solution de l’eau, augmenter la température de la plaque de cuisson à 350 ° C et mélanger bar vitesse à 1100 tr/min pendant 5-10 min faire fondre l’agar.
    1. Pour vérifier si l’agar est fondu, brièvement retirer la solution d’eau de la plaque chauffante, arrêter en remuant et vérifier la couleur de la solution. Agar fondu doit être clair (aucun serpentins ou des grumeaux) et jaune ou orange en couleur.
  8. Une fois l’agar est entièrement fondu, utiliser une seringue ou verser environ 3,5 mL de la solution de l’eau dans un petit flacon. Si la solution d’essai ne fixe pas ou se sépare après 5-10 min, l’agar n’est pas fondu. Augmenter la température de la plaque de cuisson à 350 ° C et continuer la solution de chauffage.
  9. Répétez l’étape 2.8 jusqu’en solution aqueuse dans les ensembles de flacon test correctement.
  10. Laisser la solution de l’eau sur la plaque chauffante à 50 ° C et 100 tr/min. Nettoyer l’espace de travail et préparer la solution de l’huile.
    1. Retirez les matériaux suivants à l’audience : échelle, 2 x bateaux de pesée, spatule, 2 x 1.0 mL seringues avec aiguille (utilisé), eau distillée, agent de contraste gadolinium-DTPA, surfactant soluble dans l’eau, agar et benzoate de sodium.
    2. Positionner le matériel et les équipements suivants sur le banc : bécher de 400 mL (propre), remuez bar (propre), seringue 2,0 mL avec aiguille, huile d’arachide et surfactant solubles dans l’huile.

3. Solution d’huile

  1. Placer une nouvelle barre de mélanger dans un bécher propre 400 mL. Utiliser une éprouvette graduée pour mesurer 300 mL d’huile d’arachide et la verser dans le bol. Retirer le bécher contenant la solution d’eau et placer le bécher de solution de l’huile sur la plaque chauffante. Affectez à 90 ° C avec un taux de remuer de 100 tr/min pendant 1 min.
    Remarque : l’huile d’arachide est utilisé parce qu’il a un spectre de résonance magnétique nucléaire similaire comparativement aux triglycérides dans les tissus adipeux humains15.
    1. N’abandonnez pas l’huile sur la plaque chauffante. Si l’huile devient trop chaud et commence à fumer, retirer de la plaque de cuisson et réduire la température avant de regagner le foyer de l’huile.
  2. Mesure 3,0 mL du surfactant solubles dans l’huile avec une seringue propre. En utilisant la même technique que décrite à l’étape 2.4, ajouter le surfactant huile soluble dans le bécher. Définissez la table de cuisson à 150 ° C et 1100 tr/min pendant 5 min pour bien mélanger la solution de l’huile.
  3. Prendre la solution de pétrole au large de la plaque chauffante et nettoyer l’espace de travail en vue de créer le fantôme.
    1. Retirez les matériaux suivants à l’audience : seringue 2,0 mL avec aiguille (utilisé), huile d’arachide et surfactant solubles dans l’huile.
    2. Positionner le matériel et les équipements suivants sur le banc : mélanger 250 mL fiole d’Erlenmeyer, bar (propre), pipettes jaugées, titulaire de pipette volumétrique et pots en verre 5 x 120 mL.

4. créer une émulsion fantôme

  1. Pipettes jaugées préparer les solutions de l’eau et l’huile. Pipettes ne doivent servir avec leur solution respectif afin d’éviter la contamination croisée.
    1. Correspondre à la taille de la pipette sur le volume utilisé dans le protocole. Par exemple, utiliser des pipettes jaugées 2 x 50 mL (50 mL de solution d’eau + 50 mL de solution d’huile) pour créer un 100 mL fantôme avec une cible FF de 50 % de matière grasse.
  2. Placer la solution de l’eau sur la plaque de cuisson et mettre la plaque de cuisson à 300 ° C et 1100 tr/min. Après 4-5 min, éteindre l’agitateur.
  3. À l’aide d’une pipette jaugée, vérifier si la solution de l’eau est prête pour l’extraction en partiellement la pipette de remplissage avec une petite quantité (5 à 10 mL) de la solution et en libérant dans le bécher. Si la solution de l’eau peut être facilement enlevée et relâchée sans restes excessives dans la pipette, passez à l’étape suivante, sinon, laisser sur la plaque chauffante et vérifiez à nouveau en 2-3 min.
    Remarque : Les composants de la solution de l’eau sont plus sensibles à la définition et la séparation, il est donc préférable de garder la solution eau agitation et/ou chaud aussi souvent que possible. Si la solution de l’eau n’est pas chauffée et agitée avant le transfert, il sera très difficile de mesurer les volumes précis en raison de la tendance d’agar se figer quand refroidi.
  4. Soigneusement ajouter un propre à une fiole d’Erlenmeyer de 250 mL. Prendre la solution de l’eau au large de la plaque chauffante, mesurer le volume approprié (tableau 2) et de le transférer dans l’erlenmeyer.
  5. Placer la solution de l’huile sur la plaque chauffante et mis à 90 ° C et 1100 tr/min pour assurer que la solution est homogène. Après 1-2 min, enlever la solution de l’huile de la plaque chauffante et remplacez-le par l’erlenmeyer.
  6. Mesurer la quantité appropriée de la solution d’huile (tableau 2) et ajoutez lentement à la solution de l’eau dans l’erlenmeyer.
  7. Après avoir ajouté toutes les solution huileuse, augmentez la température à 300 ° C et maintenir l’agitation à 1100 tr/min. Mélanger les solutions combinées pendant 4-5 min (il doit rester vortex dans la barre de remuer). L’émulsion doit être blanche, avec une texture crémeuse.
  8. Utiliser un extracteur de bar agitation magnétique pour enlever la barre de remuer.
    Remarque : L’extracteur de bar émoi devrait servir pour retirer les barres de remuer toutes les émulsions futures. Nettoyez-la soigneusement entre chaque utilisation.
  9. Utilisez des gants résistants à la chaleur pour verser délicatement le mélange dans l’erlenmeyer dans un bocal en verre propre 120 mL. Verser doucement le mélange sur le côté de la Jarre de verre pour éviter les bulles d’air dans le mélange en refroidissant.
  10. Nettoyer la fiole Erlenmeyer et barre de remuer, puis répétez les étapes 4,2 à 4,8, ajustant les quantités de solutions de l’eau et l’huile, jusqu'à ce que tous les fantômes sont créés.
    Remarque : Assurez-vous que le verre est froid avant de le nettoyer.

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Résultats

Si la solution de l’eau a été établie correctement, une petite quantité de la solution doit se figer rapidement dans un flacon d’essai (Figure 1, gauche). Si la solution sépare (Figure 1, droite), la solution doit être préparée à nouveau (en suivant les instructions à l’étape 3.8 du protocole). Si l’émulsion sépare (exemples dans la Figure 2, gauche ...

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Discussion

Les auteurs décrivent une méthode robuste pour créer les eau graisse fantômes pouvant pour la validation des techniques d’imagerie médicale utilisés pour quantifier le tissu adipeux et triglycérides content in vivo. En créant deux réservoirs (un pour la solution de l’huile) et un pour la solution de l’eau, des fantômes stables avec une variété de valeurs FF, y compris les valeurs dépassant 50 %, ont été construits sans besoin de matériel coûteux. Fantômes de FF élevés (> 50 %) fournissent l’utilitaire afin de s’...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent que la recherche a été effectuée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

Soutien financier pour cette recherche a été pourvue le National Institutes of Health (NIH) et de l’Institut National du diabète et digestif Kidney Diseases (NIDDK) / NIH R01-DK-105371. Nous remercions Dr Houchun (Harry) Hu pour conseils et suggestions sur création fantôme de graisse de l’eau.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Eau distilléeAmazonB000P9BY38Base de solution aqueuse
AgarSigma Aldrich IncorporatedA1296-100GGélifiant
Tensioactif soluble dans l’eauSigma Aldrich IncorporatedP1379-500MLAgent tensioactif/émulsifiant
Gadolinium-DTPA Agent de contrasteBayer Healthcare50419-0188-01Imagerie par résonance magnétique Agent de contraste.
Benzoatede sodium Sigma Aldrich Incorporated71300-250GConservateur
Huile d’arachideAmazon54782-LOUBase de solution huileuse
Tensioactif soluble dans l’huileSigma Aldrich IncorporatedS6760-250MLAgent tensioactif/émulsifiant
Plaque chauffante avec agitateurFisher Scientific07-770-152
Barres d’agitation (en forme d’œuf)Sigma Aldrich IncorporatedZ127116-1EA
400 mL BécherSigma Aldrich IncorporatedCLS1003400-48EA
Erlenmeyer 250 mL Fiole ErlenmeyerSigma Aldrich IncorporatedCLS4450250-6EA
25 mL Pipette jaugée en verreFisher Scientific13-650-2PQuantité = 2
50 mL Pipette jaugée en verreFisher Scientific13-650-2SQuantité = 2
Pipette jaugée en verre de 75 mLFisher Scientific13-650-2TQuantité = 2
Seringues de 3,0 mLSigma Aldrich IncorporatedZ248002-1PAK
Seringue de 1,0 mLSigma Aldrich IncorporatedZ230723-1PAK
SpatuleSigma Aldrich IncorporatedS3897-1EA
Échelle (résolution de 100 g x 0,01 g)AmazonAWS-100-BLK
Weigh BoatsSigma Aldrich IncorporatedZ740499-500EA
Bocaux en verre de 120 mlMcMaster Carr Supply Co3801T73
Gants résistants à la chaleur (paire)AmazonB075GX43MN
SeringuesSigma Aldrich IncorporatedZ192341-100EA
18" Barre d’agitation retriverFisher Scientific14-513-70
1 Dram Flacon en verre transparentFisher Scientific03-339-25B

Références

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