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Article de méthode

Formation de Biofilm oral sur différents matériaux pour Implants dentaires

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DOI :

10.3791/57756

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24 juin 2018

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1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole afin d’évaluer la formation de biofilm oral sur des matériaux titane et la zircone pour les culées de prothèses dentaires, y compris l’analyse de la viabilité de cellules bactériennes et des caractéristiques morphologiques. Un modèle in situ , associé à des techniques de microscopie puissant est utilisé pour l’analyse de biofilm oral.

Résumé

Implants dentaires et leurs composants prothétiques sont sujettes à une colonisation bactérienne et la formation de biofilm. L’utilisation de matériaux qui fournit la faible adhérence microbienne peut réduire la prévalence et la progression de maladies péri-implantaires. Compte tenu de l’environnement buccal complexité et oral biofilm hétérogénéité, microscopie techniques sont nécessaires et qui peut permettre une analyse de biofilm de la surface des dents et des matériaux dentaires. Cet article décrit une série de protocoles mis en œuvre pour comparer la formation de biofilm oral sur titane et matériaux céramiques pour des piliers prothétiques, ainsi que les méthodes impliquées dans les analyses de biofilms par voie orale aux niveaux cellulaires et morphologiques. Le modèle in situ pour évaluer la formation de biofilm oral sur des matériaux titane et la zircone pour les culées de prothèses dentaires, tel que décrit dans la présente étude fournit une préservation satisfaisante du biofilm 48 h, démontrant ainsi la pertinence méthodologique. La microscopie multiphoton permet l’analyse d’un représentant de la région du biofilm formé sur le matériel de test. En outre, l’utilisation de fluorophores et le traitement des images à l’aide de la microscopie multiphoton permet l’analyse de la viabilité bactérienne dans une population très hétérogène des micro-organismes. La préparation de spécimens biologiques pour la microscopie électronique encourage la protection structurelle du biofilm, des images avec une bonne résolution et sans artefacts.

Introduction

Biofilms bactériens sont complexes, fonctionnellement et structurellement organisée des communautés microbiennes, caractérisé par une diversité d’espèces microbiennes qui synthétisent un polymère extracellulaire, biologiquement active matrix1,2. L’adhérence bactérienne des surfaces biotiques ou abiotiques est précédée d’une formation de la pellicule acquise, principalement constituée de glycoprotéines salivaires1,3,4. Faibles interactions physico-chimiques entre les micro-organismes et la pellicule sont initialement mis en place et suivies par des rapports plus étroits entre les adhésines bactériennes et les récepteurs de la glycoprotéine de la pellicule acquise. La diversité microbienne augmente progressivement par le biais de la coagrégation des colonisateurs secondaires aux récepteurs des bactéries déjà attachés, formant une communauté multi-espèces1,3,4, 5.

L’homéostasie de la microflore orale et sa relation symbiotique avec l’hôte est important dans le maintien de la santé buccodentaire. La dysbiose au sein de biofilms orale peut accroître le risque pour le développement de la carie et la maladie parodontale2,5. Les études cliniques démontrent une relation de cause à effet entre l’accumulation du biofilm sur les dents ou implants dentaires et l’apparition de gingivite ou péri-implantaire mucosite6,7. La progression du processus inflammatoire entraîne péri-implantites et la perte conséquente de l' implant8.

Implants dentaires et leurs composants prothétiques sont sujettes à une colonisation bactérienne et la formation de biofilm9. L’utilisation de matériaux avec une composition chimique et la topographie de la surface qui offre une adhérence microbienne faible peut réduire la prévalence et la progression du péri-implantaire maladies9,10. Titane est le matériau le plus utilisé pour la fabrication des piliers prothétiques pour les implants ; Cependant, les matériaux céramiques ont été nouvellement introduites et gagnent en popularité comme alternative au titane en raison de leurs propriétés esthétiques et biocompatibilité11,12. Également important, les matériaux céramiques ont été associés à censé réduire les risques d’adhérer aux microorganismes, principalement en raison de leur rugosité, mouillabilité et énergie libre de surface10,13.

Des études in vitro ont contribué à des avancées significatives dans la compréhension de l’adhérence microbienne au pilier prothétique surfaces9,14,15,16,17. Cependant, l’environnement dynamique de la cavité buccale, caractérisée par ses variables de température et de pH et de la disponibilité des nutriments, ainsi que par la présence de forces de cisaillement, n’est pas reproductible dans in vitro des protocoles expérimentaux18, 19. Pour contourner ce problème, une alternative est l’utilisation de modèles de in situ de la formation de biofilm, qui avantageusement conserve sa structure tridimensionnelle pour ex vivo analyse10,20, 21 , 22 , 23 , 24.

L’analyse de la structure complexe du biofilm formé sur des substrats par voie orale nécessite l’utilisation des techniques de microscopie capables d’afficher la matière optiquement dense25. Laser multiphotonique, microscopie à balayage est une option moderne pour l’analyse structurale de biofilm26. Elle est caractérisée par l’utilisation de l’optique non linéaire avec une source d’éclairage proche de la longueur d’onde infrarouge, pulsé à femtosecondes27. Cette méthode est indiquée pour l’acquisition d’images de matières marquées par des fluorophores, en plus des images générées par signaux optiques non linéaires, dérivés d’un phénomène appelé la deuxième génération harmonique ou autofluorescence. Parmi les avantages de la microscopie multiphoton sont la profondeur de la grande image obtenue avec la cellule minimum dommages causés par l’intensité de la lumière d’excitation27.

Pour une analyse de la viabilité du biofilm sur les surfaces abiotiques par microscopie multiphoton, l’utilisation de l’acide nucléique fluorescent colorants présentant des caractéristiques spectrales différentes et une capacité de pénétration dans les cellules bactériennes est requis28. Fluorophores SYTO9 (vert fluorescent) et l’iodure de propidium (rouge-fluorescent) peuvent être utilisés pour une différenciation visuelle entre les bactéries vivantes et mortes28,29,30. L’iodure de propidium pénètre seuls bactéries avec membranes endommagées, tandis que SYTO9 pénètre dans les cellules bactériennes avec une membrane intacte et compromise. Lorsque les deux colorants sont présentes à l’intérieur d’une cellule, l’iodure de propidium a une plus grande affinité pour les acides nucléiques et déplace SYTO9, marquant rouge28,30.

Compte tenu de l’environnement buccal complexité et oral biofilm hétérogénéité, microscopie techniques sont nécessaires et qui peut permettre l’analyse de biofilm de la surface des dents et des matériaux dentaires. Cet article décrit une série de protocoles mis en œuvre pour comparer la formation de biofilm oral sur titane et matériaux céramiques pour des piliers prothétiques, ainsi que les méthodes impliquées dans les analyses de biofilms par voie orale aux niveaux cellulaires et morphologiques.

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Protocole

Cette étude a été approuvée par la Commission institutionnelle de la faculté d’odontologie de Ribeirão Preto, et le participant volontaire signé le consentement écrit (processus 2011.1.371.583).

1. Biofilm Formation in Situ

  1. Sélection des participants
    1. Sélectionner les patients selon les critères d’inclusion suivants : un individu sain avec une dentition complète et aucun signe clinique de maladies buccodentaires.
    2. Exclure les patients selon les critères d’exclusion suivants : grossesse, allaitement, carie dentaire, une maladie parodontale ou antibiothérapie dans les 3 derniers mois, fumeur ou n’importe quelle maladie systémique qui pourrait influer sur l’État parodontal.
  2. Préparation du dispositif intra-oral
    1. Enregistrer l’arcade maxillaire au moyen d’une impression d’alginate.
    2. Préparer, Pierre IV type en ajoutant 19 mL d’eau pour 100 g de poudre de pierre. Versez la pierre dans le moule de l’alginate pour faire un modèle du maxillaire.
    3. Concevoir et fabriquer un appareil intra-oral acrylique pour prendre en charge les éprouvettes (disques en céramique et titane).
      1. Fabriquer des fermoirs rétentives du fil NiCr (0,7 mm de diamètre) à l’aide de pinces orthodontiques #139 et positionnez-les sur le modèle. Pour positionner la pince entre les prémolaires supérieures, pliez une extrémité de chaque fil pour qu’ils forment une boucle.
        1. Adapter la boucle dans la région de la papille interdentaire. Dans l’occlusion, insérez une courbure douce pour ne pas interférer avec les points de contact et l’occlusion. Faire un 90° Pliez à l’extrémité de la pince pour une conservation à l’acrylique.
        2. Pour fixer la pince dans la deuxième molaire supérieure, adapter la courbure du fil dans le troisième col de l’utérus (vestibulaire) de contour de la dent (distale) et de faire un 90° Pliez à l’extrémité de la pince pour une conservation à l’acrylique.
          NOTE : Afin d’assurer une rétention/stabilité suffisante à l’appareil intra-oral, les fermoirs de rétention ont été placés entre les prémolaires supérieures et aspect distal de la deuxième molaire des deux côtés de l’arcade dentaire.
      2. Manipuler l’acrylique autopolymérisable selon les instructions du fabricant, puis appuyez sur la résine acrylique entre 2 plaques de verre (avec une entretoise épaisse de 3 mm interposé) au cours de la phase plastique, faire une feuille épaisse de 3 mm.
      3. Posez la feuille d’acrylique sur la région palatine du modèle, selon la conception de l’appareil et couper l’excédent acrylique avec un sculpteur, avant la polymérisation.
      4. Fabriquer des disques de cire en utilisant une matrice métallique [10 mm de diamètre, 2 mm d’épaisseur (superficie de 78,5 mm2)] en plaçant de cire fondue dans la matrice et attendez que la cire se pour solidifier. Manuellement intégrer 4 disques de cire dans la résine acrylique, 2 d'entre eux entre les prémolaires et les 2 autres à côté les deuxièmes molaires.
      5. Laissez la résine acrylique se polymérisent dans une cocotte sous pression, moins de 20 lb/po2 d’air comprimé pendant 20 min.
      6. Terminer l’installation intraorale un laboratoire dentaire électrique pièce à main et coupe- et polir avec des abrasifs en caoutchouc.
      7. Ajuster l’appareil pour une installation parfaite dans la bouche à l’aide de l’équipement décrit ci-dessus.
  3. Préparation d’échantillons pour le titane et la zircone
    Remarque : Les échantillons (n = 14) sont de 10 mm de diamètre et 2 mm d’épaisseur et avoir une surface de 78,5 mm2.
    1. Polir les surfaces des spécimens avec refroidi à l’eau papiers sablés décroissant d’abrasivité (600, 1200 et 2000 grit), pendant environ 20 min.
      Remarque : Le polissage des spécimens a été réalisé afin de normaliser la rugosité de surface à 0,2 µm.
    2. Nettoyer et désinfecter les spécimens et dispositif intra-oral avec un détergent liquide et de l’eau du robinet et ensuite utiliser un bain à ultrasons d’alcool isopropylique pour 15 min. sécher avec des serviettes en papier absorbant.
    3. Difficulté les spécimens dans le dispositif oral intrabuccal environ 0,1 ml d’adhésif thermofusible non toxiques (Figure 1).
    4. Installer le périphérique contenant les échantillons dans la cavité buccale.
      Remarque : L’appareil intra-oral contenant les échantillons doit être porté pendant 48 h. L’appareil a été retiré et rangé dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), alors que le patient était manger et effectuer un nettoyage par voie orale.

2. évaluation de la viabilité bactérienne

Remarque : L’échantillon taille n = 10.

  1. Préparer une solution de teinture en ajoutant 3 µL de SYTO9 (vert colorant fluorescent des acides nucléiques) et 3 µL de l’iodure de propidium (colorant rouge fluorescent d’acide nucléique) à 1 mL de stérile de l’eau distillée.
    NOTE : Préparer des solutions abrie de la lumière.
  2. Transférer les échantillons à une plaque 24 puits et laver soigneusement avec du PBS pour enlever toutes les cellules non adhérentes.
  3. Ajouter le volume approprié (1 mL) de solution de colorant fluorescent pour couvrir l’échantillon contenant du biofilm. Ajouter le colorant très soigneusement pour ne pas désorganiser le biofilm.
  4. Incuber le spécimen pendant 20-30 min à température ambiante, abrie de la lumière.
  5. Laver délicatement l’échantillon de biofilm avec de l’eau distillée stérile pour enlever n’importe quel colorant excédentaire.
  6. Placer l’échantillon dans un plat en verre bas et effectuez laser multiphotonique, microscopie pour l’analyse de biofilm.
    Remarque : L’analyse de la viabilité de cellules bactériennes a été effectué à l’aide d’un système de microscopie multiphoton. La fluorescence de l’iodure de propidium a été détectée à l’aide d’un filtre avec une longueur d’onde d’excitation/émission de 546/680 nm et 477/600 nm pour SYTO9. La taille des images obtenues a été 5.16188 x 5.16188 mm, ce qui correspond à 26,64 mm2 de la superficie totale de chaque échantillon (78,5 mm2) ou 33,94 % de la superficie totale. Les images étaient confectionnées dans la partie plus centrale de l’échantillon, avec une résolution de 1 024 x 1 024 pixels. Le canal rouge et les images de canal vert ont été analysés séparément à l’aide de logiciels de Fidji31. Chaque cellule a été sélectionnée à l’aide d’un outil de sélection et l’intensité de la fluorescence a été mesurée par la densité intégrée des pixels, soustrayant l’arrière-plan de l’image.

3. analyse de la Composition chimique des spécimens par spectroscopie Dispersive en énergie (EDS)

Remarque : L’échantillon taille n = 3.

  1. Sélectionnez 3 spécimens de chaque substance d’essai exempt de biofilm et évaluer la composition chimique en 2 zones différentes de chaque échantillon à l’aide d’un microscope électronique à balayage couplé à un spectromètre à dispersion d’énergie, avec une tension de faisceau d’électrons de 10 kV32.

4. analyse morphologique du Biofilm bactérien par microscopie électronique à balayage

Remarque : L’échantillon taille n = 1.

  1. Difficulté du biofilm en immergeant les spécimens dans le glutaraldéhyde 2,5 % dilué dans du tampon de cacodylate de sodium 0,1 M, pH 7,0 à 7,3, pendant 24 h.
  2. Laver l’échantillon dans le tampon PBS (pH = 7.6).
  3. Suffixe du biofilm avec 1 % de tétroxyde d’osmium pendant 1 h.
  4. Laver l’échantillon dans le tampon PBS (pH = 7.6).
  5. Déshydrater les échantillons de biofilm soigneusement, en les gardant immergé dans l’augmentation des concentrations des solutions d’éthanol (50 %, 70 %, 90 %, 95 % et 100 %).
    Remarque : Effectuez 3 échanges d’éthanol à une concentration de 100 %. L’étape de déshydratation totale prend environ 2 h.
  6. Passer les spécimens au point critique de séchoir et faire plusieurs substitutions avec le dioxyde de carbone (CO2) jusqu'à ce que les spécimens soient secs.
  7. Retirer les spécimens séchés de l’appareil et les monter sur les détenteurs du microscope électronique à balayage.
  8. Pulvérisation-manteau, une couche de 20 nm d’or sur surface de l’échantillon pour 120 s.
  9. Insérer les disques d’or-couché dans la chambre du microscope électronique à balayage. Obtenir des images provenant de 5 régions différentes de chaque spécimen, à 20-30 kV sous pression variable et à 650 X grossissement12.

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Résultats

La densité de la colonisation du biofilm après 48 h d’in situ de la croissance était représentée dans cette étude, la proportion de la zone colonisée sur les disques de titane et la zircone en ce qui concerne la zone balayée totale de l’échantillon à l’aide de la microscopie multiphoton ( 26.64 mm2). La figure 2 représente la densité de la colonisation bactérienne à la surface des 3 matériaux testés. Une densité plus élevée de biofilm a ét...

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Discussion

Le protocole décrit dans la présente étude visait à évaluer la formation de biofilm sur les matériaux titane et la zircone pour piliers prothétiques, y compris l’analyse de la viabilité des cellules bactériennes et des caractéristiques morphologiques. Pour ce faire, un modèle in situ de la formation de biofilm a été conçu, composé d’un appareil intra-oral capable d’accueillir des échantillons du matériel test et gardez-les à l’exposé à l’environnement dynamique par voie orale pendant 48 h. L’appareil était consi...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier José Augusto Maulin du laboratoire de microscopie multi-utilisateurs (école de médecine de Ribeirão Preto) pour son aide généreuse avec l’EDS et SEM analyses et Hermano Teixeira Machado pour son assistance technique généreuse dans l’édition vidéo.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Hydrogum 5Zhermack DentalC302070
Durone IVDentsply17130500002
NiCr fil  ;Morelli55.01.070
JET autopolymérisation acryliqueClá ; ssico
Cire dentaire  ;Clá ; ssico
Pot sous pression  ;Essencedental
Papiers abrasifs grain 600NORTONT216
Papiers abrasifs 1200 Grains NORTONT401
Grains 2000NORTONT402
Polisseuse métallographiqueArotec
Alcool isopropyliqueSIGMA-ALDRICHW292907
Adhésif thermofusibleTECSILPAH M20017
Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability KitInvitrogenL10316
Pointes de pipette, 10 µ ; LKASVIK8-10  ;   ;
pointes de pipette, 1 000 et micro ; LKASVIK8-1000B  ;   ;
Plaque à 24 puits  ;KASVIK12-024
Plat à fond en verreThermo Scientific150680
AxioObserver microscope inversé  ;ZEISS
Chameleon vision ii laserObjectif cohérent
EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Huile DICZEISS440452-9903-000
Capteurs SDD - X-Max 20mm² ;Oxford Instruments
Solution de glutaraldéhydeSIGMA-ALDRICHG5882
Tampon de cacodylate de sodium  ;SIGMA-ALDRICH97068  ;
Tétroxyde d’osmiumSIGMA-ALDRICH201030
Na2HPO4SIGMA-ALDRICHS9638 Utilisépour la préparation de solution saline tamponnée au phosphate
KH2PO4SIGMA-ALDRICHP9791  ;
NaClMERK1.06404
KclSIGMA-ALDRICHP9333  ;
Absolu d’éthanol pour l’analyse EMSUREMERK1.00983
CPD 030 Sécheur à point critiqueBAL-TEC
JSM-6610 Series Microscope électronique à balayageJEOL
SCD 050 Coucheuse par pulvérisation cathodiqueBAL-TEC

Références

  1. Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
  2. Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
  3. Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections - an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
  4. Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
  5. Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
  6. Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J. Experimental peri-implant mucositis in man. Journal of Clinical Periodontology. 28 (6), 517-523 (2001).
  7. Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
  8. Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
  9. Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
  10. Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
  11. Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
  12. Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
  13. Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
  14. Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
  15. de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Jr Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
  16. de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
  17. de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
  18. Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know? Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
  19. Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
  20. Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055(2016).
  21. Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
  22. do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
  23. Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
  24. Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness - an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
  25. Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms - An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
  26. Lakins, M. A., Marrison, J. L., O'Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
  27. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  28. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
  29. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729(2013).
  30. Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36(2015).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
  33. So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two-photon excitation fluorescence microscopy. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 399-429 (2000).
  34. Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.11 11-24 (2013).
  35. Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
  36. Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
  37. Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
  38. Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
  39. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
  40. Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
  41. Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
  42. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
  43. Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
  44. Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
  45. Knutton, S. Electron microscopical methods in adhesion. Methods in Enzymology. 253, 145-158 (1995).
  46. Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2, Unit 2B.2 (2012).

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