Optimisation de Microdissection Laser-Capture d’isolement de Ganglia entérique de tissu humain frais-congelé

Résumé

Le but du présent protocole est d’obtenir des échantillons d’ARN haute intégrité de ganglia entérique isolée du tissu intestinal humain non fixée, fraîchement réséquée à l’aide de microdissection de saisie de laser (LCM). Ce protocole consiste à préparer les échantillons congelés flash de tissu intestinal humain, de cryosectioning, de coloration dans l’éthanol et de déshydratation, LCM et extraction de l’ARN.

Résumé

Le but de cette méthode est d’obtenir des échantillons d’ARN haute intégrité d’entériques ganglions prélevées de tissu intestinal humain non fixée, fraîchement réséquée à l’aide de microdissection de saisie de laser (LCM). Nous avons identifié cinq étapes dans le flux de travail qui sont cruciaux pour l’obtention de RNA isolats de ganglia entérique avec suffisamment de haute qualité et la quantité de RNA-Seq. Tout d’abord, lors de la préparation de tissu intestinal, chaque échantillon doit avoir tous les excès de liquide retiré par éponger avant d’aplatir la séreuse autant que possible dans le bas du gros moules base. Les échantillons sont ensuite rapidement gelés au sommet d’une bouillie de glace sèche et 2-Méthylbutane. En second lieu, lorsque le tissu de sectionnement, il est important de positionner cryomolds afin que les sections intestinales en parallèle le plan complet du plexus myentérique, réduisant ainsi à la plus grande surface de ganglia entérique par diapositive. Troisièmement, au cours de LCM, polyéthylène napthalate (stylo)-diapositives de membrane offrent la plus grande vitesse et la flexibilité en décrivant les formes non uniforme des ganglions entériques lors de la collecte de ganglia entérique. Quatrièmement, pour visualisation distincte des ganglions entériques au sein des sections, compatibles avec l’éthanol colorants, comme le Violet de crésyle, offrent excellente conservation de l’intégrité de la RNA par rapport aux colorants aqueux. Enfin, pour l’extraction de l’ARN des ganglions capturées, nous avons observé des différences entre les kits commerciaux RNA extraction qui a donné quantité de RNA supérieure et de la qualité, tout en éliminant l’ADN contaminant. Optimisation de ces facteurs dans le protocole actuel grandement accélère le flux de travail et donne des échantillons de ganglia entérique avec une qualité exceptionnelle RNA et quantité.

Introduction

Cette méthode est conçue pour obtenir des échantillons d’ARN de haute qualité de ganglia entérique de tissu intestinal humain à l’aide de microdissection de saisie de laser (LCM). Le protocole décrit ici a été optimisé pour fournir suffisamment de qualité RNA et de rendements pour l’ARN (RNA-seq) de séquençage et est destiné à être utilisé avec tissu intestinal humain fraîchement réséqué, interprétation, éclair gelé.

Troubles de la motilité gastro-intestinale et intestin fonctionnel affectent une des quatre personnes aux Etats-Unis. Le système nerveux entérique (ENS), également dénommé le deuxième cerveau¹, est souvent au centre de ces troubles, car elle joue un rôle crucial dans l’homéostasie intestinale et la motilité. Manipulation de motilité intestinale a été généralement limitée à une résection chirurgicale du tissu aganglionnaire/non contractiles, modification de l’alimentation chronique et/ou médicaments. Étonnamment, le transcriptome complet de l’ENS adulte reste à être séquencé, limitant grandement notre capacité à identifier des molécules au sein de l’ENS peut être ciblé pharmaceutiquement ou utilisés dans les thérapies de cellules souches.

Il y a relativement peu de méthodes pour isoler l’ARN de ganglions entériques humaines. La première approche, de dissociation cellulaire², nécessite de hautes températures et temps d’incubation longue ; les deux qui sont connus pour favoriser la dégradation de l’ARN et altérer le transcriptome^2,3. Une approche alternative, LCM, plus fiable préserve le transcriptome et protège l’intégrité de la RNA. Bien que plusieurs études ont utilisé des LCM pour recueillir les ganglions du tissu intestinal humain frais congelé^4,5,6, ces approches ont été soit contrariées par la mauvaise qualité de RNA et la quantité, étaient tout à fait beaucoup de travail, ou besoin de modification de coloration ou de techniques d’extraction de RNA pour travailler dans nos mains. Autres protocoles de LCM conçus pour préserver la RNA qui ont été trouvés dans des produits LCM manuels fournis des améliorations supplémentaires^7,8, mais l’adaptation était nécessaire lorsqu’il est appliqué à l’isolement de ganglia entérique^{8, 9}. pour ces raisons, nous avons développé un protocole optimisé basé sur ces ressources qui donne des quantités substantielles de l’ARN haute intégrité de ganglions entériques humaines, possède un flux de travail relativement rapide et produit des résultats cohérents dans l’ensemble une grande nombre d’échantillons.

Dans cette étude, nous présentons un résumé des procédures optimisées qui facilitent l’isolement de l’ARN haute intégrité de ganglia entérique provenant de tissu intestinal humain réséqué. Notre méthode intègre cinq aspects importants. Tout d’abord, fraîchement réséqué, interprétations échantillons intestinaux humains doivent être coupés à la taille, avoir tous les excès d’humidité enlevées avec un laboratoire et aplati dans un grand moule avant flash-gel au sommet d’une bouillie de glace sèche et 2-Méthylbutane (2 Mo). Deuxième coupes histologiques de l’intestin doivent être prêts à obtenir le plan complet du plexus myentérique sur une lame, qui offre une grande charge de ganglia entérique. Succès avec cette étape dépend en grande partie le processus de préparation des tissus. Troisièmement, la structure non uniforme des ganglions dans l’ENS nécessite l’utilisation du polyéthylène napthalate (PEN) membrane diapositives⁶, qui offrent la plus grande vitesse et la précision lors du processus de LCM. Quatrièmement, compatibles avec l’éthanol colorants, comme le Violet de crésyle, devraient servir à préserver l’intégrité de RNA tout coloration ganglia entérique. Enfin, le processus d’extraction de RNA est essentiel pour un résultat positif avec RNA-Seq. Nous avons tenté une approche d’extraction d’ARN qui produit haute intégrité de RNA, optimise les rendements de RNA lors du démarrage avec petites collections de ganglia entérique, élimine la contamination de l’ADN et conserve des espèces d’ARN autant que possible.

Pris ensemble, optimisation de ces facteurs dans la présente étude grandement accélère le flux de travail et donne des échantillons des ganglions entériques avec exceptionnel RNA quantitatif et qualitatif. Résultats ont été largement compatibles parmi un groupe important d’échantillons, ce qui indique la cohérence de cette approche. En outre, nous avons utilisé ces approches pour séquencer avec succès des dizaines d’échantillons d’ARN de ganglia entérique. Les stratégies mis en évidence ici aussi largement adaptable pour LCM des ganglions désirées ou noyaux de périphérique et du système nerveux central et autres cas nécessitant l’isolement de l’ARN de haute qualité.

Protocole

Tous les protocoles décrits ici ont été approuvés par la Vanderbilt University Institutional Review Board (IRB).

1. préparation avant l’arrivée de tissus

1. Obtenir l’approbation de la CISR appropriée et coordonner avec les organismes de Don organe humain pour obtenir fraîchement réséqué, interprétation de tissu intestinal provenant de donneurs qui répondent à tous les critères de recherche nécessaires à l’étude.
   Remarque : Ce protocole peut être adapté pour être utilisé sur des souris et autres modèles de rongeurs.
   1. Immédiatement après la résection de chaque segment intestinal, rincer abondamment la lumière avec PBS réfrigérés ou sur un support-tissu pour enlever luminale de matières résiduelles et les matières fécales.
   2. Après rinçage et jeter les déchets dans un récipient approprié biohazard, plonger le tissu dans un volume suffisant de tissu-support (par exemple de 3 à 5 fois le volume de tissu intestinal) et stocker en plastique marquées individuellement, étanche à l’eau conteneurs, immergé dans la glace ou au réfrigérateur jusqu'à l’utilisation).
   3. Traiter le tissu dans les 18-26 heures depuis le moment de la collecte pour empêcher la dégradation substantielle de l’ARN.
      Remarque : Selon la propreté du segment intestinal et de stockage, il peut être possible d’étendre notre délai suggéré.
2. Préparer tout le matériel nécessaire pour la collection de tissus humains à l’avance, comme indiqué dans le présent protocole (voir la Table des matières pour des informations produit plus détaillés). Garantir que tous les équipements de protection individuelle est porté en tout temps.
3. Préparer des seaux de glace sèche avec une bouillie de glace carbonique comme illustré à la Figure 1.
   1. Écraser assez carboglace pour remplir des seaux à glace circulaire standard 4 et un seau à glace rectangulaire. L’un des seaux standards devrait avoir laboratoire de petite taille (11 x 21 cm) tissus placés à la surface de la glace sèche. Si possible, utilisez des boîtes neuf, non ouverts, des tissus de laboratoire.
   2. Faire une bouillie de glace sèche par powderizing 2 L de glace carbonique dans un seau à glace propre rectangulaire.
   3. Ajouter préalablement réfrigérée 2 Mo jusqu'à la surface de la glace sèche. Mélanger et aplatir la pâte à l’aide d’un couvercle de boîte de pointe de pipette à surface de forme de la boue dans un canal entouré de gros morceaux de glace sèche le long des côtés du seau rectangulaire légèrement.
   4. Placer plusieurs blocs minces de glace sèche sur les bords de la seau à glace pour encourager la congélation plus rapide. Il devrait y avoir place pour ≥ 4 moules base adapter souplement dans le seau de boue de neige carbonique à un moment donné.
      1. Éventuellement, pile le seau à glace dans un autre seau à glace rectangulaire remplie ¼ avec neige carbonique. Ce positionnement permet de mieux isoler la boue de neige carbonique et évite la nécessité d’ajustements fréquents de glace sèche et 2 Mo au cours de la procédure.
   5. Positionner les seaux de glace sèche dans une chaîne de montage dans l’ordre suivant : 1) glace seau de lisier, seau à glace 2) laboratoire tissu sec, 3 & 4) normal sec seaux à glace, seau de glace 5) rectangulaire (Figure 1A).

2. préparation du tissu Intestinal humain congelé Flash

Remarque : Tout ce processus peut prendre entre 45-80 min par segment intestinal, en fonction de la qualité de tissu intestinal. Nous vous recommandons également le prélèvement d’échantillons de contrôle de la qualité afin d’évaluer la qualité de RNA et histologie avant de procéder à la LCM.

1. Remplir un grand plateau de glace humide et placez les planches à découper chirurgicale au sommet de la glace sèche.
2. Dans cette configuration, faites refroidir un béchers de 500 mL et 100 mL pour stocker les tissus et les segments taillées dans une solution d’entreposage au froid. Base de pré refroidissement éolien moules sur les planches à découper afin qu’ils soient prêts à recevoir des tissus.
3. Après avoir reçu les tissus intestinaux frais, décanter les médias dont le tissu est transporté et conservez-le dans les béchers préalablement réfrigérées. Laisser une certaine marge dans ces gobelets pour le stockage temporaire des tissus intestinaux et segments ajustées, qui seront préparés dans les étapes suivantes.
4. Couper le segment intestinal sur une longueur d’environ 20 cm, ce qui fournit un grand tissu (40 à 60 cm²) pour générer des RNA pour applications en aval et des échantillons de contrôle de la qualité. Selon l’intégrité des tissus, il peut être possible de réaliser des ARN pour le traitement en aval d’une beaucoup plus petite longueur (c.-à-d., 5 cm de l’intestin).
5. Tailler loin tissus adipeux et le tissu conjonctif de l’intestin à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Adipeuse le long de la séreuse intestinale résiduelle compromet la capacité d’aplatir complètement le tissu dans les étapes suivantes. Couper avec précaution le tissu, afin d’éviter les entailles de la séreuse au moment du retrait de la graisse et du tissu conjonctif, qui peut structurellement endommager le plexus myentérique ou qui rendent à l’extérieur du tissu aplatir inégalement pour le sectionnement.
6. Faire une incision longitudinale sur toute la longueur de l’échantillon intestinal, préférablement sur le site d’attachement mésentérique.
7. Disséquer de loin et jeter le coli ténia du colon, afin qu’il s’aplatit plus facilement, dès sa sortie de tension.
8. S’écrasent la muqueuse intestinale du côté vers le bas sur une planche à découper réfrigérés et couper des bandes de 1,25 cm de large de toute la longueur du tissu.
   Remarque : Tissu Intestinal développe souvent après massicotage, alors cette taille doit être ajustée en conséquence.
9. Stocker temporairement les bandes dans la solution de stockage réfrigéré sur le tissu.
   Remarque : Nous utilisons Belzer UW cold storage solution car il a une longue durée de vie, peut être relativement intéressant et peut être conservé à température ambiante jusqu'à ce que nécessaire.
10. Supprimer une bande de tissu de la solution de stockage de froid et le découper en segments ~1.5-2 cm de long.
11. Rapidement, épongez les segments intestinaux sur une pile de lingettes de laboratoire, pour enlever l’excès de liquide et éviter la formation de cristaux de glace le long de la séreuse intestinale au cours du flash-gel. Si le tissu n’est pas suffisamment séché, il sera difficile d’obtenir des Articles de haute qualité du plexus myentérique.
12. Déposer la buvardages pièces intestinale muqueuse-face vers le haut sur un pré réfrigéré, grand, jetable en plastique moule (37 x 24 x 5 mm).
13. Aplatissez soigneusement chaque segment par légèrement étirer le tissu sur la surface de la moule et avec une pincette courbée à doucement enfoncer et expulser les bulles d’air qui peuvent être pris au piège sous la séreuse. Notez que le tissu se développe tout en aplatissant. Si nécessaire, découper les segments et couper les échantillons restants à une taille plus petite.
    Remarque : Si le tissu est trop tendu, cela faussera le plexus myentérique. Après que toutes les bulles d’air sont enlevés, évaluer l’épaisseur de l’échantillon avant la congélation. Si nécessaire, appuyez sur les bords du entrant spécimen jusqu'à ce que l’échantillon intestinal aborde son épaisseur d’origine.
14. Placer le moule chargé sur la surface de la glace sèche, boue de 2 Mo. Le tissu doit complètement figer dans 30 à 60 s, selon la taille et l’épaisseur du segment intestinal.
15. Essuyez le fond de la moule pour enlever 2 Mo résiduel en frottant rapidement le moule sur les tissus de laboratoire préalablement refroidis dans le deuxième seau de glace sèche.
16. Transférer l’échantillon séché à la troisième cuve de glace sèche et l’enterrer sous la surface de la glace sèche jusqu'à ce qu’il est prêt à être emballé.
17. Rapidement observer le fond de la moule avant emballage, afin d’examiner la qualité de la préparation de l’échantillon. Prenez note de tous les échantillons qui ne pas apparaître plat ou avoir des bulles d’air important, que ceux-ci devraient être évités pour cryosectioning et LCM.
18. Envelopper l’exemple dans une feuille d’aluminium préalablement étiquetées qui est présentée au sommet de la glace carbonique dans un seau, pour que l’enveloppe de tissus se produit tout en étant complètement congelés.
19. Envelopper l’échantillon avec une couche de film plastique, pour minimiser la déshydratation des tissus au cours du stockage à-80 ° C.
20. Conserver les échantillons dans le seau rectangulaire jusqu'à ce qu’elles sont prêtes à être déplacés vers le congélateur.
21. Étiqueter pré et pré chill boîtes de congélateur à-80 ° C pour assurer immédiatement le stockage des échantillons après le prélèvement.
22. Prendre une petite partie du tissu de chaque segment intestinal pour évaluation de l’intégrité de la RNA avant la tenue de LCM.
    1. Étiquette avant un tube de RNase-libre de 2mL pour chaque segment, rempli de ≥500 µL de tampon de lyse. Nous vous recommandons d’utiliser le Kit d’Extraction d’ARN « D », énuméré dans la Table des matières.
    2. Homogénéiser un morceau de grêle (2 x 2 mm) de l’intestin dans un tissu standard micro-homogénéisateur (20-40 s, jusqu'à ce qu’aucun morceaux de tissu). Puis, immédiatement geler l’ARN lysat sur glace sèche et de conserver à-80 ° C jusqu'à ce que de procéder à l’extraction de l’ARN.
    3. Éventuellement, incorporer certaines des sections dans le milieu de congélation des tissus (TFM) sous forme d’un back-up. Préparer des coupes de tissus dans exactement la même manière décrite dans cette section, mais submerger les échantillons à TFM dans le moule avant le flash du point de congélation.

3. Cryosectioning

1. Avant cryosectioning, préparer tout matériel requis pour la coloration et la déshydratation et transférer les échantillons de tissu souhaité du congélateur à-80 ° C dans un seau de glace sèche.
2. Préparer le cryostat pour utilisation en affectant la température de coupe optimale (-18 à-22 ° C) et essuyer les surfaces avec 100 % d’éthanol et traitement de la lame et la brosse plateau avec la solution de décontamination de RNase.
3. Pour mieux respecter l’échantillon au mandrin, utiliser l’approche suivante.
   1. Placer la pince à glace sèche pendant au moins 30 s avant de déballer l’échantillon intestinal et en le plaçant à la surface de la glace carbonique séreuse-côté-vers le haut.
   2. Verser un monticule de 3 à 5 mm de tissu gel milieu (TFM) sur un porte-échantillon cryostat grand et transférer immédiatement l’échantillon intestinal séreuse-côté-vers le haut sur la TFM.
   3. Transférer rapidement le porte-échantillon à la glace sèche et recouvrir de carbonique réduit après avoir laissé la TFM à adhérer à l’échantillon pour 2-5 s à température ambiante. Assurez-vous que la TFM reste au-dessous du plan du plexus myentérique.
      NOTE : Idéalement, la surface extérieure de la muqueuse intestinale entièrement adhérera à la TFM avant la TFM commence à geler sans dégel de l’échantillon.
4. Monter le porte-échantillon dans la tête de l’objet du cryostat et aligner l’échantillon avec la lame du cryostat, tels que le plan du plexus myentérique sera parallèle à la lame de coupe.
5. Définir l’épaisseur de coupe sur le cryostat à 8 µm. Le but d’aligner parfaitement le spécimen est d’obtenir la plus grande surface possible du plexus myentérique sur chaque diapositive. Cette épaisseur est généralement recommandée pour les tissus humains et rongeurs, mais peut être ajustée, au besoin.
6. Article par le biais de la séreuse et le muscle longitudinal jusqu'à atteindre le plexus myentérique.
   1. Pour localiser le plexus myentérique, monter une section de l’échantillon sur une lame et tacher la section avec un colorant aqueux, par exemple 1 % Cresyl violet ou bleu de toluidine, etc.
   2. Consulter la section sous un microscope optique à grossissement 40-2000 X pour identifier la jonction entre les couches de muscles longitudinaux et circulaires. Paramètres de microscope sont fournis dans la Table des matières. Au début de la section, la séreuse sera marquée par la présence de tissu conjonctif. Certains gras mésentérique restant peuvent être également présents le long de la séreuse. Une feuille de la couche musculaire longitudinale externe commence alors. Après avoir atteint la frontière entre les couches de muscles longitudinaux et circulaires, on observera une partie des ganglions entériques.
      Remarque : Dans les prochaines sections de plusieurs, le plexus myentérique deviendra très évident, avec grandes étendues de ganglions étant présent dans une seule section (Figure 2C). Si le tissu n’est pas complètement à plat au début de la section, alors qu’une partie des ganglions sera présente dans chaque section à un moment donné. Parfois, l’échantillon intestinale peut avoir un plexus myentérique intrinsèquement inégaux, malgré le tissu apparaissant parfaitement plane. Cela est particulièrement vrai pour les échantillons du duodénum. Dans notre expérience, ces échantillons peuvent prendre beaucoup plus de temps pour traiter avec LCM, mais RNA suffisante peut être rassemblée au sein de la session d’un seul jour. L’emplacement exact du plexus myentérique peut varier considérablement entre les échantillons, basés sur le tissu et sa préparation avant la congélation.
7. Commencer à percevoir des coupes sériées pour LCM, avec des collections optimales offrant le plus grand nombre de neurones et cellules gliales par diapositive. Selon la surface de l’échantillon, plusieurs sections peuvent être combinées sur une seule diapositive PEN-membrane.
8. Monter les sections sur glissières de membrane PEN, réfrigérées brièvement dans le cryostat pour 5-10 s. Lors du montage, le tissu devrait fondre légèrement, en préservant au maximum l’intégrité RNA.

4. coloration

Remarque : Pour une vue d’ensemble du processus de coloration, reportez-vous au tableau 1. Toutes les solutions utilisées sont préparées en standards 50 mL fioles coniques. Traitement à l’extérieur des tubes avec la solution de décontamination de RNase ne semble pas améliorer les résultats (données non présentées).

1. Préparer une solution saturée de violet de crésyle 4 % dans l’éthanol à 95 % au moins une journée à l’avance et bien remettre en suspension le violet de crésyle avant le chargement de la seringue.
   Remarque : La concentration d’éthanol peut doivent être réduites pour la coloration efficace, tel que décrit dans la section « discussion ». Nous n’avons pas testé si utilisant l’éthanol 50 % ou 75 % au cours de coloration nettement réduit l’intégrité RNA. Violet de crésyle est sensible à la lumière et doit donc être protégé de la lumière.
2. Après avoir monté les sections du plexus myentérique sur le toboggan, immédiatement plonger la lame dans une fiole conique d’éthanol à 95 % (préalablement refroidi à-20 ° C) pendant 30 s.
   1. Si les sections n’adhèrent pas en totalité à la diapositive à l’étape précédente, le réchauffer légèrement le bas de la lame avec une main gantée (une lingette de laboratoire doit être placé entre les deux la diapositive et gant), l’adhérence complète avant de plonger dans l’éthanol à 95 %. Cette solution peut être réutilisée pour au moins 3-6 diapositives sans réduire l’intégrité RNA.
3. Posez la lame face vers le haut sur une lingette de laboratoire placée au sommet d’un conteneur pré-traité, exempte de RNase⁸.
4. Remplir à l’avance une seringue de 3mL avec 4 % violet de crésyle et fixer un filtre de seringue 0,2 µm.
   Remarque : Nous vous recommandons les filtres acétate de cellulose.
5. Appliquer 6 à 10 gouttes de colorant directement sur le tissu les sections⁸ et incuber pendant 10-30 s, ou jusqu’au colorant suffit est conservée quand le teint. Tout en coloration, tourner doucement le récipient de la diapositive à la main pour s’assurer que les sections de tissu sont uniformément recouvert de taches.
6. Décanter la tache et immédiatement la tache la lame dans un flacon d’éthanol 75 %. À plusieurs reprises de submerger la diapositive jusqu'à ce que le colorant excédentaire pour la plupart s’est infiltrée hors de l’échantillon. Cela peut prendre entre 10-20 s.
7. Finaliser la coloration par maintes fois immersion l’échantillon dans un flacon d’éthanol à 95 % pendant 10 s. Submerge l’échantillon à plusieurs reprises jusqu'à ce que tous les excès tache a été supprimé.
   1. Modifier la durée de décoloration, au besoin, afin d’optimiser la coloration des ganglions. Si trop tache est enlevée, l’échantillon devient trop transparent et il peut être difficile à visualiser
      Remarque : Ce protocole de coloration a été optimisé basé sur plusieurs publications^5,8,10,,¹¹ qui prévoit être modifiés avant que des résultats satisfaisants ont été obtenus. Par conséquent, la concentration d’éthanol utilisé dans la teinture et Pendant le processus de décoloration devrait être modifiée, si nécessaire, pour obtenir un résultat optimal.

5. la déshydratation

1. Tremper immédiatement la lame dans de l’éthanol 100 % 2 - 3 fois, pour un total de 10-20 s.
2. Plonger la lame dans l’éthanol anhydre 100 % pendant au moins 30 s. Comme l’éthanol anhydre est très hygroscopique, ajouter tamis moléculaires (maille de 8-12) dans le flacon d’éthanol à 100 % avant le début de la procédure pour enlever toute l’eau absorbée et donc plus complètement déshydrater l' échantillon⁵.
3. À plusieurs reprises tremper la lame dans le xylène pour 15-20 s. Cette étape supprime complètement la couche de l’éthanol sur la diapositive. Ajouter des tamis moléculaires avance aux tubes du xylène, d’adsorber entièrement les excès d’éthanol et d’eau molécules⁵.
   ATTENTION : Les xylènes sont classés comme un irritant pour les yeux et les voies respiratoires et doivent être utilisés dans une hotte chimique.
4. Plonger la lame dans le xylène (avec des tamis moléculaires, maille de 8-12) pendant au moins 10 min.
   Remarque : Une brève pause peut être prise après cette étape, si nécessaire. Des échantillons peuvent être laissés dans le xylène pendant 4-5 heures sans effets néfastes aux taches, LCM ou ARN rendement/intégrité.
5. Facultativement, individuellement préparer plusieurs diapositives supplémentaires à ce stade. Si vous préparez une deuxième série de diapositives après avoir terminé de LCM sur toutes les lames préparées, le tissu dans le cryostat devrez peut-être être rectifiés, due à une déshydratation de la surface du tissu. Un à quatre sections peuvent doivent être jetés avant les sections utilisables peuvent être collectées.

6. laser Microdissection de saisie (LCM)

1. Retirez la lame de xylène et sécher à l’air elle sous une hotte chimique pendant au moins 1 min. Insérer une cartouche de bouchons de LCM sur la platine du microscope LCM. Chargez la lame sur la scène et acquérir une image d’aperçu de la diapositive.
2. Identifier l’emplacement désiré pour LCM et charger un capuchon sur la diapositive.
3. Aligner le laser infrarouge (IR) et d’ajuster sa puissance et sa durée pour faire 20 à 30 µm de diamètre capturer spot.
4. Localiser le laser ultraviolet (UV) et définir une vitesse de coupe approprié et l’intensité.
5. Décrire les ganglions désirées à percevoir à l’aide du logiciel de LCM, en veillant à rester dans les limites de la zone percevable sur la PAC (représentée dans l’aperçu de la diapositive du logiciel comme un cercle vert).
6. Dans chacune des traces, ajuster les taches IR telles qu’il y a au moins un IR repérer chaque 100 à 500 µm.
7. Appuyez sur le bouton coupe de IR/UV pour procéder à la collecte de tous les ganglions marquées.
8. Une fois que les collections sont complétées, soit passer le cap vers un nouvel emplacement et répéter le processus de collecte ou examiner la PAC LCM à la station QC lorsque le bouchon est suffisamment rempli avec les ganglions (ou jusqu'à ce que soit atteinte la limite recommandée de temps de 60 à 80 minutes).
9. Si les débris sont présents sur la PAC, l’essuyer loin à l’aide d’un pinceau à pointe fine qui a été préalablement traité avec la solution de décontamination de RNase, rincé avec de l’eau exempte de nucléase et complètement sec.
10. Examiner soigneusement le bouchon par œil ou grossissement sous un champ lumineux de microscope pour s’assurer que tous les débris a été supprimé. Si les débris ne peuvent être enlevés en utilisant le pinceau pré-traité, utilisez une fine de pipette (RNase-libre) pour gratter les débris.
11. Fixer le couvercle sur un tube à centrifuger 0,5 mL rempli de 230 µL de tampon de lyse RNA (tampon RLT de Kit d’Extraction d’ARN « B », avec la β-mercaptoéthanol ajouté à une concentration de 10 µL/mL).
12. Inverser le cap, brièvement vortex et incuber à température ambiante pendant 30 min.
13. Centrifuger à ≥ 5 000 x g pour 5 min et puis transfert les microtubes tube de glace sèche.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. RNA lysats peuvent être stockées à-80 ° C sans un effet substantiel sur la dégradation de l’ARN pendant au moins 1 semaine. Si l’ARN est effectuée le jour même, puis faites refroidir les échantillons sur la glace jusqu'à ce qu’ils sont prêts pour l’extraction.
14. Effectuer toutes les collections supplémentaires dans la limite de temps maximale recommandée de 80 à 90 min après avoir retiré la diapositive du xylène. Comme les sections déshydratées sont exposées à l’humidité ambiante, ribonucléases peuvent progressivement devenir réactivées. Restreindre la période de collecte peut réduire au minimum ces effets et préserver au maximum l’intégrité RNA.

7. les ARN

1. Préparer un poste de travail libre de RNase pour les extractions de RNA.
2. Préparer tous les tubes et les réactifs selon le manuel pour le Kit d’Extraction d’ARN.
   Remarque : Bien qu’il existe de nombreux kits disponibles pour ARN suite LCM, nous avons eu les meilleurs succès en utilisant le Kit d’Extraction d’ARN « B », figurant dans la liste du matériel. Voir la Figure 5 pour une comparaison côte-à-côte des réactifs d’extraction RNA.
3. Prélèvement d’échantillons du congélateur à-80 ° C et décongeler rapidement dans un bain-marie à 37 ° C.
4. Immédiatement le vortex décongelés échantillons pour 2-3 s pour répartir les sels de sulfocyanure de guanidinium.
5. Mélanger chaque échantillon avec un volume égal d’éthanol à 70 %. Regrouper des lysats de 2 ou plus, si nécessaire, pour atteindre une concentration suffisante d’ARN.
6. Procéder selon les instructions du fabricant dans le manuel pour le procédé d’extraction de RNA, utilisant le protocole optimisé pour échantillons microdissected.
7. Éluer l’ARN à l’étape finale dans le volume minimum conseillé d’eau exempte de nucléase (14 µL).
8. Après isolement d’ARN, aliquote 1-2 µL d’ARN de chaque échantillon dans un nouveau pré étiquetés tube exempt de RNase qualité évaluation/contrôle de qualité avec un dispositif microfluidique qui peut visualiser de petites quantités d’ARN, comme un Bioanalyzer. Aliquoter une supplémentaire 1 µL dans une éprouvette distincte pour la quantification avec un kit de quantification ARN haute sensibilité.
   1. Réglez ces étapes, si nécessaire, pour obtenir une quantité suffisante de l’ARN pour analyse en aval (i.e., mettre en commun un grand nombre de sélections de LCM avant l’extraction de l’ARN).
9. Magasin RNA à-80 ° C jusqu'à recueillir suffisamment d’échantillons pour analyse en aval.

Résultats

Nous avons apporté plusieurs améliorations aux protocoles existants qui permettent la collecte relativement rapide des ganglions entériques à partir des échantillons intestinaux humains utilisant LCM, répondant aux normes pour RNA-Seq. Tout d’abord, nous avons optimisé la congélation rapide des segments de tissu intestinal dans les grands moules base placées à la surface d’une bouillie de glace sèche dans 2 Mo (Figure 1B). Le meilleur succès ...

Discussion

Cette procédure permet la collecte efficace de nombreux ganglions entériques comme source pour calculer les RNA pour RNA-Seq. Ici, nous avons accéléré les processus décrits dans les protocoles existants tout en préservant au maximum l’intégrité RNA. Comme toutes les étapes de cette procédure sont interdépendants, il est important que toutes les questions soit éliminée dès le début de l’étude et que tous les échantillons sont préparés sous le nom de la même façon les uns que possible, afin d’obtenir une fiabilité RNA-Seq....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 % Formaline à tampon neutre	Sigma	HT501128-4L
2-Methylbutane	Fisher	O3551-4
Seringue de 3 mL	BD	309628
tubes coniques de 50 mL, polypropylène  ;	Corning	05-526B
Moules de base 37x24x5mm,	Microscopie Électronique Sciences	5025511
Belzer UW  ; Solution d’entreposage frigorifique	Bridge to Life	N.A.
CapSure Macro LCM bouchons	Arcturus, ThermoFisher	LCM0211
Cling Wrap, Press' n Étanchéité  ;   ;	; Heureux  ;   ;	N.A.  ;
Acétate violet de crésyle	Acros Organics	AC405760025
planche à découper	Microscopie électronique Sciences	63308
Éthanol, 190 degrés	Pharmco-AAPER	111000190
Éthanol, 200 degrés	Pharmco-AAPER	111000200
Lames de microscope en verre	Fisher	12-550-343
Gants, manchette allongée	Microflex  ;
Blouses, chirurgicaux-jetables	Kimberly-Clark  ;	19-088-2116
Barquette, 20 L (grande cuve de stérilisation en polypropylène)	Nalgene  ;   ;	1335920B
Kimwipes (grand)	Kimberly-Clark  ;	34120
Kimwipes (petit)	Kimberly-Clark  ;	34133
Système de microdissection par capture laser (ArcturusXT)	ThermoFisher	N.A.
Mandrin de cryostat Leica, grand,  ; 40 mm  ;	Southeast Pathology Instrument Service	N.A.  ;
Microscope optique	Olympus	CX43
Objectif microscope (20X)	Olympus UPlanFl 20X/0.50, &infin ;/0.17	N.A.
Objectif de microscope (10X)	Olympus UPlanFl 10X/0.25, &infin ;/-	N.A.  ;
Tamis	moléculaires Acros Organics	AC197255000
Eau sans nucléases	Ambion	AM9937
PicoPure Kit d’extraction d’ARN	Applied Biosystems	12204-01
Pellet Pestle	Kimble Kontes	4621973
PEN membrane LCM slides	Arcturus, ThermoFisher	LCM022
Tubes sans RNase, 1,5 mL	Ambion	AM12400
RNaseZAP  ;	Sigma	Sigma-R2020
Kit d’extraction d’ARN « A » (PicoPure)	Applied Biosystems	12204-01
Kit d’extraction d’ARN « B » (RNeasy  ; Micro kit)	Qiagen	74004
Méthode d’extraction d’ARN « C » (TRIzol)	Invitrogen	15596-026
Kit d’extraction d’ARN « D » (RNeasy PLUS Mini kit)	Qiagen	74134
Splash Shield, écran facial jetable	Fisher	17-310
Ciseaux, chirurgicaux, 14,5 cm « sharp-sharp"	Outils	scientifiques fins14002-14
Filtre à seringue, acétate de cellulose (0,2 &mu ; m)	Nalgene  ;   ;	190-2520
Congélation de tissus Medium	General Data Healthcare	TFM-5
Xylenes	Fisher	X3P1GAL