Article de méthode

Surveillance de Génome-large d’erreurs de Transcription dans les organismes eucaryotes

DOI :

10.3791/57731

⸱

13 septembre 2018

 ,  , 
1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le présent protocole aux chercheurs un nouvel outil pour surveiller la fidélité de la transcription dans plusieurs organismes modèles.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transcription précise est nécessaire pour l’expression fidèle de l’information génétique. Étonnamment bien, on en sait peu sur les mécanismes qui contrôlent la fidélité de la transcription. Pour combler cette lacune dans les connaissances scientifiques, nous avons récemment optimisé le dosage de cercle-à-pas pour détecter les erreurs de transcription dans le transcriptome de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteret Caenorhabditis elegans. Ce protocole sera aux chercheurs un nouvel outil puissant pour cartographier le paysage des erreurs de transcription dans des cellules eucaryotes afin que les mécanismes qui contrôlent la fidélité de la transcription peuvent être élucidés en détail sans précédent.

Introduction

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Le génome fournit un plan biologique précis de la vie. Pour mettre en oeuvre ce plan correctement, il est important pour le génome à transcrire avec une grande précision. Cependant, la transcription est peu susceptible d’être sans erreur. Par exemple, les ARN polymérases ont longtemps été connus pour être sujette à vitro1,2, et récemment il a été démontré qu’ils commettent erreurs en vivo ainsi3,5,6, en particulier lorsqu’ils sont confrontés avec l’ADN des dommages7,8,9,10. Pris ensemble, ces observations indiquent que transcription des erreurs se produisent en permanence dans toutes les cellules vivantes, ce qui suggère qu’ils pourraient être une puissante source de protéines mutées.

Ce processus, appelé transcriptional mutagénèse, diffère de la mutagenèse classique de deux façons. Tout d’abord, contrairement aux mutations génétiques, erreurs de transcription affectent les cellules mitotiques et post-mitotiques, car ils ne dépendent pas de la réplication de l’ADN. Étudie les mécanismes qui influent sur la fidélité de la transcription fournira, par conséquent, un aperçu précieux dans la charge de la mutation des cellules mitotiques et post-mitotiques. Fait intéressant, les erreurs de transcription ont été récemment impliqués dans la promotion de l’agrégation de protéines11,12,13 et ont émis l’hypothèse pour contribuer à tant de carcinogenèse10 et la développement de résistance aux antibiotique chez les bactéries,14.

Deuxièmement, contrairement aux mutations génétiques, les erreurs de transcription sont transitoires dans la nature. Leur existence temporaire est particulièrement difficile car il fait des erreurs de transcription extrêmement difficiles à détecter. Par exemple, alors que plusieurs laboratoires ont conçu des dosages de journaliste précieux pour l’étude de la mutagénèse transcriptionnel, ces tests ne sont capables de mesurer les erreurs de transcription dans un nombre limité de contextes et modèle organismes4,15. Pour surmonter ces limites, de nombreux chercheurs sont tournent vers la technologie de séquençage de RNA (RNA-seq), qui permet en théorie des erreurs de transcription à enregistrer tout au long du transcriptome de toute espèce. Toutefois, ces études sont facilement confondus par les artefacts de construction de bibliothèque, tels que les erreurs de transcription inverse, erreurs d’amplification PCR et la nature sujette de séquencer lui-même. Par exemple, reverse transcriptases commis environ une erreur chaque bases de ~ 20 000, tandis que les ARN polymérases (RNAPs) devraient ne faire qu’une seule erreur tous les 300 000 bases5,6. Parce que le taux d’erreur de transcription inverse seul éclipse le taux d’erreur des ARN polymérases à l’intérieur des cellules, il est pratiquement impossible de distinguer les erreurs de transcription exacte des artefacts causés par la préparation de la bibliothèque de données traditionnelles de RNA-Seq ( Figure 1 a).

Pour résoudre ce problème, nous avons développé une version optimisée du cercle-séquençage (Cirseq ou C-seq désormais) dosage5,16. Ce test permet à l’utilisateur détecter les erreurs de transcription et autres variantes rares dans l’ARN dans tout le transcriptome5. L’essai circulaire-séquençage porte ce nom parce qu’il est une étape clé dans cet essai s’articule autour de circularization RNA. Une fois que les objectifs de RNA sont prospectés, ils sont inverses transcrit de façon cercle roulant, pour produire des molécules de cDNA linéaire qui contiennent de nombreuses copies du même modèle RNA. Si une erreur était présente dans un de ces modèles, cette erreur serait également présente dans chaque répétition unique contenue dans la molécule de cDNA. En revanche, les erreurs introduites par transcription inverse l’amplification par PCR et séquençage ont tendance à survenir au hasard et seront donc présents dans seulement une ou deux répétitions. Ainsi, en générant une séquence consensus pour chaque molécule de cAdn et distinguer les erreurs aléatoires des erreurs qui se produisent dans toutes les répétitions, artefacts construction bibliothèque efficacement se distingues des erreurs de transcription exacte (Figure 1 b).

Si utilisé correctement, le dosage de la C-seq peut servir à détecter avec précision le taux de substitutions de base, les insertions et suppressions dans l’ARN dans le transcriptome de toutes les espèces (par exemple, voir levé et Ochman17). Par exemple, nous avons utilisé le test C-seq pour fournir des mesures de Génome-large de la marge d’erreur de transcription dans Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteret Caenorhabditis elegans avec une résolution de base unique5 (observations inédites). Initialement utilisé pour séquencer avec précision les populations de virus à ARN, cette version optimisée de l’essai C-seq a été simplifiée pour réduire au minimum des conditions difficiles lors de la préparation de la bibliothèque qui contribuent aux artefacts de construction de bibliothèque. En outre, en utilisant un certain nombre de kits disponibles dans le commerce, le débit du dosage est grandement amélioré, ainsi que sa facilité d’utilisation. Si utilisé correctement, ce test peut détecter avec précision les milliers d’erreurs de transcription par réplicat, améliorant ainsi considérablement les précédentes études6. Dans l’ensemble, cette méthode fournit un outil puissant pour étudier la mutagénèse transcriptionnelle et permettra à l’utilisateur de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent la fidélité de la transcription dans un large éventail d’organismes nouveaux.

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Protocole

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1. préparation

  1. Ribonucléases sont omniprésents ; par conséquent, nettoyer l’espace de travail par pulvérisation il vers le bas avec un réactif de décontamination (par exemple, RNase AWAY) et 70 % d’éthanol. Jet vers le bas des pipettes, stylos ou supports de tube pour éliminer les sources potentielles de contamination de la RNase.
  2. Pour mieux prévenir les ribonucléases de contaminer les échantillons, porter une blouse ou un T-shirt manches longues pendant l’expérimentation. Éviter tout contact entre les gants et l’intérieur de tous les tubes qui seront utilisés, en particulier lorsque les récupérer à partir d’une boîte ou un sac.
  3. Avant la transcriptase inverse, les changer fréquemment.
    Remarque : Pour des résultats optimaux, ne pas interrompre l’expérience avant la transcriptase inverse.

2. cellules et Culture animale et Collection

  1. Collection et croissance de saccharomyces cerevisiae
    1. Si une bibliothèque C-seq est souhaitée à partir de levure, tout d’abord ensemencer une seule colonie de S. cerevisiae dans 3 mL de milieu contenant extrait de levure, adénine, peptone et dextrose (YAPD) et du jour au lendemain il incuber à 30 ° C dans un roulement de tambour.
    2. Dans la matinée, ré-ensemencer la culture dans 50 mL de milieu YAPD à une densité optique (do) de 0,1 et cultiver les cellules jusqu'à ce qu’ils atteignent une OD de 0,5 à 0,7 (~ 7 x 106 cellules/mL).
    3. Percevoir la culture entière 50 mL (environ 350 x 106 cellules) dans un tube conique de 50 mL et faire tourner les cellules vers le bas pendant 3 min à 2 100 x g. Retirez le support YAPD doucement et laver le culot une fois avec du PBS 1 x.
    4. Puis, resuspendre le culot dans 480 µL de tampon de lyse, 48 µL du SDS de 10 % et 480 µL de phénol : chloroforme : isoamylique alcool (25:24:1), pH 6,8. Vortex de l’échantillon à vitesse maximale pendant 5 s et le transfert d’un bouchon à vis 1,5 mL tube 750 µl de perles glacées zircone (fourni avec le kit). Passez à l’étape 3 du présent protocole pour la lyse des cellules et l’extraction de l’ARN totale.
      NOTE : Tous les réactifs nécessaires pour l’étape 2.1.4 sont fournis dans la levure recommandée kit d’extraction d’ARN. Ces réactifs fonctionnent aussi bien pour la levure, worms et vole donc qu’après la collecte de la levure (étape 2.1), vers (étape 2.2) ou des mouches (étape 2.3), une approche unifiée peut être utilisée pour générer des bibliothèques C-seq (étapes 3 à 10).
  2. Culture de Caenorhabditis elegans et collection
    1. Si une bibliothèque C-seq est souhaitée à partir de worms, déposer 30 vers adultes sur une assiette fraîche d’agar parsemée de bactéries OP50.
      NOTE : Cinq plaques suffisent pour la 1 réplique.
    2. Les vers la culture pendant 4 jours et recueille les vers en lavant délicatement les plaques avec 5 mL de M9 médias et mettre en commun les vers dans un tube conique unique 50 mL.
    3. Faites tourner les vers le bas à 100 x g pendant 2 min créer une boulette. Ralentir la centrifugeuse à la vitesse la plus basse possible, de manière à ne pas déranger le culot.
    4. Doucement déplacer les vers dans un tube de 1,5 mL, laver deux fois dans 1,5 mL de médias M9 et centrifuger le tube à 100 x g pendant 1 min éliminer les bactéries et générer une pastille de nettoyage 100 µL de worms.
    5. Remettre en suspension les vers en 480 µL de tampon de lyse et 480 µL de phénol : chloroforme : isoamylique Alcool 48 µL du SDS de 10 %. Vortex de l’échantillon à vitesse maximale pendant 5 s et le transfert d’un bouchon à vis 1,5 mL tube contenant 750 µL de perles glacées zircone. Passez à l’étape 3 du présent protocole pour provoquer la lyse les vers et l’extraction de l’ARN totale.
  3. Collection et la culture de drosophila melanogaster
    1. Si une bibliothèque C-seq est souhaitée à partir de mouches, culture 20 – 25 mouches dans des flacons contenant dextrose ou un milieu à base de mélasse. Aliquote les mouches plus 3 flacons, ainsi que chaque flacon contient environ 8 mouches.
    2. Pour collecter les mouches, placez le flacon dans un seau à glace jusqu'à ce que les mouches sont sous sédation. Ensuite, les recueillir avec une brosse dans un tube de 1,5 mL. Ne pas prélever les mouches par le CO2 traitement.
    3. Laissez les mouches chaudes à la température ambiante (RT) et rapidement ajouter 500 µL de phénol : chloroforme : isoamylique alcool un mélange premade de 500 µL de tampon de lyse et 50 µL de SDS de 10 % dans le tube. Utiliser un micropestle pour broyer les mouches avec environ 15 coups, accompagnés d’une firme de mouvement de torsion lorsque le pilon atteint le fond du tube.
    4. Verser le mélange de mouches et de médias de lyse dans un bouchon à vis 1,5 mL tube contenant 750 µL de billes de zircone glacée et vortex il à vitesse maximale pendant 5 s. continuer à l’étape 3 du présent protocole pour la lyse de l’oiseau et l’extraction de l’ARN totale.

3. le montant total RNA Purification

Remarque : À ce stade, tous les trois protocoles convergent, et une approche unifiée peut être utilisée pour générer des bibliothèques C-seq.

  1. Revisser le bouchon fermement et fixer le tube à un vortexer avec un adaptateur ou un ruban adhésif. Vortex le tube à vitesse maximale pendant 10 min à lyser les échantillons. Puis, centrifuger l’échantillon à 16 100 x g pendant 5 min séparer les solvants organiques de la phase aqueuse.
  2. Soigneusement retirer 400 – 500 µL de la phase aqueuse sans déranger l’interphase blanc, nuageux et ajoutez-le à un tube conique 15 mL contenant 1,9 mL de tampon de liaison. Les homogénéiser au vortex.
  3. Ajouter 1,25 mL d’éthanol à 100 % et mélanger l’échantillon au vortex. Transfert de 700 µL de l’échantillon à une cartouche de filtre Assemblée dans un tube de prélèvement et tournez l’échantillon à 14 500 x g pendant 30 s. répéter jusqu'à ce que la totalité de l’échantillon est passé au travers de la cartouche.
    Remarque : À ce stade, l’échantillon peut tourner légèrement opaque. Si trop de cellules, les vers ou les mouches ont été lysées, précipités pourraient apparaître qui peuvent obstruer le filtre.
  4. Laver le filtre une fois avec 700 µL de solution de lavage 1 et deux fois avec 500 µL de solution de lavage 2 ou 3. Fini les lavages en faisant tourner les échantillons à 14 500 g pendant 2 min enlever tout excès d’éthanol.
  5. Transférer la cartouche de filtre dans un tube de Dauphin de 1,5 mL et ajouter 108 µL de solution d’élution préchauffée (65 ° C).
    NOTE : Ne jamais exposer échantillons d’ARN à des températures supérieures à 65 ° C avant d’être une transcription inverse, que faire alors provoquera une cytosine aux événements de désamination uracile qui sont impossibles à distinguer des erreurs de transcription.
  6. Dégrader l’ADN contaminant dans l’ARN isolé (voir étapes 2.1 – 3,4) en ajoutant 11 µL de 10 x la DNase I mettre en mémoire tampon, 2 µL d’inhibiteur de RNase et 4 µL de DNase I (8 U) et les incuber à 37 ° C pendant 30 min.
  7. Après digestion, ajouter 11 µL de réactif de l’inactivation de DNase. Vortex du mélange et laisser reposer à ta pendant 5 min. Puis, centrifuger l’échantillon à 15 000 x g pendant 3 min pour le réactif de l’inactivation de granule et collecter 110 µL du liquide surnageant sans déranger le culot. Transférer le surnageant dans un tube de 1,5 mL.
    NOTE : Le réactif d’inactivation de DNase peut être assez difficile à pipeter correctement, donc vérifiez visuellement la pipette après chaque action de pipetage. Si le réactif d’inactivation devient trop visqueux à la pipette, ajouter 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) égal à 1/5 du volume restant.
  8. (Contrôle qualité) Mesurer la concentration de l’ARN total à l’aide d’un spectrophotomètre. Puis mettre de côté 1 µL d’ARN total et le diluer à une concentration de 10 ng/µL dans l’eau sans nucléase (NF). Exécutez l’ARN sur un instrument d’analyse appropriée de nucléotides avec une bande d’ARN haute sensibilité pour s’assurer que l’ARN n’est pas dégradée et a une valeur d’eRIN d’au moins 8,5 ou supérieur (Figure 2 b).

4. ARNm enrichissement

  1. Effectuer l’enrichissement de l’ARNm avec un miniprep ARNm nécessaire (voir la Table des matières). Ajouter 140 µL d’eau NF à l’échantillon pour un volume total de 250 µL. Puis, ajouter 250 µL de 2 x tampon de liaison, bien mélanger l’échantillon au vortex et ajouter 15 µL de billes oligo (dT).
  2. Mélanger l’échantillon en pipettant également, il monte et descend et il incuber à 65 ° C pendant 2 min. Ensuite, placer l’échantillon à la droite pendant 10 min. Enfin, centrifuger l’échantillon à 16 100 x g pendant 2 min granuler les complexes de perle : ARNm.
  3. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 500 µL de solution de lavage. Transvaser la solution dans une colonne et le tourner pendant 1 min à 15 000 x g. Jeter le cheminement et laver l’échantillon avec un supplémentaire 500 µL de solution de lavage. Ensuite, tourner l’échantillon pendant 2 min à 15 000 g pour enlever tout excès d’éthanol des filtres spin.
  4. Transférer le filtre essorage dans un tube de Dauphin et Resuspendre le culot dans la colonne 80 µl de solution d’élution préchauffée (65 ° C). Incuber l’échantillon pendant 1,5 min à 65 ° C et il éluer par il tourne pendant 1 min à 15 000 x g.
  5. Mesurer la concentration de l’ARN purifié à l’aide d’un spectrophotomètre ou un outil similaire qui permet la quantification de la concentration d’ARN et de la qualité.

5. nettoyer les ARN et la Fragmentation de RNase III

NOTE : (Important) pour préparer des molécules d’ARN circulaires appropriées pour générer des bibliothèques C-seq, l’ARN doit être fragmenté pour environ 60 à 80 bases de longueur. Tandis que les méthodes précédentes ont utilisé une fragmentation chimique au fragment RNA, fragmentation chimique avec des métaux lourds introduit des dommages pour les échantillons d’ARN qui peuvent être mal interprétés comme des erreurs de transcription au cours de la dernière analyse. Pour contourner ce problème, s’appuient plutôt sur une fragmentation à l’aide de RNase III pour générer de petits fragments. Un autre avantage de cette approche enzymatique est qu’il crée des extrémités compatibles requises pour la ligature, il ne soit pas la nécessité d’une réparation de fin après la fragmentation chimique.

  1. Mettre en place la réaction de fragmentation du RNA avec 1 µg d’ARN purifié, 10 µL de tampon de réaction, 5 µL de RNase III et assez NF water pour porter le volume jusqu'à 100 µL (voir Table des matières). Ajoutez l’enzyme dernière et Pipeter le mélange monte et descend au moins 10 fois pour mélanger. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 25 min, ce qui tend à produire des fragments d’ARN d’environ 60-80 bases de longueur.
  2. Une fois terminée l’incubation de 25 min, nettoyer la réaction immédiatement avec un oligo nettoyage et concentrateur kit (voir Table des matières) pour empêcher toute digestion supplémentaire. Ajouter 200 µL de tampon de l’oligo-liaison à l’échantillon, homogénéiser au vortex et ajouter 800 µL d’éthanol à 100 %. Mélanger l’échantillon au vortex et transférez-la sur une colonne dans un tube de prélèvement fourni.
  3. Centrifuger l’échantillon à 10 000 x g pendant 30 s et lavage avec 750 µL de tampon de lavage pour éliminer la RNase III. Centrifuger l’échantillon à 10 000 x g pendant 30 s, jetez le cheminement et laver l’échantillon une fois de plus avec 750 µL de tampon de lavage tel que décrit ci-dessus. Après le deuxième intermédiaire a été écarté, centrifuger la colonne à 15 000 x g pendant 2 min enlever tout excès d’éthanol.
  4. Transférer la colonne à un tube frais de 1,5 mL et éluer l’échantillon dans 24 µL d’eau NF en il tourne à 10 000 x g pendant 1 min.
  5. Contrôle de qualité : Prendre 2 µL des fragments d’ARN purifiés et 2 fois le diluer en ajoutant 2 µL d’eau NF. Exécutez l’ARN fragmenté sur une bande d’écran pour s’assurer que l’ARN fragmenté est de l’ordre de 50 – 100 bases de longueur (Figure 2c).

6. RNA Circularization et cercle roulant Transcription inverse

  1. Pour circularize les fragments d’ARN, chaleur-dénaturer 20 µL de l’échantillon à 65 ° C pendant 1 min et placez-le sur la glace immédiatement pendant 2 min. Ensuite, ajoutez 4 µL de 10 x T4 ARN ligase buffer, 4 µL d’ATP 10 mM, 1 µL d’inhibiteur de RNase, 1 µL d’eau NF et 8 µL de 50 % de polyéthylène glycol (PEG).
  2. Bien mélanger l’échantillon au Vortex, puis rajouter 2 µL de 10 U/µL de T4 ARN Ligase I. mélanger l’échantillon en pipettant également, il et elle incuber à 25 ° C pendant 2 h dans un thermocycleur avec la température du couvercle fixé à 30 ° C.
  3. Après 2 h, ajouter 10 µL d’eau NF dans l’échantillon et nettoyer l’échantillon avec un kit de nettoyage et de la concentration d’oligo selon les spécifications du fabricant. Éluer l’échantillon dans 20 µL d’eau NF.
  4. Pour inverser transcrire les molécules d’ARN circulaires, ajouter 4 µL des dNTPs 10 mM, 4 µL de 50 ng/µL hexamères aléatoire et 9 µL d’eau NF à 9 µL d’ARN. Mélanger le tout soigneusement en pipettant également, dénaturer l’échantillon à 65 ° C pendant 1 min et placez-le sur la glace pendant 2 min. magasin l’ARN restant comme back-up.
  5. Ajouter 8 µL de tampon de synthèse du premier-brin x 5 et 2 µL de 0,1 mM TNT 4 µL de 200 U/µL de la transcriptase inverse et mélanger le tout par pipetage. Incuber les échantillons à 25 ° C pendant 10 min, suivie d’une incubation de 20 min à 42 ° C avec le couvercle fixé à 5 ° C supérieure à la température d’incubation.
    Remarque : Une transcriptase inverse avec des capacités de déplacement brin doit être utilisé à cette étape afin de permettre une transcription inverse de cercle roulant.
  6. Ajouter 10 µL d’eau NF dans l’échantillon et le nettoyer avec le kit de nettoyage et de la concentration d’oligo selon les recommandations du fabricant. Éluer l’échantillon dans 42 µL de solution d’élution.
  7. Contrôle de qualité : Diluer 2 µL de l’ADNc simple brin dans 2 µL d’eau NF et exécutez cet exemple sur un instrument d’analyse de nucléotides avec une bande d’ARN haute sensibilité. Si la transcription inverse a fonctionné correctement, une bibliothèque de molécules de cDNA, allant approximativement de 60 – 1 500 bases de longueur, doit être visible. Idéalement, la plupart ADNc est de l’ordre de 500 – 1 000 bases (Figure 2d).

7. deuxième synthèse de cDNA de brin et réparation fin

  1. Utiliser un kit de synthèse deuxième brin pour générer une bibliothèque d’ADNc double brin. Placer les échantillons sur la glace et ajouter 30 µL d’eau NF à 38 µL de votre échantillon. Ensuite, ajoutez 8 µL du deuxième brin mémoire tampon 10 x et 4 µL de deuxième brin Enzyme et mélanger l’échantillon en douce de pipetage avant son incubation à 16 ° C, pendant 2,5 heures.
  2. Nettoyer les échantillons avec les oligo purification et concentration kit selon les recommandations du fabricant pour les 100 réactions µL et éluer les échantillons dans 38 µL d’eau NF.
  3. Mettre en place la réaction de fin-réparation en ajoutant 20 µL d’eau NF à 35,5 µL de l’ADNc double brin, 6,5 µL de tampon de réaction réparer fin et 3 µL de fin mélange de préparation enzymatique. Soigneusement vérifier le tampon de réaction des précipités blanches et les dissoudre en main-le réchauffement s’il est présent.
  4. La réaction de fin-réparation de la composition de pipetage et il incuber à 20 ° C pendant 30 min, suivie d’une deuxième période d’incubation de 30 min à 65 ° C. Régler la température du couvercle thermocycleur à 5 ° C supérieure à la température d’incubation.

8. adaptateur ligature et sélection de la taille des bibliothèques de prêts

  1. Utiliser un module de préparation bibliothèque plusieurs étapes pour la préparation finale de bibliothèque (voir Table des matières). Tout d’abord, diluer les adaptateurs pour les génération séquençage 10 fois dans 10 mM Tris-HCl à une concentration finale de 1,5 µM. Puis, ajouter 2,5 µL d’adaptateur dilué et 1 µL de renforceur de ligature à chaque échantillon et les mélanger au vortex.
  2. Ajouter 15 µL du mélange réactionnel Ligase Blunt/TA, mélangez-le en pipettant également et il incuber à 20 ° C pendant 15 minutes. Puis, ajouter 3 µL d’enzyme réactif spécifique uracile excision et elle incuber à 37 ° C pendant 15 min. Après que la ligature est terminée, ajouter 13,5 µL d’eau NF à l’échantillon pour un volume total de 100 µL et procéder à la sélection de la taille.
    Remarque : Il est préférable de taille-choisir pour des molécules de cDNA qui sont de l’ordre de 600 à 800 bases de longueur. Si les molécules d’ARN fragmentés étaient approximativement de 60 à 80 bases de longueur, sélection de molécules qui sont 600 – 800 bases de longueur veillera à ce que la plupart des molécules sélectionnées contiennent au moins trois séquences répétées en tandem, ce qui est idéal pour la transformation en aval et analyse.
  3. Pour sélectionner des molécules qui sont bp 600 – 800 de longueur, ajouter 30 µL de suspension billes magnétiques (voir Table des matières), acclimatés à RT, pour chaque échantillon et mélanger en pipettant également. Transférer l’échantillon dans un tube de 1,5 mL et laisser incuber à ta 5 min.
  4. Placer l’échantillon sur un support magnétique pendant 5 min séparer les billes du surnageant. Transférer le surnageant (qui contient les molécules de cDNA désiré) pour un nouveau 1,5 mL de tube et éliminer des billes magnétiques (qui sont liés à des molécules de cDNA grand).
  5. Ajouter une portion de frais de 15 µL de billes magnétiques pour chacun des échantillons, bien mélanger en pipettant également et incuber pendant 5 min à la Place de la RT. les échantillons sur un support magnétique et les incuber pendant 5 min à température ambiante. Puis, délicatement, enlever et jeter les surnageants, veillant à ne pas déranger les perles.
    Remarque : Ne pas jeter les billes magnétiques, qui contiennent maintenant l’ADNc cible souhaitée.
  6. Ajouter 200 µL de 80 % fraîchement préparés chacun des échantillons d’éthanol sans déranger les billes magnétiques granulés et incuber pendant 30 s. jeter l’éthanol et laver les échantillons une fois de plus avec l’éthanol à 80 %. Puis, complètement éliminer toute trace d’éthanol à partir des échantillons et sécher les perles pendant 5 min mais veillez à ne pas trop sécher les perles. Si les perles sont overdried, fissures apparaîtront dans les boulettes.
  7. Pour éluer les échantillons provenant des perles, retirer les tubes du support magnétique et ajouter 19 µL de 10 mM Tris-HCl. pipette il vers le haut et vers le bas plusieurs fois à remis en suspension les perles et incuber les échantillons pendant 5 min à température ambiante. Si les billes étaient overdried, incuber à > 10 min.
  8. Replacez les échantillons sur le support magnétique et incuber les pendant 5 min séparer les billes du surnageant. Soigneusement retirer 15 µL de surnageant contenant les banques d’ADNc purifiée, sélectionné à la taille des tubes et le transférer dans un tube frais 1,5 mL.

9. PCR Amplification et Purification finale perle

  1. Ajouter 5 µL de l’amorce universelle et 5 µL d’une amorce de l’index unique (voir la Table des matières) à chaque purifiée d’ADNc et mélangez-les soigneusement par pipetage. Soigneusement vérifier le mélange maître polymérase de cristaux et autres précipités et chauffer le mélange maître à la main jusqu'à ce que les précipités se dissolvent.
    1. Ajouter 25 µL du mélange maître polymérase de l’échantillon, mélangez-les en pipettant également et suivre les conditions cyclisme ci-dessous pour l’amplification PCR. Exécutez la dénaturation initiale à 98 ° C pendant 30 s, puis effectuez une étape double réaction PCR par tous les échantillons à 98 ° C pendant 10 s et une recuit/extension des produits PCR à 65 ° C pendant 75 s (x 12), suivi d’une extension finale à 65 ° C pendant 5 min et une attente indéfinie à 4 ° C.
  2. Nettoyer les bibliothèques final en ajoutant 45 µL de suspension perles magnétiques directement à la réaction de PCR, mélangez-les en pipettant également et eux à ta pendant 5 min. transfert Incuber l’échantillon dans un tube de 1,5 mL et placez-le sur un support magnétique. Il incuber pendant 5 min, jeter le surnageant et le laver deux fois avec fraîchement préparée éthanol à 80 % pendant 30 s.
  3. Après le deuxième lavage, complètement éliminer l’éthanol de l’échantillon et sécher le culot de perle pendant 5 min et il éluer dans 35 µL de 0,1 x TE. Resuspendre les perles en pipettant également, eux et incuber entre eux RT pendant 5 min Place l’échantillon sur le support magnétique et après 5 min, transfert 30 µL du liquide surnageant dans un tube frais de 1,5 mL. Stocker les bibliothèques à-80 ° C.
  4. Contrôle de qualité : Diluer 1 µL de la bibliothèque finale à 9 µL d’eau NF et exécuter l’exemple sur un instrument d’analyse ADN dédié avec une puce haute sensibilité ; la majorité des ADNc devrait être de l’ordre de 600 à 800 bp de longueur (Figure 2e).
  5. Après l’élution, envoyer les échantillons pour le séquençage sur une plate-forme de séquençage massivement parallèle à l’aide de 250 lectures jumelé-fin de bp, ou les 300 bp single-end lectures.

10. bio-informatique analyse du cercle données de séquençage

NOTE : Analyser et interpréter les données brutes tirées de l’essai C-seq nécessitent un pipeline de bio-informatique dédié. Une représentation schématique du pipeline qui a été utilisée pour nos analyses est représentée à la Figure 3. Télécharger ce gazoduc à https://github.com/LynchLab/MAPGD.

  1. Tout d’abord, coupez les lectures à supprimer adaptateur séquences et de faible qualité base appelle cutadapt18, en utilisant un seuil de score de qualité de 20.
  2. Ensuite, identifier les répétitions codées par la molécule d’ARN de concatemerized en utilisant un algorithme approprié pour détecter toute répète avec une taille minimale de 30 nucléotides et un maximum de 2 incompatibilités entre reprend18. Dérivez une séquence consensus de ces répétitions et garder une trace de tous les appels de base et les scores de qualité associé à chaque position.
    Remarque : Étant donné que la transcription inverse peut commencer à n’importe quelle position sur la molécule d’ARN ΦH1, le début d’une répétition ne correspond pas nécessairement à l’extrémité 5′ de la molécule d’ARN fragmentée (ci-après dénommée le point de ligature). Par conséquent, la séquence consensus ne mappera pas continuellement contre le transcriptome correspondant, qui nécessite l’identification de la borne de la ligature.
  3. Pour identifier le point de la ligature, mapper un concatemer de la séquence consensus contre le transcriptome de référence en utilisant l’alignement BLAST-comme outil (BLAT)19.
    1. Concaténer deux instances de la séquence consensus pour s’assurer que la séquence mappée contienne au moins une occurrence sans interruption complète de la séquence de fragment d’ARN initiale. Puis, faites tourner la séquence consensus à commencer par la position du point prédit la ligature.
  4. Carte les séquences consensus tourné contre le génome en utilisant TopHat20 et utiliser les alignements pour détecter toute polymorphismes mononucléotidiques (SNP) qui pourraient être confondu avec erreurs de transcription.
  5. Appelez les erreurs de transcription des séquences consensus pivoté mappé et vérifier si les erreurs de candidats passent quatre essais supplémentaires.
    1. Tout d’abord, veiller à ce qu’une erreur de transcription ne se chevauche pas avec un SNP (une exigence typique, c’est qu’au moins 20 lectures devront couvrir un particulier base et pas plus de 5 % de la lecture peut prendre en charge un autre appel de base).
    2. Ensuite, vérifiez que la séquence consensus est dérivée d’au moins 3 séquences répétées en tandem, chacune d’elles appelle la même paire de base ; et Troisièmement, assurez-vous que la somme des scores de qualité de ce poste doit être supérieur à 100.
  6. Pour une quatrième et dernière vérifier, faire pivoter la séquence consensus dans toutes les combinaisons possibles (simulant toutes les positions possibles du point de ligature) et carte de chaque version contre le génome de référence en utilisant TopHat.
    Remarque : Si une des séquences tournées trouve une correspondance parfaite dans le génome, le point correspondant de la ligature est maintenant considérée comme correcte et l’appel d’erreur de transcription doit être rejeté.

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Résultats

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Comme toutes les approches de séquençage massivement parallèle, chaque expérience de C-seq produit un ensemble de données difficiles à manier, grand. Pour les nouveaux utilisateurs, il peut être difficile à gérer ces ensembles de données ; ainsi, il est recommandé que tous les utilisateurs une expérience bio-disponible avant l’expérimentation. En moyenne, l’espoir est que les utilisateurs vont générer environ 55 – 70 Giga bases (Gbases) par course sur la plupart des plateformes de séquenç...

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Discussion

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Nous décrivons ici un protocole optimisé pour la préparation des bibliothèques C-seq pour la détection des erreurs de transcription dans Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteret Caenorhabditis elegans. Ce protocole a de nombreux avantages par rapport aux protocoles existants, ainsi que des techniques alternatives.

Au cours des 15 dernières années, nombreux journaliste ont élaboré des systèmes qui dépendent de la luciférase7,

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Cette publication a été rendue possible par le financement de subventions T32ES019851 (de C. Fritsch), R01AG054641 et un jeune chercheur AFAR accordent (à M. Vermulst).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit de purification d’ARN RiboPureThermoFisherAM1926Purification d’ARN total
Kit de purification d’ARNm GeneluteSigma-AldrichMRN70-1KTPurification d’ARNm
Eau sans nucléaseAmbionAM9937Élution et dilution
Ambion RNase IIIThermoFisherAM2290Fragmentation de l’ARN
T4 ARN Ligase 1 (ssRNA Ligase)New England BiolabsM0204SCircularisation de l’ARN
RibolockThermoFisherEO0381Inhibiteur de la RNase
SuperScript III Transcriptase inverseThermoFisher18080044Transcription inverse à cercle roulant
10 mM dNTP mixThermoFisher18427013Transcription inverse à cercle roulant
Hexamères aléatoires (50 ng/µ ; L)ThermoFisherN8080127Transcription inverse à cercle roulant
NEB Module de synthèse de deuxième brinNew England BiolabsE6111SSynthèse de deuxième brin
NEBNext Ultra Kit de préparation de bibliothèque d’ADN pour IlluminaNew England BiolabsE7370SPréparation de la banque d’ADNc
NEB Next amorces d’indexNEBE7335SAmorces de PCR multiplex
Oligo Clean & ConcentrateurZymo ResearchD4061Nettoyage d’échantillons d’ARN et d’ADN
DynaMag-2Magnet ThermoFisher12321DPurification par billes magnétiques
Perles AMPure XPBeckman CoulterA63881Purification par billes magnétiques
Eppendorf 5424 MicrocentrifugeuseFisherScientific05-403-93Centrifugation
INCU-Shaker 10 LBenchmark ScientificH1010Culture cellulaire
Thermocycleur T100BIO RAD1861096Conditions de cyclage à moyenne à haute température
PTC-200 ThermocycleurGMI8252-30-0001  ;Conditions de cycle à basse température
RNase AwayMolecular Bioproducts700S-11Stérilisation
50 mL Tube à centrifugerCorning430290nucléases
15 mL Tube à centrifugerCorning430052sans nucléases
USA Scientific1615-5500sans nucléases
AgilentG2991AAInstrument d’analyse nucléotidique pour le contrôle de la qualité d’échantillons d’ARN et d’ADN simple brin
Haute sensibilitéScreenTape Agilent5067-5579Contrôle qualité d’échantillons d’ARN et d’ADN simple brin
ScreenTape BufferAgilent5067-5577Contrôle qualité d’échantillons d’ARN et d’ADN simple brin
Échelle ScreenTape Agilent5067-5578Contrôle de la qualité des échantillons d’ARN et d’ADN simple brin
2100 BioanalyseurAgilentG2939BAContrôle qualité de l’ADN double brin
Kit d’ADN haute sensibilitéAgilent5067-4626Contrôle de la qualité des échantillons d’ADNc double brin
Bain d’eauVWR462-0244Incubation
NanoDrop 2000/2000C Spectrophotomètre ThermoFisherND-2000CDétermination de la concentration d’ARN
Sans Tubes Eppendorf Système de tapisserie 4200

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
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  6. Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
  7. Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
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