Nous présentons ici un protocole visant à confirmer la présence de mutation ponctuelle pour le diagnostic d’amylose héréditaire transthyrétine, Ala97Ser, la mutation la plus courante endémique à Taïwan, en prenant comme exemple.
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Article de méthode
Analyse génétique héréditaire Transthyretin Ala97Ser associés amylose
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les tests génétiques sont le test plus fiable pour la transthyrétine héréditaire associés amylose et doit être effectué dans la plupart des cas d’amylose transthyrétine (ATTR). ATTR est une maladie rare mais fatale avec des phénotypes hétérogènes ; par conséquent, le diagnostic est parfois retardé. Avec l’attention et la reconnaissance plus large sur les manifestations précoces d’ATTR ainsi que de nouveaux traitements, études diagnostiques appropriées, y compris la transthyrétine (TTR) génétique tester, pour confirmer les types et variantes de ATTR sont donc fondamentaux pour améliorer le pronostic. Des analyses génétiques avec des méthodes polymerase chain reaction (PCR) confirment la présence de mutations ponctuelles TTR beaucoup plus rapidement et plus sûr que les méthodes conventionnelles telles que la tache méridionale. Ici, nous démontrons confirmation génétique de la mutation Ala97Ser ATTR, la mutation la plus courante endémique à Taïwan. Le protocole comprend quatre grandes étapes : collecte des échantillons de sang total, extraction de l’ADN, l’analyse génétique de tous les quatre exons TTR avec PCR et séquençage de l’ADN.
Introduction
Amylose (ATTR) de la transthyrétine (TTR) est la forme la plus courante d’amylose systémique héréditaire1et peut être causée par une mutation autosomique dominante héritée dans le gène de la transthyrétine (TTR)2. Les mutations de TTR déstabilisent la structure de la protéine tétramère et conduisent à sa dissociation en monomères qui réassemble en fibrilles amyloïdes2. Plus de 100 mutations de TTR amyloïdogène ont été signalés dans le monde1. Les analyses génétiques avec des méthodes polymerase chain reaction (PCR) confirment la présence de mutation ponctuelle TTR et ont des avantages, notamment en évitant la manipulation de la sonde radioactivement marqués par rapport à la tache méridionale3. PCR est une technique rapide, facile, bon marchée et fiable qui a été appliquée à nombreux domaines dans les sciences modernes,4.
Le diagnostic précoce de cette maladie progressive et mortelle est un défi compte tenu de son hétérogénéité phénotypique. Avec l’attention et la reconnaissance plus large sur les manifestations précoces de ATTR ainsi que les nouveaux traitements5, études diagnostiques appropriées y compris test génétique TTR sont donc critique fondamentales pour améliorer le pronostic. En outre, différentes mutations sont associées à différente pénétrance de ce trait, l’âge d’apparition, modes de progression, gravité de la maladie, la survie médiane, l’efficacité de la transplantation hépatique, ou TTR stabilisateurs2,6, et degrés variables de participation neurologique et cardiologique, ayant des répercussions sur grandes conseil génétique7,8,9. En outre, un test génétique très précis est le seul outil qui différencie les deux types distincts de ATTR : héréditaire (mutant) et type sauvage (forme non-mutant, amylose systémique sénile, SSA)7. Il est impératif de confirmer les types d’ATTR, parce que les traitements varient largement2. Il y a donc une nécessité croissante pour décrire le protocole par étapes des tests génétiques TTR.
L’approche moléculaire pour détecter la mutation sera illustrée à l’aide de Ala97Ser, la mutation la plus courante endémique à Taïwan, à titre d’exemple. Modifications dans l’étape d’extraction de l’ADN réduire le montant des trois solutions utilisées et donne une quantité suffisante d’ADN. Dans ce protocole, tous les quatre exons TTR ont été analysés, tandis que les régions y compris les 5' en amont, 3' en aval, promoteurs, introns, et régions non traduites (UTR) n’étaient pas séquencées.
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Protocole
Les tests effectués en laboratoire a été réalisée conformément aux exigences de la clinique laboratoire amélioration amendements (CLIA) de 1988, le règlement approuvé par le Conseil institutionnel d’examen de Chang Gung Memorial Hospital et Université (licence n° 100 - 4470A3 et 2462A3-104). Le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients.
1. prélèvement d’échantillons de sang
- Collecter le sang dans des tubes de traitées à l’EDTA disponibles dans le commerce. Mélanger doucement et stocker l’échantillon de sang à 4 ° C jusqu’au traitement.
2. ADN Extraction du sang périphérique
Utiliser un Kit d’Extraction d’ADN pour l’extraction d’ADN génomique (voir Table des matières).
- Ajouter 10 mL de Solution 1 pour l’échantillon de sang de 4,0 mL. Incuber l’échantillon sur la glace pendant 10 min.
- Centrifuger l’échantillon à 2 000 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer et jeter le surnageant avec soin. Resuspendre le culot dans 3 mL de Solution 1.
- Centrifuger l’échantillon à 2 000 x g pendant 5 min à 4 ° C à nouveau et jeter le surnageant. Resuspendre le culot dans 3 mL de Solution 2.
- Ajouter 10 µL de solution mère de la pronase (225 mg/mL) jusqu'à obtenir une concentration finale de 100 µg/mL et bien mélanger. Incuber à 37 ° C pendant la nuit.
- Refroidir le tube sur la glace pendant 10 min. Ajouter 0,8 mL de la Solution 3 à l’échantillon et inverser les 3 - 5 fois. Placer l’échantillon sur la glace pendant 5 min.
- Centrifuger l’échantillon à 3 000 g pendant 15 min à 4 ° C. Transvaser avec soin le surnageant dans un tube à centrifuger conique stérile 15 mL.
- Ajouter 6 µL de solution mère de RNase (10 mg/mL) jusqu'à obtenir une concentration finale de 20 µg/mL. Incuber à 37 ° C pendant 15 min.
- Ajouter 2,5 mL d’alcool isopropylique et mélanger soigneusement en retournant doucement plusieurs fois à précipiter l’ADN (brins de matière blanche, floculant seront incluse). À l’aide d’une pipette de gros calibre, transférer le précipitant de l’ADN dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 mL.
- Centrifuger à 12 000 x g pendant 3 min à 4 ° C. Jeter le liquide surnageant avec soin. Granule d’ADN laver en ajoutant 500 µL d’éthanol 70 %.
- Centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min et jeter le surnageant. Sécher à l’air granule d’ADN à température ambiante. Ajouter 100 µL de ddH2O et incuber à 65 ° C pendant 15 min remettre en suspension l’ADN.
3. Quantification de l’ADN génomique
Utiliser un spectrophotomètre (voir Table des matières) pour détecter la quantité et la qualité de l’ADN génomique.
- Connectez-vous à l’ordinateur relié à la machine du spectrophotomètre. Ouvrez le logiciel.
- Initialiser la machine du spectrophotomètre :
- Cliquez sur « Acide nucléique » sur le logiciel du spectrophotomètre.
- Nettoyer le socle avec un chiffon de papier jetables et eau purifiée.
- Vierges du spectrophotomètre :
- Charger 2 µL d’eau purifiée sur le piédestal.
- Abaissez le bras supérieur du spectrophotomètre et cliquez sur « En blanc » pour étalonner.
- Quand c’est fait, soulevez le bras supérieur et sécher le piédestal avec une lingette.
- Mesurer l’échantillon :
- Cliquez sur « ADN-50 » sur le Type d’échantillon.
- Charger 2 µL de l’échantillon d’ADN sur le piédestal.
- Abaissez le bras supérieur, puis cliquez sur « Mesure » pour mesurer le ratio A260/A280 et la concentration de l’échantillon.
- Nettoyer le socle entre chaque série avec une lingette et eau purifiée.
- Cliquez sur « Print Screen » pour collecter les données.
4. génétique analyse des mutations
Amplifier l’ADN de cible avec le PCR4. Effectuer des PCR dans une réaction de 25 µL mélange en utilisant une ADN polymérase nécessaire (voir la Table des matières). Le tableau 1 montre le gène TTR intronic amorces.
| gène | Séquence d’amorce |
| Exon1 | F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' R : 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3' |
| Exon2 | F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' R : 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3' |
| Exon3 | F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' R : 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3' |
| Exon4 | F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' R : 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3' |
Tableau 1. Amorces intronic de gène TTR. (Séquence de référence NCBI : NC_000018.10)
- Ajouter les réactifs dans le tableau 2 dans un tube PCR de 0,2 mL.
| Composants | Volume (µL) | Concentration finale |
| 10 x tampon | 2.5 | 1 x |
| MgCl2 (25 mM) | 1.5 | 1,5 mM |
| 360 GC Enhancer | 1 | - |
| 360 l’ADN polymérase | 0,2 | 2 U/réaction |
| dNTP Mix (25 mM) | 2 | 2 mM chaque |
| Apprêt F (10 µM) | 1 | 0,4 ΜM |
| Primer R (10 µM) | 1 | 0,4 ΜM |
| ADN (100 ng) | 2 | |
| Eau de PCR-qualité | 13,8 | - |
| Volume total | 25 | - |
Le tableau 2. Conditions de réaction PCR.
- Mélanger doucement et centrifuger brièvement sur une centrifugeuse de paillasse pour recueillir tous les éléments au fond du tube. Placer le tube dans un thermocycleur.
- Effectuer PCR de 30 cycles. Chaque cycle se compose d’une étape de dénaturation pendant 30 s à 94 ° C, amorce un recuit pour 30 s à 58 ° C et l’extension de la polymérase pour 45 s à 72 ° C (voir tableau 3).
| Étape | Température (° C) | Temps | cycle |
| Dénaturation initiale | 95 | 5 min | 1 |
| Étape de dénaturation de l’ADN | 94 | 30 s | 30 cycles |
| Étape de recuit apprêt | 58 | 30 s | 30 cycles |
| Étape de polymérisation en extension | 72 | 45 s | 30 cycles |
| Étape d’élongation post | 72 | 10 min | 1 |
| Fin du PCR cyclisme | 4 | Indéfinie |
Tableau 3. Conditions de cyclisme pour amplifier des produits PCR.
- Valider le produit PCR en visualisant avec électrophorèse :
- Préparer un gel d’agarose à 1.2 % :
- Mélanger 1,2 g de poudre d’agarose avec 100 mL de 0,5 x TBE dans une fiole pour four à micro-ondes. Four à micro-ondes pendant 2 min jusqu'à dissolution complète de l’agarose. Refroidir le mélange de gel d’agarose à 55 ° C.
- Ajouter 2 µL d’une solution de bromure d’éthidium (10 mg/mL) au mélange d’agarose et mélanger doucement. Versez le mélange de gel d’agarose dans un bac en gel d’environ 5-7 mm, puis ajouter la comb(s) en place. Laisser solidifier (au moins 30 min) et retirer soigneusement comb(s).
- Charger des échantillons et exécuter un gel d’agarose :
- Placer le gel et le plateau dans la cellule de l’électrophorèse. Remplir la cellule électrophorèse avec 0,5 x TBE jusqu'à ce que le gel est couvert.
- Soigneusement charger 2 µL d’un ADN bp 100 ladder (voir Table des matières) dans le seule voie du gel comme marqueur de poids moléculaire. Mélange de colorant/témoin charge (5 µL de la gamme de produits PCR avec 1 µL 6 x chargement colorant) dans les voies additionnelles.
- Allumez l’alimentation. Exécutez le gel pendant 25 min à 100 V.
- Retirer le gel de la cellule de l’électrophorèse. Visualiser les fragments d’ADN sous ultraviolets dans un système d’imagerie.
- Préparer un gel d’agarose à 1.2 % :
5. séquençage de l’ADN
- Purifier les produits PCR à l’aide d’une trousse commerciale et séquencer dans le commerce ou avec un séquenceur automatique (voir Table des matières).
- Présenter des séquences de nucléotides dans le serveur de NCBI BLAST pour comparer la requête nucléotidique au nucléotide bases10. Une fois les résultats affichés, effectuer des alignements de séquences et d’identifier la mutation attendue.
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Résultats
Gel d’agarose de deux patients et une saine des bandes individuelles ont révélé des montants attendus, y compris un produit PCR bp 454 de l’exon 4 du gène TTR (Figure 1).
Figure 1 . Électrophorèse sur gel, dépeignant la PCR amplifiés gène TTR. Normal : un individu sain. ...
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Discussion
Il y a deux étapes cruciales au sein du protocole. Tout d’abord, afin d’avoir un nombre suffisant de globules blancs, un spécimen de hémodilué devrait être évité11. Deuxièmement, l’utilisation des amorces PCR appropriées est fondamentale pour obtenir des résultats fiables,12. Nous avons utilisé l’outil web de Primer-BLAST pour concevoir les amorces4,13; un minimum de 40 paires de bases sur chaque côté des exons TTR ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous tenons à remercier Miss Fun-Shin Wu pour son aide dans les expériences. Cette étude a été financée par une subvention du programme de recherche médicale Chang Gung (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) et IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tubes traités à l’EDTA | Kit | ||
| Spectrophotomètre Stratagen | 200600 | ||
| NanoDrop ND2000 ; | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic amorces ; | Exon1 | F : 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' | |
| Exon1 | R : 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3' | ||
| Exon2 | F : 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' | ||
| Exon2 | R : 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3' | ||
| Exon3 | F : 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' | ||
| Exon3 | R : 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3' | ||
| Exon4 | F : 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' | ||
| Exon4 | R : 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3' | ||
| thermocycleur | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| cellule d’électrophorèse ; | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| Échelle à ADN | Protech | PT-M1-100 | |
| colorant | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| séquenceur automatique ; | Analyseur | d’ADN Applied Biosystems 3730xl |
Références
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Réimpressions et autorisations
