Évaluation de la résistance aux inhibiteurs de Tyrosine Kinase par un interrogatoire des voies de Transduction de Signal par les alignements d’anticorps

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour les alignements d’anticorps identifier les altérations dans les voies de signalisation dans divers modèles cellulaires. Ces changements, causées par les médicaments/hypoxie/ultra-ultra-violet lumière/rayonnement, ou par surexpression/régulation/débouchures, sont importants pour les différents modèles de la maladie et peuvent indiquer si une thérapie sera efficace ou peut identifier des mécanismes de médicaments résistance.

Résumé

Patients atteints de cancer avec une régulation aberrante des réseaux de la phosphorylation de protéines sont souvent traités avec des inhibiteurs de tyrosine kinase. Près de 85 % de taux de réponse sont communs. Malheureusement, les patients deviennent souvent réfractaires au traitement en altérant leurs voies de transduction de signal. Une implémentation du profilage de l’expression avec puces peut identifier les modifications dans l’ensemble au niveau des ARNm et protéomique peut identifier l’évolution globale des niveaux de protéine ou permet d’identifier les protéines impliquées, mais l’activité de la transduction du signal les voies ne peuvent être établies qu’en interrogeant les modifications post-traductionnelles des protéines. Par conséquent, la capacité d’identifier si un traitement médicamenteux est réussi ou si la résistance s’est posée, ou la possibilité de caractériser toute modification dans les voies de signalisation, est un défi clinique important. Ici, nous fournissons une explication détaillée des alignements d’anticorps comme un outil qui peut identifier les altérations systémiques aux diverses modifications post-traductionnelles (par exemple, la phosphorylation). Un des avantages de l’utilisation des alignements d’anticorps comprend leur accessibilité (un tableau ne nécessite pas un expert en protéomique ou équipement coûteux) et la vitesse. La disponibilité de tableaux ciblant une combinaison de modifications poteau-de translation est la principale limite. En outre, des approches non biaisées (phosphoprotéomique) peuvent être plus appropriés pour la découverte, tandis que les alignements d’anticorps sont idéales pour les cibles plus largement caractérisés.

Introduction

L’application clinique des inhibiteurs ciblées tyrosine kinase (TKI) a transformé le traitement du cancer en fournissant aux médecins des outils efficaces pour cibler les protéines spécifiques cette transformation néoplasique en voiture. Ces composés inhibent ou bloquent la phosphorylation des protéines ciblées par la tyrosine kinases^1,2. Inhibiteurs ont été développées en partie parce que les altérations génétiques dans clé de différents gènes de signalisation ne suffisent pas à déclenchement du cancer en voiture et de progression [par exemple, récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), p....

Protocole

1. Extraction des protéines

1. Plaque de 5 x 10⁶ cellules sur une plaque de culture de tissu de 10 mm (ou ballon) dans une hotte de culture de tissus. Compter les cellules au moment de l’ensemencement avec un compteur de cellules automatique ou un hémocytomètre. Par ailleurs, estimer le nombre d’éléments.
2. Rincer les cellules cultivées sur la plaque de 10 mm (ou ballon) soigneusement 3 x 10 ml d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH = 7,4). Assurez-vous de retirer tous les PBS avant d’ajouter le tampon de lyse.
   Remarque : Le tampon de lyse est généralement fournie avec le kit. Si ce n’est pas le cas, puis utilisez un tampon....

Résultats

Pour étudier l’effet de résistance TKI sur des voies de transduction de signal dans les lignées cellulaires, quatre échantillons ont été analysés. Un témoin (H3255r1) et 3 lignées TKI résistant (H3255r2-4) (Figure 2) sont liées au modèle spot anticorps (Figure 3). Tous les 4 échantillons ont été préparés à l’aide de ce protocole. Six phosphoprotéines avec activité différentielle ont été choisis pour la démonstration de l’analyse .......

Discussion

Les approches qui combinent plusieurs lectures biologiques sont des représentations intrinsèquement plus précises de la machinerie cellulaire dans une expérience effectuée. L’avènement des alignements d’anticorps phospho permet une caractérisation rapide de la configuration des modifications qui peuvent être plus informatif que le statut de modification d’une seule protéine. Le déroulement général de l’application des tableaux de phospho-anticorps est basé sur une modification en sérine, thréonine ou tyrosine. Cet exempl.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Odysee SA Imager	Li-Cor Biosciences		Fluorescent Imager
Tube de 1,5 mL	Eppendorf	22363212
Scraper	Falkon (Corning)	353085
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning	21-031-CV	Tampon de lavage pour l’extraction des protéines
Boîte de culture tissulaire 100 mm	TRP	93100
ICC Seringue à insuline U100	Becton Dickinson	329412	27 G5/8,  ; 1 mL pour le traitement à l’aiguille d’échantillons de protéines
Protein Profiler ARRAY  ;	R& D	ARY003B	Phospho humain MAPK Profiler
de protéines ARRAY  ;	R& D	ARY002B	Réseau de phosphokinases humaines
Centrifugeuse Eppendorf 5430R	Eppendorf		Centrifugeuse de table
Kit de dosage des protéines Pierce BCA	Thermo Fisher	23225
SpectraMAX M2	Molecular Devices		Lecteur d’absorbance pour la quantification des protéines
IRDye 800CW Streptavidin	Li-Cor Biosciences	925-32230	Conjugué de streptavidine pour la détection fluorescente
LabGard ES Classe II, Type A2 Armoire de biosécurité	NuAire	NU-425-400	Hotte de culture tissulaire
TC20 Compteur de cellules	automatisé Bio-Rad	1450102	Compteur de cellules
Halt Protéase & Cocktail d’inhibiteurs de phosphatase (100x)	Thermo Fisher	78446
Tampon RIPA	Sigma	R0278
Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	F60
Vibrateur à plate-forme basculante	VWR	10860-780
ImageJ	NIH open source		https://imagej.net/Welcome
SAS Institutie JMP® ; 12.1.0 (64 bits)	Microsoft