Nous présentons ici un protocole pour effectuer un simple fractionnement cellulaire pour la séparation subcellulaire des protéines cytoplasmiques et nucléaires dans des biopsies intestinales humaines fraîches ou congelées.
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Article de méthode
Fractionnement subcellulaire de spécimens gastro-intestinal fraîches ou congelées
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le but du présent protocole est de fractionner le tissu intestinal humain obtenu par endoscopie en compartiments nucléaires et cytoplasmiques pour l’analyse de la localisation des protéines spécifiques ou complexes de protéines dans les États de différents tissus (c'est-à-dire, en bonne santé contre la maladie). Cette méthode est utile pour le fractionnement des deux échantillons de tissu intestinal frais et surgelés ; Il est facilement accessible pour tous les laboratoires et pas beaucoup de temps.
Introduction
Les protéines participent à presque toutes les fonctions biologiques dans une cellule et toute variation dans leur structure, la quantité ou la localisation peut conduire à un scénario de pathogène. Méthodes de fractionnement des échantillons tissulaires sont une approche utile pour réduire la complexité des maladies liées à des analyses de protéines. Certaines études utilisent des informations de localisation de protéine ou enrichissent une protéine d’un compartiment cellulaire spécifique, un protocole pour le fractionnement des protéines intactes reproductible est donc utile de répondre à certaines questions biologiques. Déterminer la localisation sous-cellulaire de....
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Protocole
Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de Cruces University Hospital et analyses ont été effectuées après que le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets ou leurs parents.
1. biopsie Collection
Remarque : Les spécimens de biopsie du duodénum distal des patients sont obtenues au cours de l’endoscopie diagnostic systématique gérer les biopsies qui vont entre 2 et 10 mg de poids. Tissu biopsié est un tissu complex composé de différents types de cellules dont les cellules épithéliales, immunitaires et endothéliales. Gastroentérologie clinique effectuer l’endoscopie qui suit établit des lignes d....
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Résultats
La figure 1 montre une coloration de l’hématoxyline éosine d’une section de biopsie intestinale avec villosités intactes et les structures de la crypte.
Les résultats représentatifs du fractionnement nucléaire et cytoplasmique utilisant ce protocole sont indiquées dans les Figures 2 et 3. Dans l’expérience illustré à la Figure 2, une no.......
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Discussion
Le protocole décrit ici est utilisé pour le fractionnement nucléaire et cytoplasmique des biopsies de l’intestin. Les protéines purifiées sont non dénaturés et peut être utilisés non seulement dans l’analyse par western blot comme montré dans la Figure 2 et 3 , mais aussi dans les essais nécessitant des protéines pliées natif comme immunoprécipitation, analyse de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) ou électrophorèse en natif sur gel de polyacrylamide (PAGE).
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Auteurs reconnaissent l’aide de Ander Lopez et Miren Telletxea pour l’enregistrement et le montage vidéo. ACR est financé par une bourse de Ikerbasque et un projet de recherche de Asociación de Celiacos Madrid (ACM). JRB est financé par le projet ISCIII-PI16/00258 et cofinancé par l’Union européenne FEDER/FSE « Un moyen de faire de l’Europe ». EST financé par une subvention de projet de recherche 2015111068 du département Basque de la santé. GRI et AJM sont pris en charge par des subventions de bourse prédoctorale de l’UPV/EHU et le ministère de l’éducation de Basque, respectivement.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Inhibiteurs de la protéinase et de la phosphatase | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 ; | Sigma Aldrich | CA-630 | Détergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Kit de quantification des protéines |
| Pilons en plastique jetables | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Homogénéisateur Dounce | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifugeuse | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
Références
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and ....
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Réimpressions et autorisations
