Nous présentons ici une procédure pour fonctionnaliser fluorescent les disulfures sur Qβ VLP avec dibromomaleimide. Nous décrivons Qβ expression et purification, la synthèse de molécules dibromomaleimide fonctionnalisés et la réaction de conjugaison entre dibromomaleimide et Qβ. La particule de conjugué fluorescente jaune qui en résulte peut être utilisée comme une sonde de fluorescence à l’intérieur des cellules.
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Article de méthode
Faire induite par la conjugaison Fluorescent pégylé Pseudo-particules virales de chimie Dibromomaleimide-disulfure
Dans cet article
Résumé
Résumé
La récente hausse des Pseudo-particules virales (VLP) dans la recherche biomédicale et la recherche sur les matériaux peut être attribuée à leur facilité de biosynthèse, taille discrète, programmabilité génétique et biodégradabilité. Pendant qu’ils sont très susceptibles de réactions bioconjugaison permettant d’ajouter des ligands synthétiques sur leur surface, la bioconjugaison méthodologies sur ces capsides nés aqueux est relativement limitée. Pour faciliter la direction de la recherche de biomatériaux fonctionnels, réactions bioconjugaison non traditionnels doivent être considérées. La réaction décrite dans le présent protocole utilise dibromomaleimides pour introduire de nouvelles fonctionnalités dans le solvant disulfures exposées d’un PPV basés sur Qβ de bactériophage. En outre, le produit final est fluorescent, qui présente l’avantage de produire une sonde traçable in vitro à l’aide d’un jeu de filtres disponibles dans le commerce.
Introduction
À l’aide de taille nanométrique des capsides virales est devenue un domaine passionnant, qui vise à élargir le champ des applications dans la recherche biomédicale1,2,3. Inoculation exprimées Pseudo-particules virales (VLP) structurellement proviennent de virus, mais ils n’ont pas le matériel génétique viral initial, ce qui les rend non infectieuses protéinacées nanoparticules. Comme les caractéristiques de la surface sont génétiquement programmés et chaque capside est exprimée identiquement à ceux avant et après elle, il est possible de connaître l’emplacement et le nombre d....
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Protocole
1. préparation
- Faire agar de lysogénie bouillon (LB) et verser des plaques12.
-
Transformer BL21 (DE3) avec un plasmide pET28 qui contient la séquence de protéine de manteau de wtQβ.
- Décongelez les cellules compétentes d’Escherichia coli BL21 (DE3) dans un bain de glace. Place 50 μL de cellules dans un tube de microcentrifuge.
- Ajouter 2 μL de plasmide dans un tube et effleurer doucement le tube. Puis incuber sur glace pendant 30 min.
- Choc thermique les cellules pour 45 s dans un bain d’eau à 42 ° c exactement. Placer le tube dans le bain de glace immédiatement après la....
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Résultats
Les dérivés de dibromomaleimide peuvent être synthétisés par la réaction de condensation entre l’anhydride dibromomaleimide et des amines primaires,15. Par ailleurs, une méthode synthétique doux16 à l’aide de N-méthoxycarbonyl activé 3,4-dibromomaleimide a été exploitée ici en réagissant avec le MÉTHOXYPOLYÉTHYLÈNE glycol (PEG) au rendement DB-PEG (Figure 1). La RMN a été utilisés pour identifier la structure du.......
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Discussion
Par rapport à la purification de protéines plus petite, une étape unique en épurant bactériophage Qβ est la centrifugation en gradient de saccharose. Après l’étape d’extraction chloroforme/n-butanol, Qβ est ensuite purifiée à l’aide de gradients de sucrose de 5 à 40 %. Lors de la centrifugation, les particules sont séparées selon leur taille. Grosses particules rendront dans la région de densité plus élevée, alors que les plus petites particules restent dans la région de densité plus faible. Qβ se rend dans le tiers infé.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Remerciements
B.E. reconnaît la National Science foundation (DMR-1654405) Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) pour leur soutien.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Bouillon LB (Miller) ; | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Extrait de levure, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Sulfate de magnésium anhydre | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Chlorure de sodium (cristallin/certifié ACS) | Fisher | Scientific S271-10 | |
| Chlorure de potassium | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Système de purification d’eau | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Phosphate de potassium monobasique | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Phosphate de potassium dibasique anhydre | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Saccharose | Fisher Scientific | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyle &bêta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor ; | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Sulfate d’ammonium | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroforme | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, godet oscillant, | Beckman Soc | 342204 : SW 28 Ti Rotor/ 342217 : jeu de | |
| Type 70 Ti rotor, à angle fixe, Titane, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Dosage des protéines | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS | Chlorhydrate Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tétraméthyléthylènediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97 % | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylène glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Phosphate de sodium | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 RP-A11310-500.0 | ||
| Dodécylsulfate de sodium | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Persulfate d’ammonium | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 microscope confocal à balayage laser | Olympus | FV3000° | |
| Rotateur réglable au revolver Labnet ; | Thomas Scientific ; | 1190P25 ; | |
| Bouteille haute performance Sorvall de 1000 ml, PC, avec bouchon en aluminium | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Bouteilles à centrifuger avec bouchons, copolymère de polypropylène | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Tubes à fond rond ; 38 mL ; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| Erlenmeyer 2 L Erlenmeyer à bouche étroite avec rebord robuste | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Unités de filtre centrifuge | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidiseur Processeur de matériaux | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene Tubes à centrifuger à fond rond en polycarbonate haute vitesse | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bouteille, avec bouchon, | 41121703 | Beckman | |
| , gradué - Polypropylène 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Stérilisateurs à vapeur | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Plaque de culture cellulaire, Traitée, PS, 96 puits, avec couvercle | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Tube de centrifugation conique | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Tube microcentifuge : 1,5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Vibrateur orbital | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylène, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorimètre NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Aiguille Longue ; | Hamilton ; | 7693 | |
| Exel International Seringues 5 à 6 cc Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | ||
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic Balance de laboratoire de haute précision | Technologie de pondération intelligente | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Tube conique à centrifuger | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4&ndash ; 15 % Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 puits, 50 & micro ; l | Bio-Rad | 456-1084 |
Références
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M.
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Réimpressions et autorisations
