Préparer le développement de tissu olfactif périphérique pour moléculaire et analyse Immunohistochemical chez la drosophile

Summary

Nous présentons ici un protocole pour organiser et disséquer à développer le tissu olfactif des espèces de drosophile . Le tissu découpé peut ensuite être utilisé pour des analyses moléculaires, comme quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) ou l’ARN séquençage (RNAseq), ainsi que des analyses in vivo , comme immunohistochemistry ou in situ hybridation.

Abstract

Le système olfactif de la drosophile est un système largement utilisé dans la neurobiologie développementale, neurosciences des systèmes, ainsi que neurophysiologie, comportement et évolution comportementale. Des tissus de drosophile olfactifs maison les neurones récepteurs olfactifs (ORN) détectant les signaux chimiques volatils en plus des neurones hydro - et thermo-sensorielle. Dans ce protocole, nous décrivons la dissection de mettre au point des tissus périphériques olfactif de l’espèce de drosophile adulte. Tout d’abord, nous décrivons comment organiser et l’âge des larves de drosophile , suivies par la dissection du disque antennaire de premiers stades nymphales, suivies par la dissection des antennes des adultes et de milieu-pupal étapes. Nous montrons également les méthodes où les préparations doivent être utilisées dans les techniques moléculaires, tels que l’extraction de l’ARN pour qRT-PCR, RNAseq ou immunohistochimie. Ces méthodes peuvent également être appliquées à d’autres espèces de drosophile après temps de développement nymphal spécifique à l’espèce sont déterminés et stades respectifs sont calculés pour le vieillissement approprié.

Introduction

Le système olfactif de la drosophile est un système largement utilisé dans la neurobiologie développementale, neurosciences des systèmes, ainsi que neurophysiologie, études de comportement et évolution comportementale^{1,2,3, 4}. Des tissus de drosophile olfactifs abritent les neurones récepteurs olfactifs (ORN) détectant les signaux chimiques volatils en plus de l’hydro - et thermo-sensorielle neurones^1,5,6. L’objectif global de ce ....

Protocol

Le protocole suivant est compatible avec les orientations de l’éthique mis en place par le Duke University Research Ethics Committee.

1. tissu préparation et développement mise en scène de Drosophila melanogaster Pupa

1. Tout d’abord, identifiez les mouches combien sera nécessaires pour la dissection. Pour la RT-PCR et RNAseq, collecter 100-200 disques antennaires et antennes émanant de particuliers qui sont nécessaires aux stades prénymphal, de 8 h CSA, 40 h CSA et adulte. Pour immunohistochemistry, disséquer individu de 10-20.
2. Nettoyer tous les matériaux, y compris les plaquettes de dissection et forceps, à l’aid....

Results

Le tissu olfactif en développement disséqué peut être utilisé pour l’extraction de l’ARN suivie par RT-PCR pour évaluer l’expression des gènes ou peut être pris par le biais de protocoles d’immunohistochemistry pour déterminer son modèle d’expression et la localisation subcellulaire des gènes de intérêt. Dans cette section, nous présentons des résultats représentatifs de chaque protocole. La figure 1 est le représentant RT-PCR quantitative montrant la transcr.......

Discussion

Ce protocole est une ressource utile pour les laboratoires intéressés d’identifier les programmes génétiques et transcriptionnelles opérant dans le développement de la drosophile tissu olfactif, en plus d’une analyse comparative de ces programmes à travers de la drosophile espèces. Il est particulièrement utile si les systèmes au niveau transcriptionnels profils de différentes étapes du développement sont nécessaires comme une amorce pour de futures études. Le protocole décrit ici illustre la scène et i.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Saline tamponnée au phosphate	Gibco	70011-044	Diluer à 1X dans de l’eau sans RNase
CO2 tank	Air Gas	CD R200
Deux pinces tranchantes (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	Solutions d’isolement d’ARN
Microscope
Petit seau avec glace
Micropipettes et pointes
Tubes microfuges de 1,7 mL Achetez			sans nucléases pour de meilleurs résultats
Tubes PCR de 0,2 mL Poudre
de paraformaldéhyde	Polysciences	380
10 % Triton X-100	Teknova	T1105	Diluer à 0,2 % v/v dans 1X boîtes de
Pétri
55mm papier filtre	Whatman	1001-055	Mouiller avec de l’eau et placer dans une boîte de Pétri pour garder les pupes humides
25 C incubateur
désionisé H2O			Acheter sans nucléase ou traiter avec DEPC
Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone	Dow Corning		à utiliser pour la fabrication de tampons de dissection à partir de couvercles de plaques Terizaki.
Les mini-plateaux MicroWell avec couvercles	Nunc	438733	Les couvercles peuvent être utilisés pour fabriquer des coussinets de dissection en silicone
Anticorps anti-GFP	de lapin MBL international corpor	PM005	Anticorps primaire
anti-RAT de souris CD2	AbD seroTec	MCA154RHDL	anticorps primaire
ADL195 (anti lamin, souris)	Dev studies hydoma ban	ADL195-s	anticorps primaire
Alexa Fluor® ; 488 chèvre anti-lapin IgG (H+L)	invitrogen	A11008	Anticorps secondaire
Cy3 Chèvre Anti-souris	IgG Jackson ImmunoResearch	115-166-003	Anticorps secondaire
Triton X-100, détergent de qualité protéique, solution à 10 %, stérile-filtré	Détergent 648463 CALBIOCHEM		Rotator
Thermo	scientific
Nuclease Free Water	Growcells.com	NUPW-0125
Essuie-tout à eau léger	VWR	82003-822	Pour le nettoyage des fournitures de dissection
Superscript II	invitrogen	18064014	Transcriptase inverse  ;
QIAdestructeur (50)	Extraction d’ARN	QIAGEN	79654
Oligo(dT)12-18 Primer	RT	life technologies	18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)Extraction	d’ARN	QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)	qPCR	Roche	04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER  ;	qPCR	Roche	06402712001
LIGHTCYCLER 480 - PLAQUE MULTIPUITS 96	qPCR	Roche	04729692001
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix	qPCR	NEB	M0541S