Article de méthode

Mesurer les niveaux de l’exercice chez Drosophila melanogaster en utilisant le système tournant de Quantification à l’exercice (REQS)

DOI :

10.3791/57751

⸱

27 mai 2018

 , 
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le système des Quantification d’exercer tournant (REQS) peut induire l’exercice chez Drosophila melanogaster par rotation tout en mesurant simultanément le montant de l’activité exercée par les animaux. Nous présentons ici un protocole point par point, détaillant comment mesurer les niveaux d’activité des animaux touchés par les traitements d’exercice rotation à l’aide de la REQS.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster est un nouvel organisme modèle pour des études en biologie de l’exercice. À ce jour, deux systèmes d’exercice principal, la tour de la puissance et la médiévale ont été décrits. Toutefois, une méthode pour mesurer la quantité d’activité animale supplémentaire induite par le traitement de l’exercice a fait défaut. Le système des Quantification d’exercer tournant (REQS) répond à ce besoin, fournir une mesure de l’activité animale pour les animaux touchés par exercice de rotation. Ce protocole décrit comment utiliser le REQS pour évaluer l’activité animale au cours de l’exercice de rotation et illustre le type de données qui peuvent être générés. Ici, nous montrons comment la REQS sert à mesurer des différences de sexe et souche exercice induit par l’activité. Le REQS permet également d’évaluer l’impact de divers autres paramètres expérimentaux tels que taille âge, alimentation ou la population sur l’activité de l’exercice induit. En outre, il peut être utilisé pour comparer l’efficacité d’exercice différents protocoles de formation. Ce qui est important, il permet de normaliser les traitements d’exercice entre les souches, ce qui permet au chercheur de réaliser une quantité égale d’activité entre les groupes si nécessaire. Ainsi, le REQS est une nouvelle ressource notable pour les biologistes d’exercice travaillant avec le système de modèle drosophile et vient compléter les systèmes existants d’exercice.

Introduction

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Récemment, les chercheurs ont commencé à utiliser la drosophile Drosophila melanogaster pour étudier la biologie de l’exercice. D. melanogaster a été un système modèle génétique pour plus de 100 ans1,2. Cependant, recherche de drosophile a contribué à la génétique non seulement, mais aussi à une variété d’autres disciplines, notamment la neurobiologie, biologie comportementale et physiologie3. En 2009, la tour de la puissance, la première machine d’exercice pour la drosophile a été décrit4. La tour de pouvoir profite de réponse géotaxie négative des animaux. Lorsqu’elles sont dérangées, drosophile ont tendance à se déplacer vers le haut de leur enclos. Cette réponse est bien établie et constitue la base du test populaire « RING » (géotaxie négative itératif rapide5) qui est utilisée pour estimer la capacité s’élevante et/ou conditionnement physique chez la drosophile. La tour de puissance utilise un bras mécanique relié à un bloc moteur de lever à plusieurs reprises un ensemble d’animaux dans leurs enclos de plusieurs pouces et en les déposant retour au sol pour induire la réponse géotaxie négative (Tinkerhess et coll. 20126 fournir une vidéo illustrant l’utilisation de la tour de puissance). Un traitement prolongé sur le tour de la puissance augmente donc la quantité d’activité physique (courir ou voler) les animaux effectuent par rapport aux animaux témoins non traités et au fil du temps conduit à une performance améliorée dans l’essai de l’anneau pour conditionnement physique4. Ainsi, ce travail a démontré la faisabilité d’utiliser la drosophile comme modèle pour la biologie de l’exercice.

Afin d’élargir le répertoire des outils disponibles pour la recherche exercice Drosophila, en 2016, Mendez et ses collègues ont décrit un deuxième appareil d’exercice de drosophile, la médiévale7. Semblable à la tour de la puissance, la médiévale exploite la réponse géotaxie négative de la drosophile. Cependant, cette réponse est induite par la rotation continue de l’enclos, plutôt qu’en soulevant et en les déposant dans la tour de puissance. Cette méthode d’induction est plus douce et prévoit un régime d’exercice orienté endurance plus qui évite tout trauma physique pouvant survenir au cours de l’exercice dans la tour de puissance (voir Katzenberger, R. J. al 20138 pour l’impact de la reprise physique traumatisme sur la santé de la drosophile). Similaire à la tour de puissance4, exercice traitement des animaux sur la médiévale mène à une variété de réactions physiologiques, y compris les changements dans la condition physique, le taux de triglycérides et corps poids7. Ainsi, deux méthodes complémentaires sont disponibles pour les biologistes de Drosophila étudier l’exercice.

Une des limites de la tour de la puissance et la médiévale sont l’incapacité de mesurer la quantité d’activité induite par le traitement de l’exercice. Analyse des enregistrements vidéo tirée de la médiévale a démontré qu’il y a des différences significatives entre les différentes souches de Drosophila dans comment elles réagissent au traitement exercice7. Plus précisément, les souches étudiées diffèrent dans combien l’activité supplémentaire que les animaux effectuées lorsque stimulée7. Cette observation nous a amenés à développer un troisième système d’exercice, la rotation exercer Quantification système (REQS), qui permet de mesurer les niveaux d’activité animale au cours de la rotation induite par l’exercice9. Le REQS utilise une activité disponible dans le commerce, unité qui est installée sur un bras rotatif pour stimuler l’exercice par le biais de rotation comme dans la médiévale de contrôle. Premiers travaux avec la REQS confirme que génétiquement différentes souches de Drosophila — et sexes - peuvent avoir des significativement différentes réponses à la stimulation de rotation et donc la quantité d’exercice induit n’est pas identique entre les différents génotypes9 . Ainsi, le REQS permet désormais aux biologistes de la drosophile mesurer la quantité d’exercice induite par le traitement, ouvrant une variété de nouvelles voies de recherche dans le domaine de l’exercice.

Ici, nous décrivons en détail comment utiliser les demandes pour la quantification de l’exercice de rotation. Le REQS induit une rotation exercice et mesures simultanément les niveaux d’activité des animaux traités. Le REQS est en mesure d’accueillir une variété de programmes d’exercices, allant de la simple 2 h régime d’exercice continu a démontré ici à des méthodes de formation intervalle plus complexes tel que décrit par Mendez et collègues7et la stimulation peut être réglée via Vitesse de rotation (entre environ 1-13 rotations / min). Selon l’unité de surveillance de l’activité, utilisée pour produire la REQS, cette méthode est adaptable à l’analyse des mouches unique ou de grandes populations d’animaux. En raison de cette polyvalence, le REQS fournit aux chercheurs de drosophile avec un éventail de possibilités d’étudier, par exemple, exercice différents régimes, régime des interventions ou impact de la densité de population.

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Protocole

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Les demandes se compose d’une drosophile Activity Monitor (pour plus d’informations de la source, voir Table des matières) monté sur un bras rotatif qui est commandé par une unité motrice (Figure 1). Le moniteur d’activité détermine combien de fois dans un laps de temps donné le tableau des faisceaux lasers au milieu du tube essai de dissection est perturbé. Pour des dessins détaillés et une caractérisation approfondie, voir notre précédente publication9. Alors que notre système utilise l’unité de LAM25H, les demandes peuvent être modifiés pour tenir compte des autres unités de Drosophila Activity Monitor ainsi.

1. vérification de la configuration de la REQS

  1. Test de charge vole en tubes de verre spécimen par anesthésier les animaux avec CO2 ou autre méthode choisie pour la manutention, en les déplaçant dans les tubes vides et bouchage des tubes.
  2. Tubes de spécimen de verre Insert plafonné dans les fentes de l’unité de surveillance de l’activité. Fixez les tubes à l’aide de caoutchouc joints toriques (17-18 gauge) ou des bandes de caoutchouc sur les deux côtés de l’appareil pour s’assurer que les tubes ne bougent pas pendant la rotation :
    1. Glisser un joint torique sur le tube d’échantillon et positionner le joint torique à proximité du milieu du tube. Insérez le tube d’échantillon dans une fente du moniteur d’activité de l’avant et la centrer.
    2. Déplacer le joint torique au besoin et faire en sorte que, une fois que le tube d’échantillon est centré, le joint torique est glissé au plus près de l’unité de surveillance de l’activité que possible. Fixer le tube d’échantillon en glissant un deuxième o-ring sur le tube de verre à l’arrière, encore une fois passer le joint torique au plus près de l’unité de surveillance de l’activité possible.
  3. Ouvrir la rotation de la REQS en basculant l’interrupteur d’alimentation sur le devant de l’appareil. Ajuster la vitesse de rotation avec le cadran sur le devant de l’appareil à la vitesse désirée (4 rpm (rotations par minute) dans cet exemple).
    Remarque : Dans cet exemple, la vitesse de rotation a été choisie pour correspondre à une étude précédemment publiée7. Car les vitesses de rotation différentes seront traduira par des niveaux d’activité animaux différents, lors de l’initialisation d’une nouvelle étude, optimisation de la vitesse de rotation pour le montage expérimental spécifique (génotype, longueur du bout de l’exercice, etc.) peut être nécessaire.
    Remarque : Il est important de s’assurer que les tubes sont bien positionnés afin qu’ils ne trainent pas au bas de l’unité REQS pendant la rotation.
  4. Tester la connexion pour le système de collecte de données fourni avec l’appareil de Drosophila Activity Monitor en ouvrant le logiciel de DAMSystem308 et de veiller à ce que le voyant de connexion reste vert pour plusieurs rotations. Le logiciel commencera enregistrer des données dans un fichier texte « monitorX » (X étant le numéro d’unité si plusieurs écrans sont utilisés) immédiatement lors de l’initiation. Fréquence d’enregistrement réglable dans l’onglet « Préférences » ; en général, nous enregistrons dans des intervalles de 5 min.
  5. Examinez le fichier texte généré par le logiciel de DAMSystem308 pour s’assurer que la connexion de données fonctionne correctement. Problèmes avec la connexion résultent en découpes, moments où est enregistré l’activité 0 pour tous les postes dans les demandes (voir Résultats représentant et tableau 2). En cas de coupes-circuit, ajuster les connexions de données conduisant à la prise téléphonique rotatif, comme pendant la rotation, cette connexion peut se détacher ou tordu. Nous trouvons que stabiliser la connexion avec du ruban adhésif permet d’éviter ce problème.

2. préparation des animaux

Remarque : Tous les animaux ont été élevés et testés dans des conditions normales dans un incubateur (25 ° C, 60-70 % d’humidité, cycle lumière/obscurité de 12 h) sur la semoule de maïs/mélasse media10.

  1. Deux semaines avant l’expérience prévue, mis en place les flacons avec la densité des animaux est contrôlée pour recueillir les mouches expérimentales Nous avons créé généralement flacons avec 7 mâles et 10 femelles. Avec un stock sain, d’un seul flacon, environ 15 vierges mâles et 15 femelles peuvent être collectées sur une période de 4 jours. Ajuster le nombre de flacons mis en place selon le nombre d’animaux nécessaires pour le dosage ; un essai typique dans notre laboratoire comprend 10 séries de 10 vierges mâles et femelles par génotype (100 hommes et 100 femmes).
    Remarque : Non vierges mouches peuvent être utilisés selon la question expérimentale spécifique. Si la réalisation d’expériences à long terme avec des animaux non vierges, larves rampants peuvent interférer avec l’activité exacte surveillance.
  2. Enlever les mouches parent une semaine après avoir configuré les flacons.
  3. Commençant au jour 10 après avoir configuré les flacons, recueillir des mouches vierges depuis les flacons et les stocker séparés par sexe.
  4. Recueillir des animaux suffisamment pour l’expérience et l’âge comme nécessaire, 3 jours dans cet exemple.
    Remarque : Nous anesthésier généralement les animaux avec le CO2 pour la manutention. CO2 est connu à l’impact des niveaux d’activité animale pendant de longues périodes de temps après le traitement (par exemple, voir Bartholomew et coll. 201511). Si l’effet de2 CO interfère avec les analyses ou essais en aval prévues, utilisez une méthode d’anesthésie différents comme anesthetization de glace.

3. collecte des données avec le REQS

  1. Anesthésier les animaux destinés à être utilisés pour l’étude de quantification d’exercice avec CO2 ou une autre méthode d’anesthésie. Diviser en groupes selon les besoins et les groupes d’animaux de charge dans les tubes de verre vide de l’activity monitor ; dans cet exemple, 10 animaux du même âge est chargés par le tube en verre, avec 10 répétitions pour chaque type d’animal (sexe/génotype). Assurez-vous de noter quel type d’animal est chargé dans chaque tube.
    Remarque : Pour des plus longues expériences, alimentaire peut être inclus dans les tubes de prélèvement. Dans ce cas, il est essentiel que l’aliment est sûr et ne pas se déplacer pendant la rotation.
  2. Charger les tubes de dosage de verre dans l’unité REQS et bloquez-les avec le caoutchouc des joints toriques. Si vous travaillez avec plus d’un sexe/génotype, utilisant un blocs aléatoires ou la randomisation de la position des animaux dans le REQS permettra d’éliminer les effets possibles de la position. Randomisation est possible en assignant à chaque flacon un nombre aléatoire, par exemple d’un Webmail générateur de nombres aléatoires (par exemple, https://www.randomizer.org/) ou dans une feuille de calcul et puis vous passez votre commande les flacons basées sur le nombre aléatoire.
  3. Placez le REQS dans l’incubateur pour garantir une température constante, l’humidité et lumière des conditions. S’assurer que les câbles d’alimentation et les données sont correctement connectés.
  4. Permettre aux animaux de récupérer de l’anesthésie et s’acclimater au nouvel environnement pendant 1 h.
  5. Commencer l’expérience en lançant la rotation de la demandes à la vitesse désirée.
    Remarque : Une autre option est d’abord rassembler des données d’activité de référence des animaux avant le début de la rotation, suivie d’enregistrer les niveaux d’activité en réponse à la stimulation de la rotation.
  6. Entreprendre la collecte de données en ouvrant le logiciel DAMsystem308 (ouvrant simplement la collecte de données de logiciels initiés). Les données sont écrites dans un fichier texte à l’intervalle défini (ici, 5 min) ; Si nécessaire, modifiez les paramètres dans l’onglet « Préférences » (Voir l’étape 1.4).
  7. Pour s’assurer que les données ont été transmises à l’ordinateur, ouvrez le fichier texte généré par le logiciel DAMsystem308 après qu’un ou deux intervalles de temps se sont écoulés et confirment que données sont écrits dans le fichier. Fermez et rouvrez ce fichier pour afficher des données provenant de n’importe quel points dans le temps additionnel. Recueillir des données pour la quantité désirée de temps ; dans cet exemple, 2 h.
    Remarque : Ne pas ouvrir l’incubateur pendant la période d’essai, car les animaux sont très sensibles à toute perturbation et répondront probablement par une activité accrue.
  8. À la fin de l’essai de l’exercice, mettre fin à la collecte de données en fermant le logiciel DAMsystem308, avant de s’éteindre la REQS. Retirer les animaux provenant des tubes de dosage de verre et nettoyer les tubes. Les animaux peuvent être déplacés retour dans les flacons de nourriture si répétée des mesures à des âges différents sont nécessaires.
    Remarque : En cas de décès pendant le régime d’exercice, elle doit être enregistrée, car la présence de mouches mortes peut avoir des répercussions comtes d’activité. Dans notre expérience avec le DGRP2 mouche lignes12,13, exercer à 4 tr/min pour les 2 h n’a entraîné aucun décès, mais des souches plus faibles pourraient réagir différemment.

4. analyse des données

  1. Ouvrir le fichier .txt étiqueté « Monitor1 » produites par le logiciel DAMSystem308.
  2. Inspecter le fichier de données pour tous les problèmes qui ont eu lieu lors de l’acquisition de données (moments manqués, etc.; Le tableau 1). Si nécessaire, censurer le fichier en supprimant les points de données au début et à la fin de l’enregistrement.
  3. En utilisant le logiciel statistique de votre choix (par exemple, R), d’analyser les données recueillies. Générer des statistiques descriptives et procéder à l’analyse de variance (ANOVA) pour étudier les effets tels que le sexe et le génotype, si les données sont normalement distribuées. Si les données ne sont pas normalement distribuées, utiliser des méthodes non paramétriques, tels que les tests de Kruskal-Wallis, pour comparer les groupes. Les analyses spécifiques requis dépendra de la question scientifique spécifique et le protocole expérimental.

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Résultats

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La sortie d’une course individuelle avec le REQS est une table de données produite par le logiciel DAMSystem308, qui sera intitulé « Monitor1.txt » par défaut (pour un exemple, consultez supplémentaire 1 fichier). Un extrait d’une telle table est indiqué dans le tableau 1. Chaque colonne contient les données d’un tube d’essai individuels, tandis que les lignes contiennent l’activité mesurée dans chaque intervalle de temps depuis le début de l’expérience (...

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Discussion

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Comme l’illustrent les résultats représentatifs, le REQS est capable de mesurer avec précision l’activité de l’exercice de drosophile. Le REQS est flexible et permet aux chercheurs de traiter une variété de questions de recherche liées à la biologie de l’exercice ou l’exercice des interventions. Il y a deux étapes cruciales dans le protocole à mettre en évidence. Tout d’abord, il est essentiel de tester la configuration de la demandes pour s’assurer que la transmission des données de la REQS pour le DAMSystem308 fonction...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Le travail a été soutenu par prix numéro P30DK056336 de l’Institut National de diabète et digestives et rénales maladies grâce à une bourse de pilote de la Nutrition et l’obésité Research Center à l’Université d’Alabama à Birmingham au RCN.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Moniteur d’activité de la drosophile  ;TrikineticsLAM25HREQS component
Telephone Cord DetanglerUvitaluv20170719REQS component
Bouchons de flacons (flugs)Genesee Scientific49-102Fournitures de culture de drosophile
Flacons  ;Genesee Scientific32-120Fournitures pour la culture de la drosophile
Filet pour la culture de la drosophileCarolina Biological Supply173090Fournitures pour la culture de la drosophile
Semoule de maïsPepsico43375Drosophila media
Mélasse GoldenBarrelBLA-GALDrosophila media
AgarApex Bioresearch66-103Drosophila media
Levure sèche inactiveGenesee Scientific62-106Drosophila media
TegoseptApex Bioresearch20-258Drosophila media
Acide propioniqueGenesee Scientific20-271Drosophila media

Références

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Mots-clés

Drosophila MelanogasterExercise QuantificationRotating Exercise Quantification SystemActivity MonitoringRotational ExerciseExercise BiologyGenetic PathwaysStatistical AnalysisIncubator ConditionsData Collection

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