Protéine fluorescente verte bibloc pour visualiser les effecteurs livré de bactéries lors de l’Infection

Summary

Approches protéine fluorescentes pour surveiller les effecteurs sécrétées par des bactéries dans les cellules hôtes sont difficiles. Cela est dû à l’incompatibilité entre protéines fluorescentes et le système de sécrétion de type III. Ici, un système GFP superfolder split optimisé est utilisé pour la visualisation des effecteurs sécrétées par des bactéries dans la cellule de plante hôte.

Abstract

Bactéries, parmi les plus importants agents causals de diverses maladies des plantes, sécrètent un ensemble de protéines effectrices dans la cellule de plante hôte pour subvertir le système immunitaire de plante. Au cours de l’infection effecteurs cytoplasmiques sont livrés dans le cytosol hôte via un type de système de sécrétion III (T3SS). Après l’accouchement dans la cellule végétale, les effecteurs cible le (s) spécifiques pour moduler les processus hôtes de cellule de survie et de la réplication de l’agent pathogène. Bien qu’il y a eu quelques recherches sur la localisation subcellulaire des protéines effectrices dans les cellules hôtes pour comprendre leur fonction dans la pathogénicité en utilisant des protéines fluorescentes, enquête sur la dynamique des effecteurs directement injectés des bactéries a été difficile en raison de l’incompatibilité entre la T3SS et des protéines fluorescentes.

Nous décrivons ici notre méthode récente d’un système de protéine fluorescente verte de superfolder (sfGFP^OPT) split optimisé pour visualiser la localisation des effecteurs envoyées via la T3SS bactérienne dans la cellule hôte. Le sfGFP11 (11^ème β-brin de sfGFP)-effecteur Taggé sécrétée par le biais de la T3SS peut être assemblé avec un organite spécifique ciblé^OPT sfGFP1-10 (1-10^th β-brin de sfGFP) menant à l’émission de fluorescence sur le site. Ce protocole prévoit une procédure permettant de visualiser le signal de fluorescence sfGFP reconstitué avec une protéine effectrice de Pseudomonas syringae dans un organite particulier chez les plantes Arabidopsis et Nicotiana benthamiana .

Introduction

Les plantes sont des organismes sessiles que rencontrent de nombreux pathogènes envahisseurs, y compris les bactéries, champignons, virus, insectes et nématodes tout au long de leur cycle de vie. Parmi les phytopathogènes, les bactéries pathogènes Gram négatifs telles que Pseudomonas spp. et Ralstonia spp., infecter leurs plantes hôtes en entrant par le biais de plaies ou d’ouvertures naturelles, comme les stomates et hydathode¹. Pour coloniser les plantes hôtes avec succès, les bactéries pathogènes ont évolué pour développer une variété de facteurs de virulence². Lorsque les bactéries envahissent une p....

Protocol

Remarque : Toutes les mesures sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. préparation du matériel végétal (4 semaines)

1. Préparation pour les N. benthamiana plants
   1. Semer les 2 graines de N. benthamiana sur la surface du sol de chaque pot, recouvrir le plateau d’un dôme en plastique et laisser les graines à germer dans un 25 ° C, chambre de croissance humidité de 60 % avec un cycle de photopériode de lumière/obscurité de 8 h/16.
   2. Après deux semaines, choisir et jeter la plantule plus petite dans chaque pot et continuer à faire pousser des plantes dans les mêmes conditions ....

Results

La structure β-baril de GFP est composée d’onze brins β et peut être divisée en deux fragments, le brin de^th 1-10 (GFP1-10^OPT) et le brin de^th (GFP11) 11. Bien qu’aucun des deux fragments fluorescents par eux-mêmes, sfGFP auto-assemblés peut émettre la fluorescence quand les deux fragments existent à proximité (Figure 1 a). Dans ce système, sfGFP1-10^OPT-exprimant Arabidopsis ou N. benthamiana plant.......

Discussion

Le protocole décrit ici est utilisé pour surveiller la localisation précise des protéines effectrices injecté par la T3SS bactérienne dans la cellule végétale hôte à l’infection. Auparavant, le bibloc GFP a été utilisé comme un outil pour étudier la localisation sous-cellulaire des protéines de mammifères^23,36, Salmonella T3E localisation et Agrobacterium VirE2 livraison par l’entremise de le T4SS dans la ³⁷les cellules v.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidopsis			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Surveillance spatio-temporelle des effecteurs de Pseudomonas syringae via la sécrétion de type III à l’aide de fragments de protéines fluorescentes divisées. Cellule végétale. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	ABRC	CS69831
NU-sfGFP1-10	ABRC	CS69832
PT-sfGFP1-10	ABRC	CS69833
MT-sfGFP1-10	ABRC	CS69834
PX-sfGFP1-10	ABRC	CS69835
ER-sfGFP1-10	ABRC	CS69836
GO-sfGFP1-10	ABRC	CS69837
PM-sfGFP1-10	ABRC	CS69838
Plasmide sfGFP1-10OPT ciblant les organites			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Surveillance spatio-temporelle des effecteurs de Pseudomonas syringae via la sécrétion de type III à l’aide de fragments de protéines fluorescentes divisées. Cellule végétale. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	Addgene	97387
NU-sfGFP1-10	Addgene	97388
PT-sfGFP1-10	Addgene	97389
MT-sfGFP1-10	Addgene	97390
PX-sfGFP1-10	Addgene	97391
ER-sfGFP1-10	Addgene	97392
GO-sfGFP1-10	Addgene	97393
PM-sfGFP1-10	Addgene	97394
ER-sfCherry1-10	Addgene	97403
ER-sfYFP1-10	Addgene	97404
CYTO-sfCFP1-10	Addgene	97405
sfGFP11-tagged Vecteur compatible avec la passerelle pour le système de distribution effecteur basé sur T3SS	Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. et Dinesh-Kumar, S. P. Surveillance spatio-temporelle des effecteurs de Pseudomonas syringae via la sécrétion de type III à l’aide de fragments de protéines fluorescentes divisées. Cellule végétale. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	Addgene	98250	pAvrRpm1 :GW :HA-sfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la kanamycine (25 μg/ml)
pBK-GW-1-4	Addgene	98251	pAvrRpm1 :GW :HA-2xsfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la kanamycine (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2	Addgene	98252	pAvrRpm1 :AvrRPM1sp :GW :HA-sfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la kanamycine (25 μg/ml)
pBK-GW-2-4	Addgene	98253	pAvrRpm1 :AvrRPM1sp :GW :HA-2xsfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la kanamycine (25 μg/ml)
pBG-GW-1-2	Addgene	98254	pAvrRpm1 :GW :HA-sfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la gentamycine (25 μg/ml)
pBG-GW-1-4	Addgene	98255	pAvrRpm1 :GW :HA-2xsfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la gentamycine (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2	Addgene	98256	pAvrRpm1 :AvrRPM1sp :GW :HA-sfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la gentamycine (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4	Addgene	98257	pAvrRpm1 :AvrRPM1sp :GW :HA-2xsfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la gentamycine (25 μg/ml)
souches bactériennes
Agrobacterium tumefaciens GV3101			Csaba Koncz et Jeff Schell, Le promoteur du gène 5 de l’ADN-TL contrôle l’expression tissulaire spécifique des gènes chimères portés par un nouveau type de vecteur binaire Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Résistant à la gentamycine (50 μg/ml) et à la rifampicine (50 μg/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500			Kvitko, B. H. et al. Les délétions dans le répertoire des gènes effecteurs de sécrétion de type III de Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 révèlent un chevauchement fonctionnel entre les effecteurs. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Résistant à la rifampicine (100 μg/ml)
Composants du milieu
Milieu de germination pour plantes			Ajouter 2,165g/L Murashige & Poudre Skoog, 10 g/L de saccharose dans de l’eau. Ajuster au pH 5,8 et ajouter 2,2 g/L de phytagel. Autocalve.
Murashige & Skoog medium comprenant des vitamines	Duchefa Biochemie	M0222	Stocker à 4 ° ;C.
Saccharose	Duchefa Biochemie	S0809
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
LB			Ajouter 10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure, 10 g/L de NaCl à l’eau. Pour les milieux solides, ajouter 15 g/L de micro-agar. Autoclave.  ; Laisser refroidir la solution à 55 ° ; C, et ajoutez un antibiotique si nécessaire.
Tryptone	BD Bioscience	211705
Extrait de levure	BD Bioscience	212750
NaCl	Duchefa Biochemie	S0520
Micro agar	Duchefa Biochemie	M1002
King’s B media			10 g/L de protéase peptone #2, 1,5 g/L de K2HPO<>4, 15 g/L de gélose à l’eau. Autoclave. Refroidir à 55 ° ; C et ajoutez 15 ml/L de glycérol stérile et 5 ml/L de MgSO4 au milieu. Ajoutez des antibiotiques si nécessaire.
Proteose peptone	BD Bioscience	212120
Anhydrus K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128 USP
Glycérol	Duchefa Biochemie	G1345
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Bacto Agar	BD Bioscience	214010
Milieu liquide mannitol-glutamate (MG)			Ajouter 10 g/L de mannitol, 2 g/L d’acide L-glutamique, 0,5 g/L de KH2PO4, 0,2 g/L de NaCl et 0,2 g/L de MgSO4 à l’eau. Ajuster au pH 7
Mannitol	Duchefa Biochemie	M0803
Acide L-glutamique	Duchefa Biochemie	G0707
KH2PO4	Sigma-Aldrich	NIST200B
		d’infiltration	10 mM MES (acide 2-(N-morpholino)-éthane sulfonique), 10 mM MgCl2, 150 µ ; M acétosyringone. pH 5,6 ; Préparez un tampon frais avant utilisation.
MES	Duchefa Biochemie	M1503	Préparez 100 mM (pH 5,6) de bouillon dans de l’eau. Filtrer la stérilisation.
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Préparez 100 mM de stock dans l’eau. Autoclave.
Acétosyringone	Sigma-Aldrich	D134406	Préparez un stock de 150 mM dans du DMSO.
Microscope confocal Équipements/matériaux
710 à balayage laser Système confocal	Carl Zeiss
Axio observer Z1 microscope inversé	Carl Zeiss
Propidium	iodure ThermoFisher	P1304MP