Article de méthode

Évaluation du rôle de la fonction mitochondriale en Fatigue liée au Cancer

DOI :

10.3791/57736

⸱

17 mai 2018

 ,  ,  , 
1National Institute of Nursing Research, National Institutes of Health

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Notre objectif était d’élaborer un protocole pratique pour évaluer le dysfonctionnement mitochondrial associé de fatigue chez les patients atteints de cancer. Ce protocole novateur est optimisé pour l’usage clinique impliquant seulement standard phlébotomie et procédures de laboratoire de base.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fatigue est un commun et invalidante maladie qui affecte la plupart des patients de cancer. A ce jour, reste de fatigue mal caractérisé avec aucun diagnostic test pour mesurer objectivement la gravité de cette affection. Nous décrivons ici une méthode optimisée pour évaluer la fonction mitochondriale de PBMC provenant de patients atteints de cancer fatigué. Avec un système compact de flux extracellulaire et l’injection séquentielle des inhibiteurs respiratoires, nous avons examiné état fonctionnel mitochondrial PBMC par mesurer la respiration mitochondriale basale, rechange capacité respiratoire et le phénotype de l’énergie, qui décrit la voie de l’énergie préférée à réagir au stress. PBMC fraîches est facilement disponibles en milieu clinique à l’aide de phlébotomie standard. Le test complet décrit dans le présent protocole peut être complété en moins de 4 heures sans l’implication des techniques biochimiques complexes. En outre, les auteurs décrivent une méthode de normalisation qui est nécessaire pour l’obtention de données reproductibles. Les procédure ainsi que la normalisation des méthodes simples présentées permettent de prélèvement d’échantillons répétés du même patient et générer des données reproductibles qui peuvent être comparées entre points dans le temps d’évaluer les effets potentiels du traitement.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fatigue est une condition pénible et répandue qui a un impact négatif sur la qualité de vie des patients de cancer1. À ce jour, fatigue cancer reste mal défini et s’appuie uniquement sur les rapports subjectifs patients2. Par conséquent, il y a un besoin urgent d’identifier un test de laboratoire de diagnostic facilement adaptable pour caractériser objectivement la fatigue dans le contexte clinique3,4.

Plusieurs mécanismes sous-jacents, y compris le dysfonctionnement des mitochondries, ont été proposées pour causer fatigue5. Les mitochondries sont les organites de la centrale, qui fournit 95 % des besoins en énergie cellulaire par l’intermédiaire de la phosphorylation oxydative et jouent un rôle important dans la signalisation calcique, apoptose, signalisation immunitaire et régulation de la signalisation intracellulaire événements6 . En conséquence, bioénergétique mitochondriale avec facultés affaiblies et les défauts de production d’énergie peuvent contribuer à la fatigue. Faveur de cette hypothèse, des études antérieures ont observé des mutations de l’ADN mitochondrial chez les patients atteints de syndrome de fatigue chronique7. Alors qu’on ne sait toujours pas si l’origine physiopathologique de la fatigue se situe dans le système nerveux central ou des tissus périphériques, tels que les muscles squelettiques8,9, il n’y a actuellement aucune méthode directe d’évaluer avec précision dysfonctionnement mitochondrial lié à la fatigue dans les cellules vivantes, respiration.

À l’aide de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) pour étudier la fonction mitochondriale offre plusieurs avantages. Tout d’abord, PBMC est facilement disponibles en milieu clinique à l’aide de phlébotomie standard et peut être isolée rapidement en utilisant des techniques de laboratoire de base. Deuxièmement, prélèvement de sang est moins invasif que la collecte d’autres tissus comme une biopsie musculaire. Ainsi, les échantillons de sang peuvent être recueillies chez le même patient à plusieurs reprises au fil du temps, ce qui facilite une évaluation longitudinale des effets du traitement. Fait intéressant, la fonction mitochondriale chez PBMC semblait être bien corrélée à statut mitochondrial rein dans un modèle animal de10. En outre, les mitochondries des cellules immunitaires ont servi en tant que proxy pour détecter des changements systémiques sous différentes maladies conditions11,12. Les mitochondries dans les cellules immunitaires circulantes sont particulièrement sensibles aux changements dans les fonctions immunitaires et immunitaire, signalisation des molécules telles que les cytokines13,14,15. Par exemple, on a observé que les PBMC de patients atteints de maladies inflammatoires rhumatismales aiguës pièce base élevées d’oxygène consommation14. En revanche, la consommation d’oxygène est réduite chez PBMC isolées de patients avec des conditions inflammatoires systémiques, y compris septicémie16. Dans des conditions inflammatoires, radicaux libres produits par les mitochondries dysfonctionnelles peuvent contribuer davantage à élevé de stress oxydatif et l’inflammation prolongée de17. Le rôle central des mitochondries dans la production d’énergie ainsi que dans le stress oxydatif suggère l’utilité potentielle de l’utilisation de la fonction mitochondriale comme un proxy pour l’étude de fatigue chez les patients de cancer 13.

Des études antérieures examinant la fonction mitochondriale utilisé des techniques biochimiques, mesure de potentiel de membrane mitochondrial ou l’isolement des populations de cellules spécifiques qui peuvent ne pas être facilement adaptable dans le contexte clinique5, 14,,18. Ces dernières années, le développement des analyses de flux extracellulaire a permis aux chercheurs de facilement et avec précision examiner les changements dans les taux de consommation d’oxygène (OCR) en réponse à des injections automatisées d’inhibiteurs respiratoire19,20 , 21 , 22. Toutefois, la plupart de ces études est conçue pour des types spécifiques de cellules et le grand format haut débit n’est peut-être pas applicable en milieu clinique. Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un protocole optimisé pour l’examen de la fonction mitochondriale pour l’usage clinique.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La présente étude (NCT00852111) a été approuvée par l’Institutional Review Board (IRB) de la National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland. Les participants inscrits dans cette étude étaient des hommes d’euthymique, 18 ans ou plus, qui ont été diagnostiqués avec cancer de la prostate non métastatique avec ou sans prostatectomie préalable et ont été à la demande de recevoir la radiothérapie externe (radiothérapie externe). Les participants potentiels ont été exclus s’ils avaient une maladie progressive qui pourrait causer la fatigue importante, avaient une maladie psychiatrique dans les cinq dernières années, avaient hypothyroïdie non corrigée ou une anémie, ou avait un deuxième cancer. Les personnes qui ont utilisé des sédatifs, des stéroïdes ou des agents anti-inflammatoires non stéroïdiens ont également été exclus. Les échantillons de sang de contrôle sain ont été prélevés à la médecine de NIH Department of Transfusion donneurs sains en vertu d’un protocole approuvé par la CISR (NCT00001846). Tous les participants sont recrutés au centre de recherche clinique Magnuson aux NIH. Signé consentements écrits de connaissance ont été obtenues avant la participation à l’étude.

1. préparation de mesure de fonction mitochondriale (1er jour de l’expérience)

  1. Hydrater la cartouche de sonde (voir Table des matières; durée approximative : 5 min).
    1. Sortir cartouche de sonde de l’emballage. Ajouter 200 μl de solution de Calibrant dans chaque puits de la plaque de l’utilitaire, puis remplir chaque fossé avec solution de Calibrant 400 μL.
    2. Plaque de contact retour sur la plaque de l’utilitaire, qui a maintenant la solution degré dedans. Hydrater la cartouche dans un incubateur à 37 ° C non-CO2 pendant la nuit.
      NOTE : Cartouche de sonde doit être hydratée pendant un minimum de 4 h et un maximum de 72 h.

2. préparation de l’échantillon clinique (le 2e jour de l’expérience)

  1. Mesurer la fatigue à l’aide de la 13-point fonctionnels évaluation de maladie thérapie chronique - Fatigue (FACIT-F)2,23,24 au départ (avant le début de la radiothérapie externe), milieu et fin de la radiothérapie externe et 1 an post-radiothérapie externe.
    1. Utilisation d’un 0 - 4 échelle pour chaque réponse point, où 0 représente « pas du tout » et un 4 indique que l’intimé a trait à l’instruction correspondante « beaucoup. » Scores totaux devraient aller de 16-53, avec des scores plus faibles, reflétant l’intensité de la fatigue élevée.
    2. Qualifier un score de FACIT-F inférieur à 43, avec un score de FACIT-F de ≥43 indiquant l’absence d’ou fatigue pas cliniquement significative2de fatigue.
      Remarque : Un score FACIT-F 43 meilleures divise les scores de fatigue des patients atteints de cancer et de la population générale2.
    3. Inclure les éléments suivants de 13 dans l’échelle de Fatigue FACIT : 1) je me sens fatigué ; 2) je me sens faible partout ; 3) je me sens apathique (« délavées ») ; 4) je me sens fatigué ; 5) j’ai du mal à partir de choses parce que je suis fatigué ; 6) j’ai mal à finir les choses parce que je suis fatigué ; 7) j’ai d’énergie ; 8) je suis capable de faire mes activités habituelles ; 9) j’ai besoin de dormir pendant la journée ; 10) je suis trop fatigué pour manger ; 11) j’ai besoin d’aide faire mes activités habituelles ; 12) je suis frustré par être trop fatigué pour faire les choses que je veux faire ; et 13) je dois limiter mes activités sociales parce que je suis fatigué.
  2. Isoler les PBMC provenant d’échantillons de sang fraîchement prélevés (durée approximative : 1 h).
    1. Recueillir 8 mL de sang dans un Tube de préparation de cellules mononucléées (voir Table des matières).
      Remarque : Les échantillons de sang doivent être traités dans les 2 h suivant le prélèvement. La qualité des PBMC peut être compromise si les échantillons de sang sont traitées plus de 2 h après le prélèvement de l’échantillon.
    2. Centrifuger à 1 750 g pendant 30 min à température ambiante (18-25 ° C). Transférer la couche nuageuse dans un tube conique de 15 mL. Ajouter jusqu'à 15 mL de PBS et renverser 5 fois.
    3. Centrifuger à 300 x g pendant 15 minutes à 4 ° C. Retirez délicatement et éliminer le liquide surnageant sans culot inquiétante. Resuspendre le culot en ajoutant jusqu'à 10 mL de PBS et inverser 5 fois.
    4. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le liquide surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS. Transférer les PBMC dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
    5. Centrifuger à 610 x g pendant 10 minutes. Soigneusement, éliminer le surnageant et Resuspendre le culot dans complet RPMI-1640 (RPMI-1640 additionné de 10 % FBS, 10 mM la pénicilline/streptomycine).
  3. Enduire plaques de la cellule pour les cellules non adhérentes (durée approximative : 30 min).
    1. Préparer la solution adhésive cellulaire et tissulaire (voir Table des matières) en diluant la solution 0,1 M de bicarbonate de sodium pH 8.0. La solution de travail doit être à 3,5 μg/cm2 de surface.
      NOTE : Cette solution contient polyphénoliques protéines extraites de la moule Mytilus edulis. Ces protéines sont des éléments clés de la colle sécrété par la moule à ancrer aux surfaces. Nous trouvons que la cellule-Tak fonctionne le mieux avec PBMC.
    2. Ajouter 100 μL de la solution de colle diluée dans chaque puits et incuber pendant au moins 20 min à température ambiante. Laver trois fois avec l’eau distillée et de l’air sec.

3. mesure de la fonction mitochondriale

  1. Préparation de milieux d’essai (durée approximative : 10 min).
    NOTE : Les médias de test doivent être fraîchement préparées le jour de l’expérience.
    1. Ajouter L-glutamine, pyruvate et le glucose à la base des médias (les mêmes composants comme le moyen de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM), mais sans bicarbonate de sodium, glucose, glutamine ou pyruvate de sodium) pour faire des médias de dosage. Réchauffer les médias à 37 ° C, puis ajuster le pH à 7,4.
      Remarque : Les Concentrations de glucose, L-glutamine et pyruvate sont généralement les mêmes que les concentrations dans les milieux de croissance normale, mais peuvent être réglées selon le test.
  2. Préparer le test de Stress de Mito PBMC (durée approximative : 2 h).
    1. Dans chaque puits pour atteindre 80-90 % confluence des tôles assez PBMC de l’étape 2. Dans notre expérience, 1. 5 x 105 cellules/puits ont donné les résultats les plus cohérents.
      Remarque : Les puits A et H sont puits de fond et ne doivent contenir que médias de dosage avec aucune cellule. Dans le puits B à G, nous vous recommandons de placage au moins 3-6 puits par échantillon du patient afin de tenir compte des valeurs aberrantes.
    2. Tournez en plaques bas à 200 x g pendant 2 min permettre aux cellules d’adhérer au fond des puits. Laver les cellules une fois avec les médias de dosage. Cette étape supprime sérum et bicarbonate de sodium de milieux de croissance.
      Remarque : D’après notre expérience, l’étape de lavage supprime généralement 20 à 30 % des cellules.
    3. Ajouter des éléments multimédias de dosage 180 μl dans chaque puits, y compris l’arrière-plan puits A et H. Incuber dans un incubateur à 37 ° C non-CO2 pendant 45-60 min.
  3. Exécutez le Test de Stress de Mito
    1. Reconstituer les drogues dans le Kit de Stress Mito avec les médias de dosage comme suit :
      1. L’oligomycine : Ajouter des éléments multimédias de dosage μL 252 dans la fiole pour générer une solution stock à 50 μM.
      2. FCCP : Ajouter 288 μL de médias d’essai dans la fiole pour générer une solution stock à 50 μM.
      3. Antimycine A / roténone : 216 ajouter μL de médias d’essai dans la fiole pour générer une solution mère à 25 μM.
    2. Médicaments de Vortex reconstituée pendant environ 1 minute. Diluer dans des solutions de travail.
      Remarque : Les Concentrations des solutions de travail devraient être titrées et déterminées à l’avance avant l’expérience selon le type de cellule. Pour PBMC, nous trouvons que 1 μM de l’oligomycine, 1 μM FCCP et 0,5 μM l’antimycine A / roténone fonctionnent le mieux.
    3. Pipetter les médicaments dans chaque port de la cartouche de la sonde dans l’ordre :
      1. A: port Pipette 20 μL de 10 μM l’oligomycine, pour une concentration finale dans chaque puits de 1 μM.
      2. Port b : Pipette 22 μL de 10 μM FCCP, pour une concentration finale dans chaque puits de 1 μM.
      3. C: port Pipette 25 μL de 5 μM l’antimycine A / roténone pour une concentration finale dans chaque puits de 0.5 μM.
  4. Sélectionnez « Mito Stress Test » sur un instrument de flux extracellulaire. Suivre la ligne de l’instrument et insérer la cartouche de capteur. L’appareil effectue automatiquement le calibrage de la sonde. Insérer la plaque cellulaire après que calibrage de la sonde et l’instrument finira le reste de l’essai. Dynamique de l’oxygène est mesurée à 530 nm (excitation) / 650nm (émission), et concentration de protons est évaluée à 470 nm (excitation) / 530 nm (émission).

4. normalisation de la fonction mitochondriale données

  1. Préparer la solution d’analyse de prolifération de cellules (durée approximative : 5 min).
    1. Ajouter 48 tache d’acide nucléique μL (x 500) et suppresseur de fond 240 μL à 11,7 mL PBS (x 2). La tache de l’acide nucléique est un colorant de liaison à l’ADN cellulaire perméable, et l’éliminateur de fond est un colorant de masquage qui bloque les cellules mortes ou des cellules avec intégrité compromise membrane cellulaire d’être taché. La combinaison de la teinture de liaison à l’ADN et l’éliminateur de fond assure que des cellules vivantes seulement sont colorées.
    2. Ajouter un volume égal de 2 x solution de travail (180 μL) directement dans le milieu de chaque puits après que le Test de Stress de Mito a terminé.
  2. Incuber les cellules en présence de la solution de dosage prolifération cellulaire dans un incubateur à 37 ° C pendant 45-60 min. quantifier le nombre de cellules vivantes (fluorescent) sur un lecteur de plaque à 508 nm (excitation) / 527 nm (émission) et normaliser les données OCR (durée approximative : 10 min) .
    Remarque : outre les numéros cellules vivantes, utilisateurs peuvent également choisir normaliser leurs données avec le nombre total de cellules, de la quantité d’acides nucléiques, les concentrations de protéine, etc..

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Résultats

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Mito Stress Test repose sur la mesure des taux de consommation d’oxygène (OCR) après injection séquentielle de divers inhibiteurs respiratoires pour mapper un profil mitochondrial complet. Mesures de l’OCR après chaque injection de drogue peut être utilisée pour calculer les paramètres suivants liés à la santé mitochondriale : OCR basale est d’abord mesuré avant toute injection de drogues afin d’évaluer la consommation d’oxygène nécessaire pour satisfaire la demande d’ATP...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fatigue chez les patients atteints de cancer est une maladie débilitante qui n’est pas bien défini ou caractérisé1. Diagnostic de fatigue repose entièrement sur la déclaration subjective et il n’y a aucune norme actuelle de diagnostic ou traitement pour cette condition, en grande partie dû au manque de compréhension de sa pathologie2. Des mécanismes proposés qui sous-tendent la fatigue chez les patients cancéreux, altération de la fonction mitochondriale est l’une des voies...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude est entièrement pris en charge par la Division de la recherche intra-muros de la National Institute of Nursing Research des NIH, Bethesda, Maryland.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de préparation de cellules mononucléées CPT  ;BD Biosciences362761Pour l’isolement des PBMC après une phlébotomie
RPMI-1640  ;Corning10-040Pour la fabrication de milieux de croissance pour PBMC
Sérum de veau fœtal (FBS)Corning35-010-CVPour la fabrication de milieux de croissance pour PBMC
Pénicilline/StreptomycineThermoFisher15140122Pour la fabrication de milieux de croissance pour PBMC
Cell-TakCorning354240Solution adhésive pour cellules et tissus ; permet aux cellules en suspension d’adhérer à la surface
Seahorse XF Calibrant SolutionAgilent103059-000Pour l’hydratation des cartouches
XFp Fluxpak (miniplaques et cartouches de capteur)Agilent103022-100Contient des mini-plaques de culture cellulaire XFp et des cartouches de capteur Milieu
de base XFAgilent103335-100Pour la fabrication de milieux de dosage XF
45 % culture cellulaire D-(+)-Glucose solutionCorning25-037-CIPour la fabrication de XF milieu de dosage
Pyruvate de sodium solutionCorning  ;25-000-CIPour la fabrication d’un milieu de test XF
L-glutamineThermoFisher25030081Pour la fabrication de milieux de test XF
Seahorse XFp Mito Stress Test KitAgilent103010-100Contient de l’oligomycine, du FCCP, de l’antimycine A/rotenone
CyQUANT Essai de prolifération cellulaire directeThermoFisherC35011Pour la quantification de cellules vivantes et la
normalisation des donnéesAnalyseur Seahorse XFpAgilentS7802AEAPour mesurer la fonction mitochondriale dans les cellules vivantes
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (ou tout instrument capable de quantifier les cellules fluorescentes dans une plaque)BioTekBTCYT5PVPour la quantification des cellules vivantes et la normalisation des données
Solution de

Références

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Mots-clés

Mitochondrial FunctionCancer FatiguePBMC IsolationExtracellular FluxMito Stress TestSpare Respiratory CapacityBasal RespirationOligomycin FCCPAntimycin RotenoneCell Proliferation Assay

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