Method Article

Faire induite par la conjugaison Fluorescent pégylé Pseudo-particules virales de chimie Dibromomaleimide-disulfure

DOI:

10.3791/57712

⸱

May 27th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Texas at Dallas, 2Undergraduate Biology, University of Texas at Dallas, 3Undergraduate Healthcare Studies, University of Texas at Dallas, 4Departments of Chemistry & Biochemistry and Biomedical Engineering, University of Texas at Dallas

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici une procédure pour fonctionnaliser fluorescent les disulfures sur Qβ VLP avec dibromomaleimide. Nous décrivons Qβ expression et purification, la synthèse de molécules dibromomaleimide fonctionnalisés et la réaction de conjugaison entre dibromomaleimide et Qβ. La particule de conjugué fluorescente jaune qui en résulte peut être utilisée comme une sonde de fluorescence à l’intérieur des cellules.

Abstract

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La récente hausse des Pseudo-particules virales (VLP) dans la recherche biomédicale et la recherche sur les matériaux peut être attribuée à leur facilité de biosynthèse, taille discrète, programmabilité génétique et biodégradabilité. Pendant qu’ils sont très susceptibles de réactions bioconjugaison permettant d’ajouter des ligands synthétiques sur leur surface, la bioconjugaison méthodologies sur ces capsides nés aqueux est relativement limitée. Pour faciliter la direction de la recherche de biomatériaux fonctionnels, réactions bioconjugaison non traditionnels doivent être considérées. La réaction décrite dans le présent protocole utilise dibromomaleimides pour introduire de nouvelles fonctionnalités dans le solvant disulfures exposées d’un PPV basés sur Qβ de bactériophage. En outre, le produit final est fluorescent, qui présente l’avantage de produire une sonde traçable in vitro à l’aide d’un jeu de filtres disponibles dans le commerce.

Introduction

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À l’aide de taille nanométrique des capsides virales est devenue un domaine passionnant, qui vise à élargir le champ des applications dans la recherche biomédicale1,2,3. Inoculation exprimées Pseudo-particules virales (VLP) structurellement proviennent de virus, mais ils n’ont pas le matériel génétique viral initial, ce qui les rend non infectieuses protéinacées nanoparticules. Comme les caractéristiques de la surface sont génétiquement programmés et chaque capside est exprimée identiquement à ceux avant et après elle, il est possible de connaître l’emplacement et le nombre d....

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Protocol

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1. préparation

  1. Faire agar de lysogénie bouillon (LB) et verser des plaques12.
  2. Transformer BL21 (DE3) avec un plasmide pET28 qui contient la séquence de protéine de manteau de wtQβ.
    1. Décongelez les cellules compétentes d’Escherichia coli BL21 (DE3) dans un bain de glace. Place 50 μL de cellules dans un tube de microcentrifuge.
    2. Ajouter 2 μL de plasmide dans un tube et effleurer doucement le tube. Puis incuber sur glace pendant 30 min.
    3. Choc thermique les cellules pour 45 s dans un bain d’eau à 42 ° c exactement. Placer le tube dans le bain de glace immédiatement après la....

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Results

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Les dérivés de dibromomaleimide peuvent être synthétisés par la réaction de condensation entre l’anhydride dibromomaleimide et des amines primaires,15. Par ailleurs, une méthode synthétique doux16 à l’aide de N-méthoxycarbonyl activé 3,4-dibromomaleimide a été exploitée ici en réagissant avec le MÉTHOXYPOLYÉTHYLÈNE glycol (PEG) au rendement DB-PEG (Figure 1). La RMN a été utilisés pour identifier la structure du.......

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Discussion

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Par rapport à la purification de protéines plus petite, une étape unique en épurant bactériophage Qβ est la centrifugation en gradient de saccharose. Après l’étape d’extraction chloroforme/n-butanol, Qβ est ensuite purifiée à l’aide de gradients de sucrose de 5 à 40 %. Lors de la centrifugation, les particules sont séparées selon leur taille. Grosses particules rendront dans la région de densité plus élevée, alors que les plus petites particules restent dans la région de densité plus faible. Qβ se rend dans le tiers infé.......

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Disclosures

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgements

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B.E. reconnaît la National Science foundation (DMR-1654405) Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) pour leur soutien.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bouillon LB (Miller)  ;EMD Millipore1.10285.0500
Tryptone, PowederResearch Products InternationalT60060-1000.0
Extrait de levure, PowederResearch Products InternationalY20020-1000.0
Sulfate de magnésium anhydreP212121CI-06808-1KG
Chlorure de sodium (cristallin/certifié ACS)FisherScientific S271-10
Chlorure de potassiumFisher ScientificBP366-500
Elga PURELAB Flex 3 Système de purification d’eauFisher Scientific4474524
Phosphate de potassium monobasiqueFisher ScientificBP362-1
Phosphate de potassium dibasique anhydreFisher ScientificP288-500
SaccharoseFisher Scientific
EthanolFisher ScientificBP2818500
Isopropyle &bêta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma AldrichI6758-1G
Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor  ;Fisher Scientific096-041053
Sulfate d’ammoniumP212121KW-0066-5KG
ChloroformeAlfa Aesar32614-M6
1-ButanolFisher ScientificA399-4
SW 28 Ti Rotor, godet oscillant,Beckman Soc342204 : SW 28 Ti Rotor/ 342217 : jeu de
Type 70 Ti rotor, à angle fixe, Titane, 8 x 39 mL,Beckman Coulter337922
Coomassie (Bradford) Dosage des protéinesFisher ScientificPI23200
TRISChlorhydrate Research Products InternationalT60050-1000.0
TétraméthyléthylènediamineAlfa AesarJ63734-AC
Chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphineSigma AldrichC4706-2G
2 3-Dibromomaleimide 97 %Sigma Aldrich553603-5G
Polythylène glycolAlfa Aesar41561-22
Phosphate de sodiumFisher ScientificAC424375000
Acrylamide/bis-AcrylamideP212121 RP-A11310-500.0
Dodécylsulfate de sodiumSigma AldrichL3771-100G
Persulfate d’ammoniumFisher ScientificBP179-100
FV3000 microscope confocal à balayage laserOlympusFV3000°
Rotateur réglable au revolver Labnet  ;Thomas Scientific  ;1190P25  ;
Bouteille haute performance Sorvall de 1000 ml, PC, avec bouchon en aluminiumThermo Scientific010-1459
Nalgene Bouteilles à centrifuger avec bouchons, copolymère de polypropylèneThermo Scientific3141-0250
Nunc Tubes à fond rond ; 38 mL ; PCThermo Scientific3117-0380
Erlenmeyer 2 L Erlenmeyer à bouche étroite avec rebord robustePyrex4980-2L
Amicon Ultra-4 Unités de filtre centrifugeMillipore SigmaUFC801024
M-110P Microfluidiseur Processeur de matériauxMicrofluidicsM-110P
Nalgene Tubes à centrifuger à fond rond en polycarbonate haute vitesseThermo Scientific3117-0380PK
Bouteille, avec bouchon,41121703Beckman
, gradué - Polypropylène 250 mLPolyLab80005
533LS-E Series Stérilisateurs à vapeurGetinge533LS-E
TrueLine, Plaque de culture cellulaire, Traitée, PS, 96 puits, avec couvercleLabSourceD36-313-CS
Falcon 15 mL Tube de centrifugation coniqueFisher Scientific14-959-53A
Tube microcentifuge : 1,5 mLFisher Scientific05-408-129
VWR Os-500 Vibrateur orbitalVWR Scientifc Products14005-830
Tetra Handcast systemsBio-Rad1658000FC
Polypropylène, 250 mLBeckman Coulter41121703
Spectrofluorimètre NanoDropThermo Fisher Scientific3300
Aiguille Longue  ;Hamilton  ;7693
Exel International Seringues 5 à 6 cc Luer LockFisher Scientific14-841-46
P1000 PipetmanGilsonF123602
P200 PipetmanGilsonF123601
P100 PipetmanGilsonF123615
P20 PipetmanGilsonF123600
P10 PipetmanGilson
Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic Balance de laboratoire de haute précisionTechnologie de pondération intelligenteIWT_PM100
Falcon 50 mL Tube conique à centrifugerFisher Scientific14-432-22
4&ndash ; 15 % Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 puits, 50 & micro ; lBio-Rad456-1084
S25590B aluminium godets cylindre en polycarbonate F144802

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
  2. Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M.

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