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Article de méthode

Évaluation de la résistance aux inhibiteurs de Tyrosine Kinase par un interrogatoire des voies de Transduction de Signal par les alignements d’anticorps

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DOI :

10.3791/57779

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19 septembre 2018

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1Lawrence J. Ellison Institute for Transformative Medicine, Center for Applied Molecular Medicine, University of Southern California

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour les alignements d’anticorps identifier les altérations dans les voies de signalisation dans divers modèles cellulaires. Ces changements, causées par les médicaments/hypoxie/ultra-ultra-violet lumière/rayonnement, ou par surexpression/régulation/débouchures, sont importants pour les différents modèles de la maladie et peuvent indiquer si une thérapie sera efficace ou peut identifier des mécanismes de médicaments résistance.

Résumé

Patients atteints de cancer avec une régulation aberrante des réseaux de la phosphorylation de protéines sont souvent traités avec des inhibiteurs de tyrosine kinase. Près de 85 % de taux de réponse sont communs. Malheureusement, les patients deviennent souvent réfractaires au traitement en altérant leurs voies de transduction de signal. Une implémentation du profilage de l’expression avec puces peut identifier les modifications dans l’ensemble au niveau des ARNm et protéomique peut identifier l’évolution globale des niveaux de protéine ou permet d’identifier les protéines impliquées, mais l’activité de la transduction du signal les voies ne peuvent être établies qu’en interrogeant les modifications post-traductionnelles des protéines. Par conséquent, la capacité d’identifier si un traitement médicamenteux est réussi ou si la résistance s’est posée, ou la possibilité de caractériser toute modification dans les voies de signalisation, est un défi clinique important. Ici, nous fournissons une explication détaillée des alignements d’anticorps comme un outil qui peut identifier les altérations systémiques aux diverses modifications post-traductionnelles (par exemple, la phosphorylation). Un des avantages de l’utilisation des alignements d’anticorps comprend leur accessibilité (un tableau ne nécessite pas un expert en protéomique ou équipement coûteux) et la vitesse. La disponibilité de tableaux ciblant une combinaison de modifications poteau-de translation est la principale limite. En outre, des approches non biaisées (phosphoprotéomique) peuvent être plus appropriés pour la découverte, tandis que les alignements d’anticorps sont idéales pour les cibles plus largement caractérisés.

Introduction

L’application clinique des inhibiteurs ciblées tyrosine kinase (TKI) a transformé le traitement du cancer en fournissant aux médecins des outils efficaces pour cibler les protéines spécifiques cette transformation néoplasique en voiture. Ces composés inhibent ou bloquent la phosphorylation des protéines ciblées par la tyrosine kinases1,2. Inhibiteurs ont été développées en partie parce que les altérations génétiques dans clé de différents gènes de signalisation ne suffisent pas à déclenchement du cancer en voiture et de progression [par exemple, récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), proto-oncogène tyrosine-protéine kinase Src (SRC), BCR-ABL et récepteur de facteur de croissance épidermique humain (HER2) de 2]3,4. L’impact de cette sur le cycle cellulaire5 et signalisation moléculaire voies6 représente une transformation de la non ciblés pour le traitement du cancer moléculairement guidées. L’avantage majeur d’utilisation par rapport à la chimiothérapie est le taux d’augmentation de la réponse et le moindre risque de toxicité pour les cellules saines,7. En conséquence, il a augmenté l’attention sur la recherche et le développement de nouveaux inhibiteurs.

Accès aux résultats de séquençage génomique a commencé avec le projet du génome humain8,9,10 et se poursuit aujourd'hui avec divers nouvelle génération (NextGen) cancer du séquençage efforts [par exemple, le génome du Cancer Atlas (TCGA)11,,12]. Cela a inspiré de nombreuses méthodologies expérimentales qui informent simultanément sur des milliers de gènes et/ou fournissent impartiales instantanés de gènes ou de protéines modulées par des perturbations biologiques13. Étant donné que la régulation de la fonction cellulaire se situe à plusieurs niveaux, de la transcription des gènes à la modification post-traductionnelle des protéines et leur activité, une compréhension complète des événements contrôlant la fonction cellulaire sera en fin de compte nécessite une intégration des données provenant de diverses lectures biologiques. La capacité de surveiller les niveaux d’ARN messager (ARNm) de milliers de gènes avec une résolution de cellule unique gène a augmenté la capacité de tirer des conclusions sur la fonction des gènes et les interactions à l’échelle du génome entier. Toutefois, l’interprétation des tableaux d’expression de gène sera toujours par nature incomplète sans l’intégration des autres niveaux de régulation : à savoir, les niveaux d’expression de protéine, les États de modification de protéine et la protéine post-traductionnelles modifications (phosphorylation, ubiquitination, méthylation, etc.). Nous décrivons ici l’utilité des alignements d’anticorps comme moyen pour interroger les modifications post-traductionnelles des éléments importants de la signalisation en fonction des diverses conditions dans une seule expérience14,,15, 16.

Tableaux de phospho-anticorps peuvent être utilisées pour distinguer et d’analyser les changements dans le signal transduction pathways16. Ceux-ci peuvent en découler une modification génétique ou traitements de lignées cellulaires avec les inhibiteurs de la kinase, agents chimiothérapeutiques, stress causé par la famine privation, hypoxie ou le sérum de glucose. Remarque, la résistance aux médicaments ou un gène spécifique up - ou diminution de l’expression peut aussi provoquer des changements dans le signal transduction pathways17.

La résistance aux médicaments, par exemple, peut en découler des mutations de la cible de médicaments pour éviter la sensibilité. Dans le cancer du poumon, connu des mutations EGFR rendent le cancer aide à certains inhibiteurs, mais plus sensible aux autres. Alternative, voies de signalisation peut être activé à la mutation17. Comme une application plus large pour l’identification des voies de transduction du signal impliqués dans la résistance et l’hypoxie, etc., tableaux de phospho-anticorps donnent un aperçu plus, et par conséquent comprendre, les mécanismes impliqués.

Les technologies qui permettent une évaluation des modifications protéiques représentent une composante importante de la biologie des systèmes parce qu’ils ont souvent une fonction de réglementation, comme la modulation de l’activité d’une enzyme ou les interactions physiques entre les protéines. L’importance des modifications post-traductionnelles est illustrée par le rôle de la phosphorylation de la protéine dans presque tous les extracellulaire déclenchée signal transduction pathways18. Traditionnellement, l’identification de kinases ou de l’état de phosphorylation de protéines pourrait également déterminer par analyse par Western blot, surtout si le chercheur est intéressé par seulement 1 – 5 cibles. Cependant, transferts Western sont très sélectives et peuvent être biaisés vers une connaissance préalable et pourraient manquer des cibles importantes en conséquence. Anticorps ou les baies offrent un affichage du débit moyen de cibles multiples en incorporant divers anticorps de capture [pan-spécifique tyrosine(s) phosphorylé, anti-ubiquitine, etc.], sur une matrice solide (par exemple, verre ou nitrocellulose). Anticorps secondaires des renseignements sur les protéines spécifiques dans un "sandwich" ELISA format (Figure 1). Ce test devient plus puissant et plus pertinentes comme plus de cibles sont d’intérêt ou la connaissance préalable est restreinte15. Les phospho-tableaux sont plus largement apte au travail parce qu’elles peuvent comparer la phosphorylation ainsi que des quantités générales de protéines d’une plus grande variété de cibles dans une expérience et une quantification nettement améliorée au cours de spectrométrie de masse. Cette technique n’est pas applicable à l’identification des sites de phosphorylation nouveaux ou inconnus auparavant.

Protéomique de basé sur la spectrométrie de masse à grande échelle pourrait être employés pour identifier les sites spécifiques de la phosphorylation de protéines19. Bien que cette technique peut énumérer plusieurs milliers d’événements post-traductionnelles, requiere instrumentation coûteuse, les pipelines expérimentales dédiées et une expertise informatique qui sont hors de portée de la plupart des chercheurs.

Alignements d’anticorps fournissent une lecture simultanée sur différentes protéines lectures16. Il peut s’agir de changements dans la protéine non-dégradante (tableau d’ubiquitine) ou la phosphorylation. Le principal avantage de cette technologie est qu’elle fournit des informations essentielles sur l’état biologique des diverses voies biologiques associés aux paramètres cellulaires importants (protéine de 53 kDa, p53, tyrosine kinase et voies intracellulaires) en même temps. En outre, il est possible de combiner différents types de tableaux afin d’accroître la pénétration d’un test (p. ex., l’apoptose et ubiquitine et phosphorylation). Cette capacité à combiner plusieurs baies afin d’évaluer diverses modifications post-traductionnelles dans plusieurs échantillons simultanément d’une façon temps - et rapport coût - entrée qui ne nécessite pas d’instrumentation spécifique ou une expertise revêt un avantage significatif dans le cas des alignements d’anticorps.

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Protocole

1. Extraction des protéines

  1. Plaque de 5 x 106 cellules sur une plaque de culture de tissu de 10 mm (ou ballon) dans une hotte de culture de tissus. Compter les cellules au moment de l’ensemencement avec un compteur de cellules automatique ou un hémocytomètre. Par ailleurs, estimer le nombre d’éléments.
  2. Rincer les cellules cultivées sur la plaque de 10 mm (ou ballon) soigneusement 3 x 10 ml d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH = 7,4). Assurez-vous de retirer tous les PBS avant d’ajouter le tampon de lyse.
    Remarque : Le tampon de lyse est généralement fournie avec le kit. Si ce n’est pas le cas, puis utilisez un tampon d’immunoprécipitation (RIPA) ou tout autre tampon de lyse cellulaire contenant un cocktail d’inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase.
  3. Lyse 1 x 107 cellules/mL de cellules dans le tampon de lyse en ajoutant la quantité correcte de la mémoire tampon vers les cellules et racler les cellules avec un grattoir de cellules dans le tampon de lyse. (par exemple, pour les cellules HeLa et MiaPaCa-2, utilisez 600 µL par plaque de 10 cm).
  4. Pipeter le lysat de haut en bas (environ 10 x) et transférez-le dans un nouveau tube de 1,5 mL.
  5. Incuber les lysats pendant 30 min à 4 ° C, de préférence sur un rocker/shaker. Appuyez sur le lysat grâce à une seringue avec une aiguille de 27 G pour 10 x assurer une bonne perturbation de la cell membrane(s). Sinon, laisser agir le lysate. Stocker les lysats à-20 ° C ou utilisez-les immédiatement.
  6. Centrifuger le lysat à 14 000 x g à 4 ° C pendant 15 min et transférer le surnageant dans un tube propre 1,5 mL.
  7. Doser la quantité de protéines totales par bicinchoninic acid test (BCA)20 ou un équivalent comme Lowry ou Bradford et continuer avec au moins 50 à 400 μg. Utiliser les protéines immédiatement ou partie aliquote et gel/magasin à-70 ° C (éviter de multiples cycles de gel-dégel).

2. humain Phosphokinase Array

  1. Ramener tous les réactifs à température ambiante avant de commencer (pendant environ 1 h).
    Remarque : Tous les réactifs et l’usure en plastique sont inclus dans le kit.
  2. Préparer tous les frais de réactifs (tampons de tableau) avant d’entamer la procédure en suivant les instructions du fabricant (selon le choix des cibles/baies, les instructions peuvent varier légèrement).
  3. Reconstituer les cocktails d’anticorps de détection dans 100 μL d’eau désionisée ou suivez les instructions du fabricant devraient elles diffèrent pour le tube à essai 1,5 mL fourni.
  4. Préparer 1 x tampon de lavage par dilution 40 mL de 25 x tampon de lavage en 960 mL d’eau désionisée et mélanger par retournement.
    Remarque : Les cristaux se dissoudre à température ambiante. Le tampon peut jaunir avec le temps mais fonctionne toujours.
  5. Pipette 1 mL de tampon de tableau 1 dans chaque puits d’un multi-plateau 8 puits (ou 2 mL dans un multi-plateau 4 puits).
  6. Avec embout plat pince à épiler, retirer les membranes de tableau entre les feuilles protectrices et placez-les dans les puits. Assurez-vous que les numéros sur la membrane sont vers le haut.
    Remarque : Lors de l’immersion, la teinture sur la membrane va disparaître.
  7. Recouvrir le plateau avec un couvercle et laisser incuber à elle sur un agitateur basculant de la plate-forme pendant 60 min à température ambiante.
    NOTE : Ceci est l’étape de blocage de membrane.
  8. Au cours de la période d’incubation, préparer les échantillons de protéine. Ajouter 50 à 100 μg de protéines totales. Diluer le lysat, d’un volume maximal de 334 μL, avec tampon de lyse pour un volume final de 1 mL.
    Remarque : 50 à 100 μg de protéines totales suffit généralement.
  9. Aspirer le tampon de tableau 1 soigneusement et incuber les membranes avec 1 mL des échantillons du jour au lendemain à 2 et 8 ° C sur un agitateur basculant de la plate-forme.
    Remarque : Ne pas touch/scratch les membranes.
  10. Le lendemain, laver le tableau par soigneusement retirer chaque tableau et en le plaçant dans des récipients en plastique individuels (environ 8 x 11 cm2) avec 20 mL de tampon de lavage 1 x. Laver les membranes 3 x 10 min sur une plate-forme bascule en 1 x tampon de lavage à température ambiante.
  11. Distribuer 20 μL de l’anticorps reconstitué cocktail d’après l’étape 2.3 à 1 mL de 1 x tampon de tableau 2. Ajouter 1 mL de cette solution dans chaque 8 puits à utiliser.
  12. Retirer délicatement les membranes des bacs de lavage. Épongez le bord inférieur sur le papier absorbant pour enlever n’importe quel tampon de lavage excessif et les transférer vers le bac contenant les cocktails d’anticorps. Recouvrir le plateau avec le couvercle et il incuber pendant 2 h à température ambiante sur une plate-forme bascule. Rincez les plateaux utilisés avec dH2O et les faire sécher pour un usage ultérieur.
  13. Retirer chaque tableau soigneusement et placez-les dans les contenants en plastique propre individuels (environ 8 x 11 cm2) avec 20 mL de tampon de lavage 1 x. Laver 3 x 10 min avec le tampon de lavage sur une plate-forme bascule à température ambiante.
  14. Diluer la Streptavidine-HRP (fourni avec le kit) ou streptavidine-fluorescent de colorant (pour une détection plus quantitative) 1 : 1 000 à 1 x tampon de tableau 2 dans un tube de 15 mL.
  15. Les membranes de retour dans les plats de 8 puits contenant la solution HP et les incuber 30 min à température ambiante sur une plate-forme bascule (si l’utilisation de fluorescence, le plateau en papier d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière).
  16. Enlever l’excès de tampon en plaçant la membrane entre 2 morceaux de 5 mm de papier de 3 M. Pour l’imagerie avec un imageur chimiluminescent/film de rayons x, incuber les membranes séchées avec une solution de détection HRP (mélangez les deux solutions de chimiluminescence 1:1) pendant 3 min et placer la membrane dans un protecteur de feuille en plastique transparent.
    NOTE : Eau séchée peut également être placé dans un imageur fluorescent pour détecter le signal fluorescent ; minimiser l’exposition à la lumière de la membrane avant l’imagerie. Pour une quantification des fichiers x-ray film ou imager, éviter une surexposition. La plupart des imageurs chimiluminescent/fluorescent ont une fonction pour éviter une saturation du signal.

3. analyse des données

  1. Télécharger ImageJ, une programme21, de traitement d’image et installer le logiciel.
  2. Ouvrez ImageJ en double-cliquant sur l' « Icône ImageJ ». Sélectionnez l’image à analyser en cliquant sur « Fichier » dans la barre de menus, puis sélectionnez « Ouvrir » dans le menu déroulant et parcourir les fichiers de l’ordinateur pour l’image d’intérêt. Cliquez sur le fichier pour l’ouvrir.
  3. Inverser l’image pour l’analyse (taches noires sur fond blanc à taches blanches sur fond noir) en cliquant sur « Modifier » dans la barre de menu et en sélectionnant « Inverser » dans le menu déroulant.
  4. Sélectionnez l’icône de « ovale » de la barre d’outils (la deuxième option dans la barre d’outils ImageJ). Dessinez un cercle/ovale en cliquant sur la photo (croix noire) et en déplaçant la souris. Ajuster la taille/forme le cercle/ovale d’encercler les points sur la tache de la dot.
  5. Cliquez sur « Analyser » dans la barre de menus, puis sélectionnez « Mesure » dans le menu déroulant s’ouvre automatiquement une nouvelle fenêtre avec les valeurs de la zone sélectionnée (zone, moyenne, minimum et maximum).
  6. Déplacer la zone circulaire en faisant glisser le cercle du Centre (mis au point de la droite de la flèche au milieu) et les placer autour de la prochaine zone de mesure (dot). Mesurer tous les points d’intérêt, le contrôle positif, le témoin négatif et le fond pour l’analyse.
    Remarque : Le témoin négatif est le PBS, le fond est une partie de la membrane sans n’importe quel endroit (n’importe quelle partie fera l’affaire), et le contrôle positif est un contrôle fourni par le fabricant.
  7. Sélectionnez les points de contrôle négatif de PBS et soustraire la valeur de chaque tache. Moyenne de l’intensité pour chaque paire de taches en double, ce qui représente chaque récepteur tyrosine kinase (RTK). Chaque intensité moyenne peut être liée à la commande pour calculer la variation de pli.

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Résultats

Pour étudier l’effet de résistance TKI sur des voies de transduction de signal dans les lignées cellulaires, quatre échantillons ont été analysés. Un témoin (H3255r1) et 3 lignées TKI résistant (H3255r2-4) (Figure 2) sont liées au modèle spot anticorps (Figure 3). Tous les 4 échantillons ont été préparés à l’aide de ce protocole. Six phosphoprotéines avec activité différentielle ont été choisis pour la démonstration de l’analyse ...

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Discussion

Les approches qui combinent plusieurs lectures biologiques sont des représentations intrinsèquement plus précises de la machinerie cellulaire dans une expérience effectuée. L’avènement des alignements d’anticorps phospho permet une caractérisation rapide de la configuration des modifications qui peuvent être plus informatif que le statut de modification d’une seule protéine. Le déroulement général de l’application des tableaux de phospho-anticorps est basé sur une modification en sérine, thréonine ou tyrosine. Cet exempl...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants pour le soutien financier généreux de la Lawrence J. Ellison Institute of Transformative Medicine de l’USC (un cadeau à David Agus). Nous apprécions le soutien de l’automne Beemer et Lisa Flashner conduisant à la génération et la publication de ce manuscrit. Nous remercions Laura Ng pour son soutien administratif.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Odysee SA ImagerLi-Cor BiosciencesFluorescent Imager
Tube de 1,5 mLEppendorf22363212
ScraperFalkon (Corning)353085
Phosphate Buffered Saline (PBS)Corning21-031-CVTampon de lavage pour l’extraction des protéines
Boîte de culture tissulaire 100 mmTRP93100
ICC Seringue à insuline U100Becton Dickinson32941227 G5/8,  ; 1 mL pour le traitement à l’aiguille d’échantillons de protéines
Protein Profiler ARRAY  ;R& DARY003BPhospho humain MAPK Profiler
de protéines ARRAY  ;R& DARY002BRéseau de phosphokinases humaines
Centrifugeuse Eppendorf 5430REppendorfCentrifugeuse de table
Kit de dosage des protéines Pierce BCAThermo Fisher23225
SpectraMAX M2Molecular DevicesLecteur d’absorbance pour la quantification des protéines
IRDye 800CW StreptavidinLi-Cor Biosciences925-32230Conjugué de streptavidine pour la détection fluorescente
LabGard ES Classe II, Type A2 Armoire de biosécuritéNuAireNU-425-400Hotte de culture tissulaire
TC20 Compteur de cellulesautomatisé Bio-Rad1450102Compteur de cellules
Halt Protéase & Cocktail d’inhibiteurs de phosphatase (100x)Thermo Fisher78446
Tampon RIPASigmaR0278
Sonic DismembratorFisher ScientificF60
Vibrateur à plate-forme basculanteVWR10860-780
ImageJNIH open sourcehttps://imagej.net/Welcome
SAS Institutie JMP® ; 12.1.0 (64 bits)Microsoft

Références

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