Optimisation de Microdissection Laser-Capture d’isolement de Ganglia entérique de tissu humain frais-congelé

Summary

Le but du présent protocole est d’obtenir des échantillons d’ARN haute intégrité de ganglia entérique isolée du tissu intestinal humain non fixée, fraîchement réséquée à l’aide de microdissection de saisie de laser (LCM). Ce protocole consiste à préparer les échantillons congelés flash de tissu intestinal humain, de cryosectioning, de coloration dans l’éthanol et de déshydratation, LCM et extraction de l’ARN.

Abstract

Le but de cette méthode est d’obtenir des échantillons d’ARN haute intégrité d’entériques ganglions prélevées de tissu intestinal humain non fixée, fraîchement réséquée à l’aide de microdissection de saisie de laser (LCM). Nous avons identifié cinq étapes dans le flux de travail qui sont cruciaux pour l’obtention de RNA isolats de ganglia entérique avec suffisamment de haute qualité et la quantité de RNA-Seq. Tout d’abord, lors de la préparation de tissu intestinal, chaque échantillon doit avoir tous les excès de liquide retiré par éponger avant d’aplatir la séreuse autant que possible dans le bas du gros moules base. Les échantillons sont ensuite rapidement gelés au sommet d’une bouillie de glace sèche et 2-Méthylbutane. En second lieu, lorsque le tissu de sectionnement, il est important de positionner cryomolds afin que les sections intestinales en parallèle le plan complet du plexus myentérique, réduisant ainsi à la plus grande surface de ganglia entérique par diapositive. Troisièmement, au cours de LCM, polyéthylène napthalate (stylo)-diapositives de membrane offrent la plus grande vitesse et la flexibilité en décrivant les formes non uniforme des ganglions entériques lors de la collecte de ganglia entérique. Quatrièmement, pour visualisation distincte des ganglions entériques au sein des sections, compatibles avec l’éthanol colorants, comme le Violet de crésyle, offrent excellente conservation de l’intégrité de la RNA par rapport aux colorants aqueux. Enfin, pour l’extraction de l’ARN des ganglions capturées, nous avons observé des différences entre les kits commerciaux RNA extraction qui a donné quantité de RNA supérieure et de la qualité, tout en éliminant l’ADN contaminant. Optimisation de ces facteurs dans le protocole actuel grandement accélère le flux de travail et donne des échantillons de ganglia entérique avec une qualité exceptionnelle RNA et quantité.

Introduction

Cette méthode est conçue pour obtenir des échantillons d’ARN de haute qualité de ganglia entérique de tissu intestinal humain à l’aide de microdissection de saisie de laser (LCM). Le protocole décrit ici a été optimisé pour fournir suffisamment de qualité RNA et de rendements pour l’ARN (RNA-seq) de séquençage et est destiné à être utilisé avec tissu intestinal humain fraîchement réséqué, interprétation, éclair gelé.

Troubles de la motilité gastro-intestinale et intestin fonctionnel affectent une des quatre personnes aux Etats-Unis. Le système nerveux entérique (ENS), également dénommé le deuxième cerveau¹, est souve....

Protocol

Tous les protocoles décrits ici ont été approuvés par la Vanderbilt University Institutional Review Board (IRB).

1. préparation avant l’arrivée de tissus

1. Obtenir l’approbation de la CISR appropriée et coordonner avec les organismes de Don organe humain pour obtenir fraîchement réséqué, interprétation de tissu intestinal provenant de donneurs qui répondent à tous les critères de recherche nécessaires à l’étude.
   Remarque : Ce protocole peut être adapté pour être utilisé sur des souris et autres modèles de rongeurs.
   1. Immédiatement après la résection de chaque segment intestinal, rincer abondamment la lumière avec PBS réfrig....

Results

Nous avons apporté plusieurs améliorations aux protocoles existants qui permettent la collecte relativement rapide des ganglions entériques à partir des échantillons intestinaux humains utilisant LCM, répondant aux normes pour RNA-Seq. Tout d’abord, nous avons optimisé la congélation rapide des segments de tissu intestinal dans les grands moules base placées à la surface d’une bouillie de glace sèche dans 2 Mo (Figure 1B). Le meilleur succès .......

Discussion

Cette procédure permet la collecte efficace de nombreux ganglions entériques comme source pour calculer les RNA pour RNA-Seq. Ici, nous avons accéléré les processus décrits dans les protocoles existants tout en préservant au maximum l’intégrité RNA. Comme toutes les étapes de cette procédure sont interdépendants, il est important que toutes les questions soit éliminée dès le début de l’étude et que tous les échantillons sont préparés sous le nom de la même façon les uns que possible, afin d’obtenir une fiabilité RNA-Seq........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 % Formaline à tampon neutre	Sigma	HT501128-4L
2-Methylbutane	Fisher	O3551-4
Seringue de 3 mL	BD	309628
tubes coniques de 50 mL, polypropylène  ;	Corning	05-526B
Moules de base 37x24x5mm,	Microscopie Électronique Sciences	5025511
Belzer UW  ; Solution d’entreposage frigorifique	Bridge to Life	N.A.
CapSure Macro LCM bouchons	Arcturus, ThermoFisher	LCM0211
Cling Wrap, Press' n Étanchéité  ;   ;	; Heureux  ;   ;	N.A.  ;
Acétate violet de crésyle	Acros Organics	AC405760025
planche à découper	Microscopie électronique Sciences	63308
Éthanol, 190 degrés	Pharmco-AAPER	111000190
Éthanol, 200 degrés	Pharmco-AAPER	111000200
Lames de microscope en verre	Fisher	12-550-343
Gants, manchette allongée	Microflex  ;
Blouses, chirurgicaux-jetables	Kimberly-Clark  ;	19-088-2116
Barquette, 20 L (grande cuve de stérilisation en polypropylène)	Nalgene  ;   ;	1335920B
Kimwipes (grand)	Kimberly-Clark  ;	34120
Kimwipes (petit)	Kimberly-Clark  ;	34133
Système de microdissection par capture laser (ArcturusXT)	ThermoFisher	N.A.
Mandrin de cryostat Leica, grand,  ; 40 mm  ;	Southeast Pathology Instrument Service	N.A.  ;
Microscope optique	Olympus	CX43
Objectif microscope (20X)	Olympus UPlanFl 20X/0.50, &infin ;/0.17	N.A.
Objectif de microscope (10X)	Olympus UPlanFl 10X/0.25, &infin ;/-	N.A.  ;
Tamis	moléculaires Acros Organics	AC197255000
Eau sans nucléases	Ambion	AM9937
PicoPure Kit d’extraction d’ARN	Applied Biosystems	12204-01
Pellet Pestle	Kimble Kontes	4621973
PEN membrane LCM slides	Arcturus, ThermoFisher	LCM022
Tubes sans RNase, 1,5 mL	Ambion	AM12400
RNaseZAP  ;	Sigma	Sigma-R2020
Kit d’extraction d’ARN « A » (PicoPure)	Applied Biosystems	12204-01
Kit d’extraction d’ARN « B » (RNeasy  ; Micro kit)	Qiagen	74004
Méthode d’extraction d’ARN « C » (TRIzol)	Invitrogen	15596-026
Kit d’extraction d’ARN « D » (RNeasy PLUS Mini kit)	Qiagen	74134
Splash Shield, écran facial jetable	Fisher	17-310
Ciseaux, chirurgicaux, 14,5 cm « sharp-sharp"	Outils	scientifiques fins14002-14
Filtre à seringue, acétate de cellulose (0,2 &mu ; m)	Nalgene  ;   ;	190-2520
Congélation de tissus Medium	General Data Healthcare	TFM-5
Xylenes	Fisher	X3P1GAL