Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour capturer des Images 4-dimensionnelle des effets de modulation de la contrainte de cisaillement sur le coeur de poisson-zèbre en développement

Résumé

Nous présentons ici un protocole afin de visualiser le développement des cœurs chez le poisson zèbre en 4 Dimensions (4D). L’imagerie 4D, par l’intermédiaire de la microscopie en fluorescence lumière-feuille (LSFM), prend 3 Dimensions (3d) images au fil du temps, de reconstruire les cœurs en voie de développement. Nous montrons qualitativement et quantitativement que cette contrainte de cisaillement active endocardique Notch signalisation au cours du développement de chambre, qui favorise la trabeculation cardiaque.

Résumé

Les forces hémodynamiques que par le développement cardiaque de coeur influence, surtout trabeculation, qui forme un réseau d’excroissances ramifiées par le myocarde. Programme d’amélioration génétique défauts dans l’encoche de signalisation cascade participent ventriculaires défauts comme la cardiomyopathie Non-Compaction ventriculaire gauche ou Syndrome de coeur gauche hypoplasique. Utilisant ce protocole, il peut être déterminé que la contrainte de cisaillement piloté par trabeculation et la signalisation Notch sont liés à un autre. À l’aide de la microscopie de Fluorescence lumière-feuille, visualisation du poisson-zèbre-coeur en développement a été possible. Dans ce manuscrit, il a cherché à déterminer si les forces hémodynamiques modulent l’ouverture de trabeculation via la signalisation Notch et par conséquent, influer sur la fonction contractile se produit. Qualitative et quantitative de cisaillement analyse des contraintes, 4-D (3-J + temps) images ont été acquises au cours de la morphogenèse cardiaque de poisson-zèbre et fluorecence feuilles lumière intégrée avec 4D synchronisation capturé la motion ventriculaire. La viscosité du sang a été réduite via gata1a- morpholino oligonucléotides (MO) la micro-injection pour diminuer la contrainte de cisaillement, ainsi, down-régulation encoche de signalisation et d’atténuer les trabeculation. Coinjection de Nrg1 ARNm avec gata1a MO a sauvé les gènes liés à l’encoche pour restaurer trabeculation. Pour confirmer la contrainte de cisaillement, piloté par la signalisation Notch des influences trabeculation, contraction de cardiomyocyte a été encore arrêtée via tnnt2a-MO pour réduire les forces hémodynamiques, ainsi, down-régulation des gènes de cible encoche pour développer un non-trabéculé myocarde. Enfin, corroboration des patrons d’expression des gènes sensibles aux contraintes de cisaillement de Notch a été réalisée en soumettant des cellules endothéliales à flux pulsatile. Ainsi, la microscopie de lumière-feuille 4D découvert hémodynamiques forces qui sous-tendent la signalisation Notch et trabeculation présentant de l’intérêt clinique à une cardiomyopathie non-compaction.

Introduction

Forces biomécaniques, telles que la contrainte de cisaillement hémodynamique, sont intimement impliqués dans la morphogenèse des cardiaque. En réponse aux forces de cisaillement hémodynamiques, sillons et crêtes myocardiques se développent dans un réseau trabéculaire ondulants dans l’alignement de la direction de la contrainte de cisaillement dans l’ensemble de l’auriculo-ventriculaire (AV) vanne¹. Trabeculation cardiaque est nécessaire d’augmenter la contractilité et la masse myocardique². Des mutations dans l’encoche, voies de signalisation entraînent des malformations cardiaques congénitales chez les humains et les autres vertébrés³. Par exemple, gata1a⁴ et tnnt2a⁵ morpholino oligonucléotides (MO) ont été montrés pour réduire l’érythropoïèse, tandis que l’érythropoïétine (EPO) d’ARNm⁶ et l’isoprotérénol (ISO)⁷ augmentent rouge sang cellules et la fréquence cardiaque, respectivement et par conséquent mur contrainte de cisaillement (WSS). En outre, signalisation ErbB2, en aval de l’encoche, favorise cardiomyocyte prolifération et la différenciation pour générer la force contractile, qui à son tour active Notch signalisation^8,9. Il est suggéré que la contrainte de cisaillement régit Notch signalisation conduite trabeculation pour le développement ventriculaire. Actuellement, il y a beaucoup d’études qui tentent de mieux comprendre les événements de programmation génétiques conduisant à des malformations cardiaques congénitales (CHD)^10,11,12, mais très peu étudient comment les forces mécaniques influencent le coeur formant.

Afin d’étudier les forces mécaniques agissant sur l’endocarde, une surveillance étroite au cours de la période de développement doit être mis en œuvre. Toutefois, il est difficile d’obtenir des images de bonne qualité en vivo battant échantillons en raison de l’inhérence de microscopie traditionnelle¹³. Afin d’observer l’évolution dans le temps au sein d’un échantillon, physique de sectionnement et de coloration, se doivent donc se produire^13,14,15. Bien que la microscopie confocale est largement utilisée pour l’image de la structure 3D d’échantillons^14,16, acquisition de ces systèmes d’imagerie est encore limitée par les faibles vitesses de balayage.

La microscopie en fluorescence lumière-feuille (LSFM) est une technique d’imagerie qui permet la visualisation de in vivo des événements dynamiques avec long travail distance¹³. Cette technique utilise une microscopie fluorescente lumière-feuille pour la section optiquement un échantillon de¹⁷. En raison de l’éclairage de seulement une feuille mince de la lumière sur l’échantillon, il y a une réduction de blanchiment photo et photo toxicité^13,18. Le grand champ de vue et de longue distance de travail permet de grands échantillons de rester intact, car ils sont imagés^13,14,17. Le faible grossissement permet une plus grande surface à être photographiée, tandis que la longue distance de travail permet d’échantillons plus épais être photographié sans compromettre le rapport signal-bruit. De nombreux groupes ont utilisé LSFM image entière embryons¹⁷, brains^14,18, des muscles et des coeurs¹⁹ parmi les autres tissus, montrant les divers types d’échantillons qui peuvent être photographiées.

Bien que des recherches antérieures force de cisaillement hémodynamiques réduite par l’occlusion les pistes flux entrant ou sortant du cœur zebrafish, l’information est exclusivement qualitative. Il en résulte un anormal (troisième chambre bouclage cardiaque diminuée et vanne avec facultés affaiblies formation²⁰. Les images LSFM 4D donnent une nouvelle perspective dans la façon dont le cisaillement hémodynamique forces affectent le développement du tissu cardiaque. Ces forces mécaniques peuvent activer des molécules de signalisation sensibles à la force et induire la formation des crêtes trabéculaires. En raison de l’aspect du temps additionnel d’imagerie 4D, on est capable de suivre les changements dans le développement en temps réel, ce qui pourrait conduire à de nouvelles révélations qui avaient passés inaperçues auparavant. Le poisson-zèbre est un modèle idéal pour l’imagerie parce que les scientifiques peuvent observer un animal vertébré complet contre seulement les interactions cellule-cellule. L’oxygène peut également diffuser à travers l’embryon entier, qui permet un développement se produire sans selon le système vasculaire, à la différence dans le développement chez les mammifères. Même si le coeur de poisson-zèbre ne possède pas les organes pulmonaires, qui exigent un cœur à quatre cavités, il y a un grand nombre de gènes cardiaques qui sont conservées entre les poissons zèbres et l’homme²¹.

Dans ce manuscrit, nous expliquent comment utiliser la microscopie en fluorescence lumière-feuille d’imager les travées en développement dans les coeurs de poisson-zèbre dans diverses circonstances. Tout d’abord, l’injection de gata1a⁴ ou tnnt2a⁵ MOs servaient à bas la viscosité du sang et par conséquent WSS. La morphologie du cœur a été enregistrée puis. Dans un autre groupe de poissons, nous a augmenté le WSS en administrant des ARNm de l’OEB ⁶ ou isoprotérénol⁷ et observer les résultats. Nous avons également mené une étude de cellule avec différents débits pulsatile ou oscillant. Après chaque groupe d’imagerie, nous avons constaté que WSS captée par l’endocarde via l’encoche signalisation initiés trabeculation.

Protocole

Les méthodes suivantes ont été réalisées dans le respect de protocoles UTA et UCLA IACUC. Ces groupes expérimentaux ont été utilisés avec transgéniques Tg(cmlc2:gfp), les mutants wea (atrium faible) ou clo (cloche) : (a) type sauvage (WT) contrôle, (b) gata1a MO et injections de (c) tnnt2a MO (tableau 1).

Modèle	Nom	Gènes modifiés	Phénotype	Référence
Contrôle	Type sauvage	Aucun	N/A
	TG(cmlc2:GFP)	Chaîne légère de la myosine cardiaque	Fluorescence verte spécifiquement exprimé dans le myocarde	34
Contrainte de cisaillement de mur une diminution	Mutant faible atrium (wea)	Chaîne de heacy la myosine spécifiques à Atrium	Atrium ne peuvent pas contracter, compact épais mur myocardique, lumen étroit, ventricule, atrium dilatée,	37
	Mutant de cloche (clo)	N/A	Retrait complet de l’endocarde, unaturally grand atrium avec petit ventricule, cushins cardiaque qui n’existe pas	41
	gata1a MO	gata1a	Anémie, un manque de globules rouges	4
	tnnt2a MO	tnnt2a		39
Contrainte de cisaillement mur accrue	OEB ARNm	Aucun	Polyglobulie sévère, augmentation du nombre de cellules sanguines, en circulation a augmenté de viscosité	6
	Isoprotenerol	Aucun	Augmentation du rythme cardiaque	7

Tableau 1 : Les descriptions de poisson-zèbre. Définitions et descriptions de poissons zèbres utilisés dans des expériences.

1. étudier le programme d’installation

1. Préparer Nrg1 et OEB ARNm pour le sauvetage de trabeculation.
   1. Obtenir des ADNc humain Nrg1 et amplifier d’un plasmide de donateurs.
      Remarque : L’ADNc humain Nrg1 était douée de William Talbot, de l’Université Stanford.
      1. Sortez les réactifs nécessaires et matériaux, nommément PCR mastermix (stockés à-20 ° C), amorces (voir tableau 2) (stockés à-20 ° C), une plaque PCR (conservée à température ambiante) et une pipette de 20 μL (conservée à température ambiante). Voir Table des matières pour les exemples de produits.
         
         Tableau 2 : Amorces pour le clonage d’êtres humains Nrg1 .
      2. Préparer le mastermix pour chaque amorce en trois exemplaires à l’aide de la pipette de 20 μL. Pour 1 ensemble de géométrie, utilisez 37,5 μL de la mastermix, 3 μL d’eau exempte d’ADN, 4,5 μL d’apprêt. Pour plus de géométrie, il suffit de multiplier par le nombre d’échantillons.
      3. Diluer la solution de travail humain Nrg1 cDNA (concentration de 20 ng/μg) dans la bande de primaire avec de l’eau sans ADN afin qu’il y a 10 μL total / puits par échantillon.
         Remarque : Veiller à ce que chaque solution sous étape 1.1.1 est répartie uniformément. Pour cela mélangez chaque solution en pipettant également de haut en bas. Pour éviter la contamination croisée, utiliser un embout de la pipette pour un échantillon seulement.
      4. Aliquoter le cDNA Nrg1 avec la pipette multicanaux de 10 μL à désiré puits de la plaque de la PCR.
      5. Ajouter 14,5 μL de la mastermix à l’ADNc dans les puits. Appliquer une collant de la couverture sur la plaque PCR pour sceller les puits et placer dans la machine PCR.
      6. Démarrage de la machine PCR et veiller à ce que le cycle atteint une température appropriée selon les enzymes et les amorces utilisées.
   2. Cloner l’ADNc Nrg1 dans le Bureau2 plasmidique⁺ sur les sites BamHI et EcoRI utilisant des enzymes excès BamHI et EcoRI pour assurer l’ADNc est ligaturé dans tous les plasmides.
      1. Mélanger l’ADNc Nrg1 avec le donateur Bureau2 plasmidique⁺, disponible dans le commerce master mix solution et amorces (tableau 2).
         Remarque : Le volume de réaction totale doit être 50 μL avec 25 μl du mélange principal, 3 μL d’amorces et 1 μL de plasmide 20 ng/μL donneur Nrg1 cDNA.
      2. Placez le mélange de l’étape 1.1.2.1 dans la machine PCR et définir les paramètres pour répondre aux spécifications suivantes : 98 ° C pour 10 s 55 ° C pendant 5 ou 15 s et 72 ° C pendant 5 s/Ko.
      3. Purifier le produit de la PCR à l’aide d’un kit de purification suivant les instructions du fabricant. Éluer le produit en 50 μL de tampon d’élution.
      4. Digérer le produit PCR purifié et 5 μg de Bureau2⁺ avec BamHI et EcoRI séparément à 37 ° C pendant 2 h dans un volume réactionnel de 200 μl. Purifier la digestion qui en résulte avec une trousse commerciale et éluer à 20 μL et 100 μL de Tris-HCl (pH 8,5), respectivement.
      5. Ligaturer 4 μL de Nrg1 ADNc et 2 μL de la Bureau2 digérées⁺ plasmide dans une 25 μL réaction avec 1 μL d’un catalyseur de ligase à 16 ° C durant la nuit.
         Remarque : La procédure peut être arrêtée ici pour une nuit d’incubation.
      6. Utiliser 2 μL de la solution de la ligature de l’étape 1.1.2.5 transform dans 50 μl de cellules de bactéries e. coli adaptés pour le clonage (voir Table des matières).
   3. Confirmer que la transformation a eu lieu par dépistage que l’ADNc Nrg1 clones par PCR. Choisir au hasard les clones et les ajouter à une solution des amorces spécifiques, polymérase et triphosphates de désoxyribonucléotides (dNTPs).
      Remarque : Les contrôles ont été le vecteur (Bureau2⁺) avec et sans l’insert (ADNc humain). Ne prenez pas trop grande d’une colonie, parce que les bactéries excessives peuvent inhiber la PCR.
      1. Prélever 8 colonies de la transformation et l’écran Bureau2⁺-Nrg1 clones en utilisant les amorces PCR du tableau 2.
      2. La culture d’un clone avec l’ADNc Nrg1 pour isoler le Bureau2⁺-Nrg1 ADN plasmidique. Ensemencer avec 100 μL de bactérie e. coli avec Bureau2⁺-Nrg1 plasmide dans 100 mL de LB médias et culture en secouant (160-225 tr/min) à 37 ° C.
   4. Transfecter Bureau2 purifiée⁺-Nrg1 plasmide dans les cellules HEK-293 cellules dans une plaque de 6 puits à l’aide d’un réactif de transfection commerciale suivant les instructions du fabricant.
   5. 24h après la transfection, lyser les cellules à l’aide d’un tampon de lyse et traversent un gel SDS-PAGE, transfert sur une membrane de gel et puis tache avec anti-Nrg1 anticorps²². Vérifier l’expression de la protéine Nrg1 utilisant un Western Blot.
      Remarque : Le contrôle est un vide Bureau2⁺ plasmide. Peut être suspendu ici en cas de transfert de membrane de gel durant la nuit.
   6. Synthétiser les ARNm Nrg1 à l’aide d’un produit commercial semblable à celui de la Table des matières et suivez les instructions du fabricant.
      1. Prendre 5 μL de la Bureau2⁺-Nrg1 l’ADN de la culture de bactéries isolées et digest avec NotI dans une réaction de 200 μL pendant 2 h à 37 ° C pour linéariser le plasmide.
      2. Purifier le plasmide linéarisé avec une trousse commerciale et éluer à 20 μL de Tris-HCl (pH 8,5).
      3. Conduite en vitro transcription avec un kit d’isolation ARN commerciale dans une réaction de 20 μL utilisant 5 μL du plasmide linéarisé suivant les instructions du fabricant.
      4. Ajouter que le in vitro transcrit Nrg1 à 350 μL de tampon de lyse RNA et ensuite purifier avec un kit d’isolation d’ARN. Éluer la RNA dans 60 μL de Tris-HCl (pH 8,5).
      5. Mesurer la concentration en ARN et stocker à-80 ° C pour une utilisation future.
   7. Suivez les étapes 1.1.6.1 - 1.1.6.5 ci-dessus pour la cDNA de l’OEB et la préparation de l’ARNm mais le clone l’ADNc dans le plasmide Bureau2 + EcoRI et XhoI sites au lieu de cela.
2. Injecter Morpholino zebrafish
   1. La conception²³ les injections de MO à l’aide d’un outil en ligne (Table des matières) contre la séquence de l’ATG gata1a⁴ (5′-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3′) et tnnt2a⁵ (5′-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3′).
   2. Ajouter gata1a et tnnt2a MO séparément à l’eau exempte de nucléase à rendre la concentration finale de 8 ng/nL et 4 ng/nL, respectivement. Répéter avec l’OEB ARNm avec une concentration finale de 20 pg/nL. Assurez-vous que le volume final est de 1 mL.
   3. Injecter 1 nL de la 8 ng/ml d' gata1a MO et 1 nL de la 4 ng/nL de tnnt2a MO dans des embryons de poisson zèbre séparé 1 à l’étape 4 cellules pour réduire la paroi ventriculaire contrainte de cisaillement (WSS)²⁴. Pour augmenter le WSS, injecter 1 nL de 20 pg/ml d’EPO ARNm⁶ dans les embryons de poisson-zèbre à l’étape 1 à 4 éléments.
3. Traiter chimiquement zebrafish pour inhiber les trabeculation
   1. À l’aide d’une pipette 20 mL, diluer la AG1478 10 mg/mL dans le DMSO de 1 % en moyenne de E3 à une concentration finale de 5 μM à 30 hpf dans un tube de 15 mL. Comme contrôle, traiter chaque poisson avec 1 % DMSO uniquement.
   2. Ajouter ester de t-butyle N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine (DAPT) dans le 1 % DMSO (100 μM) au milieu de l’E3 dans un tube de 15 mL pour inhiber la signalisation Notch à 40 hpf de manière similaire. Comme contrôle, traiter avec seulement 1 % DMSO.

2. Techniques d’imagerie

1. LSFM cardiaque 4D Imaging avec algorithme de synchronisation
   1. Prenez des images 2D de l’embryon des poissons entiers multiples cardiaque battant cycles en suivant les étapes ci-dessous (Figure 1). Assurez-vous que l’épaisseur de la feuille de lumière est environ de 5 μm. Prendre 500 images de x-y avec un temps de pose de 10 ms. ensemble le z-balayage à 1 μm pour l’échantillonnage numérique sans perte selon le principe de l’échantillonnage Nyquist²⁵.
      1. Créer un gel d’agarose de 1 % (p/v) en ajoutant 1 g d’agarose à 100 mL et chauffer jusqu'à ce que tous les agarose est dissoute. Charger un petit tube en plastique avec l’embryon et l’agarose à l’aide d’une pipette 20 μL et fixez-le sur la scène.
      2. Ouvrez l’image logiciel de visualisation, puis cliquez sur Live pour voir l’affichage en direct de l’échantillon. Ajuster l’objectif à l’aide du bouton afin que l’échantillon est mise au point. De même, déplacer la scène jusqu'à ce que l’affichage en direct de l’échantillon indique la partie supérieure de l’embryon.
      3. Prendre des images de 500 fois pendant 5 s au grossissement de 10 X à l’aide du microscope logiciel²⁶.
      4. Déplacer la scène en utilisant le moteur dans un nouveau calque (1 μm de l’axe z) et répéter la procédure d’imagerie.
      5. Répétez les 2 étapes ci-dessus jusqu'à ce que le coeur entier est entièrement imagée.
   2. Assurer l’intégrité des données en négligeant les images de premier et dernier cycle cardiaque. Trouver la période du cycle cardiaque en faisant correspondre les images qui ont été prises au même moment dans le cycle cardiaque, mais à des époques différentes. Utiliser l’équation suivante qui a été développée pour trouver la période :
      (1)
      où D est la fonction de coût utilisée pour fixer une hypothèse de l’époque, je_m l’image capturée, τ' le temps l’image a été capturée, z_k l’indice z-direction de l’image, x,_m est la vecteur de l’indice de pixel, et T' est l’hypothèse de périodique.
   3. Utilisez l’équation suivante pour trouver le déplacement relatif entre les deux images dans des stades semblables :
      (2)
      où Q_{k', k} dénote une fonction de coût pour le déplacement relatif, R est le quartier spatial possible, L est la durée totale de la capture de l’image, la x est pixel index, z_k et z_k' sont les tranches de première et deuxième axe z, t est le temps et s est l’hypothèse du déplacement relatif.
   4. Convertir le déplacement relatif au décalage absolu en ce qui concerne la première image et résoudre l’équation linéaire à l’aide de l’approche Pseudo-inverse, pour trouver la relation absolue pour aligner la section suivante d’images, comme décrit précédemment²⁷.
   5. Au final des images 4-D ont été traitées à l’aide de logiciels de traitement d’image (Table des matières).
      1. Empilement des images 2D en 3D
         1. Ouvrez une logiciel de traitement d’image commerciale.
         2. Cliquez sur Open Data.
         3. Sélectionnez toutes les images à être empilés en 3-d > cliquez sur Load.
         4. Ajouter de la taille du voxel de 0,65 x 0,65 x 1 > cliquez sur OK.
         5. Cliquez sur la zone de Multi-Planar affichage pour visualiser l’image en 3D.
         6. Faites un clic droit de la boîte bleue slice_1.tiff > sélectionnez affichage > sélectionnez Volren.
         7. Cliquez sur modifier > sélectionner Options > sélectionnez modifier la palette des couleurs.
         8. Ajuster la couleur en utilisant les boîtes de contour rouge > cliquez sur OK.
      2. Conversion 3D en 4D
         1. Cliquez sur "fichier > ouvrir les séries chronologiques.
         2. Sélectionnez le TIFF 3D qui ont été faites juste > cliquez sur Load.
         3. Entrez la même taille de voxel qu’avant.
         4. Faites un clic droit de la boîte bleue slice_1.tiff > sélectionnez «affichage» > sélectionnez Volren.
         5. Cliquez sur modifier > sélectionner Options > sélectionnez modifier la palette des couleurs. Ajustez la couleur en utilisant les cases > cliquez sur OK.
         6. Faites un clic droit de Commande série Time > cliquez sur Movie maker > Appuyez sur le bouton lecture pour regarder le film.
         7. Ajouter un nom de fichier, taille de l’image, cadence qualité égale à 1, tapez monoscopique > cliquez sur Apply
         8. Exporter la vidéo. Ouvrir la vidéo dans un logiciel approprié.

3. analyse qRT-PCR

1. Poisson zèbre ARN afin de quantifier des ligands Notch, récepteurs, de coeur et cibler les expressions des gènes
   1. Sacrifier le poisson-zèbre en les soumettant à une surdose de tricaïne metoksid^28,29. En utilisant un protocole décrit précédemment³⁰, le cœur de poisson-zèbre ont été excisé et préparé pour l’ARN.
   2. Isoler l’ARN total et de synthétiser l’ADNc grâce au kit de synthèse de cDNA suivant les instructions du fabricant.
   3. Concevoir les amorces PCR pour les ligands Notch Jag1, Jag2, Dll4, récepteurs Notch1bet signalisation liés gènes Nrg1 et ErbB2. Voir le tableau 3 pour les amorces, nous avons utilisé.
   4. Ajouter les amorces de l’étape 3.1.3, l’ARNm isolé de l’étape 3.1.2 et un mastermix commercial jusqu'à la tôle de la PCR. Exécutez le qRT-PCR aux températures appropriées et heures selon les enzymes utilisées. Normaliser les résultats à l’actine α poisson zèbre.
      Remarque : Cela va calculer les niveaux d’expression pour chacun des gènes, récepteurs et ligands.

4. des expériences in vitro humain cellules endothéliales aortiques (HAEC)

1. Modèle de la contrainte de cisaillement dynamique
   1. Cellules en culture HAEC avec HAEC milieux de culture. Une fois entièrement confluentes, exposer les cellules à flux laminaire et flux pulsatile de 23 x 10^-5 N à la fréquence de 1 Hz pendant 24 h.
      1. EC d’échauffement médias/DMEM 10 % FBS dans une eau de bain pendant 20 min.
      2. Récupérer des cellules HAEC du réservoir d’azote liquide et placez le flacon dans le bain d’eau jusqu'à ce que fondu.
      3. À l’aide d’une pipette μL 1 000, enlever les cellules décongelées et mettez-les dans un tube de 15 mL avec 3 à 5 mL de médias. Centrifuger la solution cellulaire à 53 x g pendant 3 min.
      4. Aspirer la solution large et ajouter assez de médias pour un volume total de 10 mL. Verser la solution de cellule dans une fiole de T75 stérile, cap le ballon et distribuer les cellules uniformément sur le fond de la plaque.
      5. Marquer la fiole avec initiales, date, type de cellule et le numéro de passage. Incuber le ballon à 37 ° C, 5 % de CO₂, jusqu'à ce que les cellules sont 80 % anastomosé. N’oubliez pas de changer les médias tous les 2-3 jours.
      6. À l’aide d’une pompe commerciale, raccorder la tubulure au ballon et réglez les paramètres mentionnés ci-dessus dans l’étape 4.1.1^31,32,33.
   2. Ajouter GI254023X à 50 mL de milieu, HAEC à une concentration finale de 5 μM pendant 30 min.
   3. Avec le prémélange GI254023X, un inhibiteur de l’ADAM10 qui supprime l’encoche de signalisation, mener le même flux laminaire ou expériences de flux pulsatile comme dans 4.1.1.
   4. Quantifier les ligands Notch (Jag1, Jag2 et Dll4) et les gènes cibles de Notch (poilu et exhausteur de split [Hes]) par qRT-PCR pour quatre groupes d’échantillons HAEC (hotte à flux laminaire, hottes à flux laminaire + GI254023X, flux pulsatile, pulsatile flow + GI254023X) décrit précédemment³².

5. le sauvetage et la surexpression de la signalisation Notch

1. Injecter 1 nL de l’ARNm de Nrg1 préparés à une concentration de 5 pg/nL (de l’étape 1.1.6) à l’étape 1 à 4 éléments avec le gata1a MO pour surexprimer Notch cible gènes²⁴.
2. Injecter 1 nL de l’ARNm Nrg1 dans wea mutant dans une semblable manière²⁴.
3. Double la concentration de l’ARNm Nrg1 (10 pg/nL) et injecter²⁴ 1 nL dans le poisson-zèbre, d’observer la morphologie ventriculaire.
4. Injecter 1 nL de la 20 pg/BN d’EPO ARNm⁶ dans les embryons de poisson-zèbre à l’étape 1 à 4 éléments pour augmenter l’hématopoïèse pour augmenter ventriculaire WSS aussi déjà montré²⁴.
5. Injecter 1 nL de 50 μM isoprotérénol⁷, ce qui augmente le taux de la contractilité dans le milieu de l’E3 pour 24h tout en poisson zèbre sont cultivées comme démontré précédemment²⁴.
6. Effectuer l’imagerie 4D LSFM pour chaque groupe. Suivez les instructions de mesures 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. quantification de la fraction de raccourcissement et le volume de changement au fil du temps

1. Effectuer l’imagerie 4D LSFM pour chaque groupe de 50, 75 et 100 hpf. Suivez les instructions de mesures 2.1.1-2.1.5.2.8. Divisez chaque image donc chacun a 600 nœuds pour la réplication de la motion de la paroi cardiaque.
2. Mesurer le changement de diamètre du ventricule pendant la diastole et la systole à l’aide de la formule suivante :
   (3)
   Charger des images 3D ventriculaires à chaque 0,1 s avec logiciel de visualisation et de mesure du volume.
3. Tracer le changement de volume au fil du temps pour chaque groupe expérimental à 75 hpf et 100 hpf.

Résultats

LSFM servait dans ce manuscrit afin d’acquérir des images 2D et 3D haute résolution. Comme le montre la Figure 1 a et 1 b, l’objectif de l’illumination dirige la nappe de lumière à l’échantillon. En raison de la minceur de la nappe de lumière, seulement un seul plan est éclairé. La lentille de détection est placé perpendiculairement à l’objectif de l’illumination et se concentre sur le plan lumineux (Figure 1 b)....

Discussion

Dans ce protocole, nous avons démontré que l’imagerie 4D peut être utilisé pour suivre le développement d’un réseau trabéculaire en réponse à l’évolution des forces biomécaniques. En particulier, la contrainte de cisaillement expérimentés par les cellules endothéliales initie l’encoche signalisation cascade, qui à son tour favorise la trabeculation. Dans ce manuscrit, nous avons démontré que (1) injection de gata1a MO a diminué l’hématopoïèse et donc il a réduit la contrainte de cisaillement mur, (2) tnnt2a<...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pré-mixage PCR Clontech Hifi  ;	Takara  ;	639298	PCR mastermix 1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Humain Nrg1 ADNc	Don de William Talbot, Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis N	/A	Utilisé pour le sauvetage en trabéculation 1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect&trade ; Système de détection PCR en temps réel	Bio-Rad	1855201	1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+	GE Health		Plasmide utilisé pour synthétiser l’ARNm 1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Kit de purification de nucléospines  ;   ;	Clontech	740609.25	Purification de l’ADN 1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 ADN ligase  ;	Clontech	2011A	PCR Solution de ligature 1.1.2.5
Cellules compétentes stellaires	Cellules	636763	E. coli utilisées pour la transformation 1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 réactif de transfection	Life Technologies	11668027	Réactif de transfection 1.1.4
mMessage SP6 kit	Invitrogen	AM1340	Kit utilisé pour synthétiser l’ARNm 1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit	Bio-Rad	7326820	Purifie l’ARN  ; 1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8	GeneTools	N/A	Logiciel pour la conception d’amorces 1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA	Biogene	CDFH006026	Augmente WSS 1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478	Sigma-Aldrich  ;	T4182	Inhibiteur d’ErbB 1.3.1
Milieu			E3 Pour la croissance des embryons 1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT	Sigma-Aldrich  ;	D5942	&gamma ;-inhibiteur de la sécrétase 1.3.2
Agarose  ;	Sigma-Aldrich  ;	A9539	Utilisé pour le montage d’embryons 2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT  ; Caméra CMOS numérique	Hamamatsu Photonics	C11440-42U	Utilisé pour capturer des images 2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software	FEI Software	N/A	Visualisation et analyse des images en 3D, et 4D 2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  ;	Sigma-Aldrich  ;	886-86-2	Utilisé pour la sédation humaine ou le sacrifice d’embryons 3.1.1
Kit de synthèse d’ADNc iScript	Bio-Rad	1708890	synthétise l’ADNc 3.1.2
Microcentrifugeuse Eppendorf 5424	Eppendorf	05-400-005	Microcentrifuge 4.1.1.3
GI254023X	Sigma-Aldrich  ;	260264-93-5	Inhibiteur d’ADAM10 4.1.2, 4.1.3  ;
Chlorhydrate d’isoprénaline	Sigma-Aldrich  ;	I5627	L’isoprotérénol augmente WSS 5.1.5
MATLAB	Mathworks	N/A	Analyse de la mécanique cardiaque