Analyse unicellulaires lymphoblastiques et Production de cytokines dans le sang périphérique par cytométrie de flux massique

Les maladies auto-immunes sont une cause majeure de morbidité et de mortalité touchant 3-8 % de la population. Aux États-Unis, les maladies auto-immunes sont parmi les principales causes de décès chez les femmes jeunes et d’âge moyen (âges < 65 ans)^1,2. Maladies auto-immunes sont caractérisées par une présentation clinique hétérogène et divers processus immunologiques sous-jacents. Le spectre de l’hétérogénéité est bien représenté à travers différents troubles, comme articulaire dans la polyarthrite rhumatoïde (PR) et les maladies neurologiques dans la sclérose en plaques (MS). Toutefois, ce niveau d’hétérogénéité est également illustré dans un trouble unique, comme le lupus érythémateux systémique (les) : certains patients peuvent présenter des pathologie rénale, alors que d’autres souffrent de participation hématologique ou mixte³.

L’immunopathogenèse sous-jacente dans les maladies auto-immunes reflète l’hétérogénéité clinique, impliquant et hyper-activation automatique de plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires innée et adaptative et la production de cytokines dysrégulation concomitante. Alors que les cytokines jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse de la maladie auto-immune, comprendre leur rôle spécifique dans le mécanisme de la maladie s’est avéré difficile. Cytokines sont caractérisés par la pléiotropie (une cytokine peut avoir des effets multiples sur différents types de cellules), redondance (cytokines multiples peuvent avoir le même effet), la dualité (une cytokine peut avoir des effets pro - ou anti-inflammatoires, dans des conditions différentes), et la plasticité (cytokines peut être moulé dans un rôle différent de son « original », selon l’environnement)^4,5,6. Par conséquent, méthodes l’échelle de la population ne peut pas distinguer les réponses cellulaires hétérogènes à la même « milieu de cytokine ». De même, les plans d’études qui mettent l’accent sur un aspect spécifique du système immunitaire (cellules du même type ou cytokine), n’offrent pas une évaluation globale de tous les éléments impliqués dans des maladies auto-immunes complexes. Alors que des études axées sur les sérums patients ont donné des renseignements importants sur l’auto-immunité, ils ne fournissent pas la source cellulaire spécifique des cytokines dysrégulation détectés.

Récemment, nous avons développé une approche protéomique monocellulaires pour évaluer simultanément plusieurs types de cellules immunitaires et détecter leurs diverses perturbations de cytokine dans le milieu du patient spécifiques « pathogènes » plasma sanguin périphérique facteurs circulants. Le workflow décrit ici est caractérisé par l’utilisation d’échantillons de sang périphérique intacte, par opposition aux cellules mononucléaires isolées du sang périphérique (PBMC). Sang périphérique représente le véhicule plus physiologiquement pertinent pour étudier la maladie auto-immune systémique, incluant 1) non-sang des mononucléaires souvent impliqués dans les maladies auto-immunes (p. ex., neutrophiles, plaquettes) et le plasma 2) circulant de facteurs, tels que les acides nucléiques, complexes immuns et cytokines, qui ont un rôle activateur immunitaire. Pour capturer le « intrinsèque pathogènes » dysrégulation la production de cytokines, les échantillons sont traités immédiatement après le tirage de sang (T0, temps zéro) et après 6 h d’incubation à 37 ° C (température du corps physiologique) avec un transport des protéines du sang périphérique inhibiteur en l’absence de toute condition de stimulation exogène (T6, durée 6 h), pour détecter la production de cytokines (accumulation, T6-T0) qui reflète l’état de la maladie « intrinsèque » (Figure 1). Pour étudier les processus de dysrégulation qui reflètent plus ou moins activation des voies de signalisation impliquées dans les réponses immunitaires pertinents à la maladie, des échantillons de sang périphérique sont traités (6 h d’incubation à 37 ° C avec un inhibiteur de transport de protéine) avec une exogène stimuler la condition qui reflète la pathogenèse de la maladie, tels que les agonistes des récepteurs Toll-Like (TLR) dans le cas de SLE (T6 + R848, temps de 6 h avec 1 µg/mL R848), pour détecter la production de cytokines qui refléterait une réponse aux acides nucléiques (comparant T0 vs T6 vs T6 + R848, Figure 1). Afin d’étudier les effets immunomodulateurs de thérapeutique disponible ex vivo, en ce qui concerne les processus précis dysrégulation immunitaire des patients spécifiques, des échantillons de sang périphérique sont traitées par un inhibiteur JAK à la thérapeutique concentration (ici, 5 uM ruxolitinib ; T6 + 5R, temps de 6 h avec 5 uM ruxolitinib), pour détecter des changements dans l’état de la maladie « intrinsèque » en réponse à la drogue (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Figure 1). Un inhibiteur JAK a été choisi pour cette étude parce que les inhibiteurs de JAK auraient dû être divulgués pour réussir dans le traitement de maladies auto-immunes telles que RA

Evaluer simultanément les dysrégulation des processus décrits ci-dessus en plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires, des échantillons de sang périphérique de SLE patients et témoins sains ont été traitées comme décrit ci-dessus et analysés par cytométrie de flux massique. Cytométrie en masse, également connu sous le nom Cytometry-Time-Of-Flight, offre une analyse unicellulaires de plus de 40 paramètres sans problèmes de spectral chevauchent^7,8,9. Cette technique utilise des isotopes métalliques de terres rares sous forme d’ions métalliques solubles sous forme de balises liés aux anticorps, au lieu de fluorophores¹⁰. Des détails supplémentaires au sujet de la plateforme technologique de cytométrie de flux massique (c.-à-d., tuning et étalonnage, l’acquisition de l’échantillon) se trouvent dans Leipold et coll. et McCarthy et al. ^{11 , 12} la haute-dimensionnalité de cytométrie de flux massique permet mesure simultanée de plusieurs cytokines dans l’ensemble des sous-ensembles de cellules immunitaires innée et adaptative avec granularité unicellulaires (Table des matières).

Les paramètres cliniques et de laboratoire classiques actuels ne sont souvent pas sensibles ou suffisamment précis pour détecter l’activité en cours de la maladie ou la réponse aux immunomodulateurs spécifiques¹³, reflétant la nécessité de mieux délimiter le système immunitaire sous-jacent changements qui animent les poussées. Compte tenu de l’omniprésence de dérèglement de cytokine dans une maladie auto-immune, une multitude de méthodes de traitement qui utilisent des anticorps ou des petits inhibiteurs moléculaires ciblant les cytokines ou la signalisation des protéines impliquées dans la régulation de la production de cytokines ont récemment vu le jour. Dans son format de base, l’approche analytique de sang périphérique décrite ici fournit une plate-forme pour identifier les sous-ensembles de cellules spécifiques au patient dysrégulation et leur production de cytokines anormale dans une maladie auto-immune avec des manifestations systémiques. Cette méthodologie permet la personnalisation des choix thérapeutiques comme dysrégulation spécifique cytokines peuvent être identifiés, et un traitement spécifique peut être testé ex vivo pour évaluer leur capacité à immunomodulate la patiente maladie spécifique processus.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Colorado plusieurs institutionnels Review Board (COMIRB) de l’Université du Colorado. Toutes les procédures décrites ci-dessous doivent être effectuées sous une hotte de vitroplants stérile, sauf indication contraire, avec des pointes de pipette filtrée, et tous les réactifs filtrée.

1. préparation des réactifs pour le traitement du sang périphérique

1. Préparer ruxolitinib stocks aliquotes (10 – 15 μL/flacon à usage unique) à 10 mM en diluant le réactif lyophilisé dans le DMSO selon les instructions du fabricant (conserver à-80 ° C). Maintenir les concentrations de DMSO dans tous les essais, y compris les contrôles non stimulées inférieur à 0,2 % (vol/vol).
2. Préparer R848 aliquotes de stock (resiquimod) (10 – 15 μL/flacon à usage unique) à 1 μg/μL en diluant le réactif lyophilisé dans de l’eau stérile comme le selon les instructions du fabricant. Conserver à-80 ° C.
3. Préparer les lipopolysaccharides (LPS) stock parties aliquotes (5 μL par flacon pour un usage de temps seulement) à 1 μg/μL en diluant le réactif lyophilisé dans de l’eau stérile selon les instructions du fabricant. Conserver à-80 ° C.
4. Préparer les médias de coloration cellulaire (CSM) à l’aide de PBS, 0,5 % de BSA et 0,02 % NaN₃.
5. Acquérir et préparez le cocktail protéines d’inhibiteur (PTI) transport (Table des matières).
6. Décongeler et diluer le ruxolitinib stock flacon (10 mM) 01:10 dans du PBS stérile (1 mM). Mettre de côté à température ambiante dans une hotte de culture de tissus.
7. Décongeler et diluer le flacon de stock R848 (1 μg/µL) 01:10 dans du PBS stérile (0,1 μg/µL). Mettre de côté à température ambiante dans une hotte de culture de tissus.
8. Décongeler et diluer le LPS stock vial (1 μg/µL) 1/100 dans du PBS stérile (0,01 µg/µL). Mettre de côté à température ambiante dans une hotte de culture de tissus.
9. Réchauffez RPMI stérile (pas de L-glutamine) dans un bain d’eau standard 37 ° C (pendant au moins 10 min).
10. Diluer le tampon de lyse/fix de 1:5 dans ddH filtrée₂O (concentration de travail) sur la table (n’a pas besoin d’être stérile).
    Note : 1 mL de sang total nécessite 20 mL de concentration de travail du tampon de lyse/fix.
    1. Faire le tampon de lyse/fix pour 5 conditions de 1 mL de sang total chaque (au moins 100 mL). Aliquote 20 mL de la concentration de travail du tampon de lyse/fix en tubes conique de 50 mL par millilitre de sang total (garder la solution de lyse/fix à 37 ° C jusqu'à ce que nécessaire). Étiqueter les conditions sur les tubes coniques contenant un tampon de lyse/fix comme suit : T0 (temps zéro), T6 + 5R (durée 6 h avec 5 uM ruxolitinib), T6 + R848 (durée 6 h avec 1 μg/mL R848), T6 + LPS (durée 6 h avec 0,1 μg/mL LPS), T6 (durée 6 h).
11. Étiquette autour des tubes du polystyrène stériles avec des bouchons et des tubes de microcentrifuge de 1 mL avec la même nomenclature comme au point 1.10.

2. la stimulation et la transformation du sang périphérique (Figure 1)

1. Placez l’étiquette ronde polystyrène tubes du bas de l’étape 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) sur une grille.
   Remarque : Toutes les étapes suivantes sont effectuées dans ce type de tube, sauf indication contraire. Cap des tubes lors du transfert entre le capot de culture de tissus et incubateur pour maintenir la stérilité.
2. Ajouter 1 mL de 37 ° C RPMI (pas de L-glutamine) dans chacun des tubes (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). Inverser le tube de prélèvement de sang plusieurs fois, ajouter 1 mL de sang total dans chaque tube et Pipeter monter et descendre plusieurs fois pour bien les mélanger avec le RPMI (dilution avec RPMI empêche l’agglutination du sang au cours de la période d’incubation de 6 h).
3. Ajouter 10 μL de la 01:10 ruxolitinib T6 + 5R. Bien mélanger avec une pipette P1000. Placez le portoir dans l’incubateur à 37 ° C et commencez à chronométrer l’incubation (T = 0).
4. Traiter l’échantillon T0 comme suit.
   1. Dans un tube conique étiqueté contenant 20 mL de tampon de lyse/fix concentration 37 ° C travail, déposer la totalité du contenu du tube T0. Pour optimiser la récupération de la cellule, rincer le tube avec du tampon de lyse/fix travail concentration. Mélanger en retournant le tube à fond conique.
   2. Incuber à 37 ° C pendant 15 min permettre la lyse et de fixation. Après fixation, effectuez toutes les étapes subséquentes à la paillasse. Centrifuger les cellules à 500 g pendant 5 min à température ambiante.
   3. Décanter le liquide surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS froid glace pour briser le culot, puis remplir la forme conique à un volume de 15 mL de PBS.
   4. Centrifuger les cellules à 500 g pendant 5 min à température ambiante. Décanter le liquide surnageant. Répéter le lavage PBS (mesures 2.4.3–2.4.4) si les boulettes sont rouges. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de CSM pour casser vers le haut de la pastille, puis transférer dans le tube de microcentrifuge étiquetées (étape 1.11) pour la coloration des anticorps. Prélever un échantillon de 10 µL à compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées ou un hémocytomètre.
      Remarque : Étant donné que toutes les cellules sont fixés à ce stade, il n’est pas nécessaire d’inclure une tache de viabilité.
   5. Centrifuger les cellules à 500 g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant, laissant le culot dans ~ 60 µL du volume résiduel. Gardez ce pellet sur la glace jusqu'à ce que les échantillons d’autres affections ont terminé le traitement.
5. À T = 30 min, passer le portoir (étape 2.3) à la hotte de la culture de tissus et suivez la procédure suivante.
   1. Ajouter 10 μL de la 0.1 μg/μL R848 T6 + R848. Bien mélanger avec une pipette P1000.
   2. Ajouter 10 μL de la 0,01 μg/μL LPS T6 + LPS. Bien mélanger avec une pipette P1000.
   3. Ajouter 4 μL d’inhibiteur du transport de protéines (stock à 500 X) T6, T6 + 5R et T6 LPS (mais pas à T6 + R848) et retourner les échantillons dans l’incubateur jusqu'à T = 6 h. mélanger soigneusement avec une pipette P1000 toutes les 2 h.
      Remarque : R848 est un agoniste TLR endoplasmique et nécessite donc un délai temporel dans l’ajout de l’inhibiteur de transport des protéines permettant l’accès à son récepteur de cible.
6. À T = 2 h, ajouter 4 μL d’inhibiteur du transport de protéines cocktail (stock à 500 X) au T6 + R848 tube. Mélanger tous les échantillons avec une pipette P1000 et remettez le panier dans l’incubateur jusqu'à T = 6 h.
7. Mélanger les échantillons avec un P1000 une fois de plus à T = 4 h.
8. À T = 6 h, traiter T6 T6 + LPS, T6 + R848 et T6 + 5R tubes d’échantillons de sang tel que décrit dans l’étape 2.4 pour l’échantillon de T0.
9. Stocker les pellets de cellule en volume résiduel de CSM à-80 ° C à traiter à une date ultérieure. Sinon, passez à codes à barres et anticorps coloration sans stocker.

3. les codes barres des cellules du sang lysé/fixe

1. Décongeler les échantillons de cellules lysées/fixe du stockage-80 ° C lentement sur la glace ; un maximum de 20 échantillons peut être étiqueté avec code à barres unique et commun à l’aide de ce système. Diluer le tampon de perm X barcoding 10 en 01:10 par PBS ; faire suffisamment tampon pour ~ 3 mL par exemple.
2. Remplir un creux non stérile avec le MCS et l’autre avec le tampon de perm X barcoding 1. Ajouter 1 mL de glace froide CSM à échantillons fraîchement décongelés, bien mélanger avec une pipette et transférer aux tubes respectifs préalablement étiqueté cluster en polypropylène.
3. Prélever un échantillon de 10 μL de compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées ou un hémocytomètre. Normaliser le nombre de cellules à 1,5 – 2 x 10⁶ cellules par exemple dans chaque tube de cluster : Enlevez et jetez le volume des cellules excès au-dessus de 2 x 10⁶ cellules.
4. Centrifuger les cellules à 600 x g pendant 5 min à température ambiante. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de tampon de perm X barcoding 1 avec une pipette multicanaux et centrifuger à 600 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer hors le surnageant.
5. Aligner les tubes de cluster sur une grille dans l’ordre comme indiqué sur la clé du code à barres pour l’échantillon correspond avec son code à barres. Ajouter 800 μL 1 X tampon de perm barcoding de pipette multicanaux à tous les échantillons dans les tubes de cluster sans toucher le culot avec les pointes de pipette (pas de mélange) afin de réduire la perte de cellules. Mettre de côté le panier avec les tubes de cluster.
6. Retirez 20-plex Pd Barcoding Kit tube bandes de-20 ° C et décongélation à température ambiante. Ajouter 100 μL de tampon de perm X barcoding 1, bien mélanger et transférer 120 μl du mélange barcode resuspendues dans les échantillons de cellules correspondantes dans les tubes de cluster.
7. Mélanger soigneusement la pipette multicanaux afin qu’il n’y a aucune contamination croisée entre individuellement les échantillons avec code à barres. Incuber les tubes de cluster pendant 30 min à température ambiante pour permettre les codes-barres marquer les cellules.
8. Centrifuger à 600 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL de CSM.
9. Centrifuger et resuspendre dans CSM à nouveau comme au point 3.8.
   Remarque : Chaque échantillon est maintenant étiqueté avec un code à barres unique et échantillons sont prêtes à être mises en commun.
10. Centrifuger à 600 x g pendant 5 min à température ambiante et aspirer le surnageant. Avec une pipette simple et en utilisant le même embout, transférer tous les granulés de cellule en ~ 70 – 80 volume résiduel μL d’un tube en polystyrène. Ne pas éjecter l’embout de la pipette ; mettre de côté la seule pipette avec cette astuce.
11. Avec une pipette multicanaux et de nouvelles astuces, ajouter ~ 100 μL CSM dans chaque tube de cluster initial à maximiser la récupération de la cellule. Avec la pipette simple avec la pointe qui a été annulée, transférer tous les granulés de cellule en volume résiduel de ~ 100 μL dans le même tube polystyrène.
12. Ajouter CSM au haut du tube de polystyrène (~ 3 mL). Comptage et enregistrement du nombre de cellules du code à barres regroupée définie. Centrifuger à 600 x g pendant 5 min à température ambiante et aspirer le surnageant. Procéder à la coloration des échantillons avec code à barres sur le même jour.
    Remarque : Il est normal de s’attendre à environ 20 à 30 % la perte de cellules dans le processus de codage à barres.

4. coloration des Barcoded lysées/fixe globules et préparation pour l’analyse sur l’Instrument de cytométrie de flux massique

Remarque : Chaque 1 X titre d’anticorps de coloration (1 μL d’anticorps par tranche de 100 μL réaction de coloration), peuvent tacher habituellement 3 à 4 x 10⁶ cellules. Par conséquent, lorsque tous les échantillons avec code à barres sont regroupés dans un seul tube, la quantité d’anticorps doit être entartrée. Si le montant d’échantillons barcoded 20 à 30 x 10⁶ cellules et chaque titre X 1 peut tacher les 3 – 4 x 10⁶ cellules, l’échantillon avec code à barres nécessite seulement un 10 X titre, par opposition à la coloration de chaque échantillon individuellement, qui nécessiterait une quantité X 20 d’anticorps (1 X par chaque tube). La concentration de l’anticorps du nombre de cellules devrait être soigneusement réglée pour chaque cocktail d’anticorps individuel (ne pas discuté ici).

1. Colorer les cellules à l’aide d’anticorps (Table des matières) pour l’induction surface de coloration et de cytokines.
   1. Faire la coloration de surface cocktail en calculant le montant destiné à être ajoutée et comptable pour erreur de pipetage (c'est-à-dire, si la coloration avec code à barres de 20 échantillons de 2 x 10⁶ cellules dans chaque échantillon, un 10 X tache de titre est exigé ; pour les calculs de volume final, compenser pour pipetage erreur en faisant un 10,5 X final solution de coloration).
   2. Ajouter 10 X d’une valeur de volume pour le culot avec code à barres de la coloration de surface. Pour réduire la perte de cellules, avec la même pointe, homogénéiser et mesurer le volume des taches en surface et le culot cellulaire.
   3. Basé sur le volume des cellules et cocktail de coloration, ajouter le CSM pour un volume final de coloration de 50 μL / nombre d’échantillons cellulaires (c'est-à-dire, si l’exécution d’un ensemble de 20 échantillons, 50 μL X 20 = 1 mL). Incuber 30 min à 4 ° C. Agiter l’échantillon toutes les 15 min pour promouvoir la même coloration.
   4. Pendant l’incubation des taches superficielles, préparer le tampon de Perm/lavage (Table des matières) en dilution 01:10 avec les ddH filtrée₂Prepare O. volumes de 2 mL pour perméabilisation et 5 mL pour le lavage. Conserver à 4 ° C ou sur la glace.
   5. Couronner le tout la surface coloration tube avec le CSM, et centrifuger à 600 x g à 4 ° C pendant 5 min. aspirer le surnageant. Remettre en suspension l’échantillon avec code à barres dans 2 mL de 4 ° C, 01:10 tampon de dilution Perm/cycle de lavage. Incuber à 4 ° C pendant 20 à 30 min pour permeabilize pleinement les cellules.
   6. Centrifuger à 600 g à 4 ° C pendant 5 min et aspirer le surnageant.
   7. Pour la coloration intracellulaire, suivez les étapes coloration semblables (quant à la coloration de surface). Cependant, utiliser les 4 ° C, 01:10 tampon de dilution Perm/cycle de lavage au lieu de la CSM de faire le total volume de coloration afin que les cellules demeurent dans un environnement perméabilisant tout au long de la coloration intracellulaire.
   8. Ajoutez l’anticorps intracellulaire cocktail à la surface tachée et perméabilisées culot cellulaire (pas 4.1.2–4.1.17). Porter le total volume à 50 μL / nombre d’échantillons cellulaires de coloration. Incuber pendant 60 min à 4 ° C. Agiter l’échantillon toutes les 15 min pour assurer la même coloration.
   9. Au cours de la coloration intracellulaire, préparer la solution intercalator : 900 μl de PBS filtré + 100 μL de filtrée 16 % PFA (concentration finale de 1,6 % PFA) + 0,2 μL de 500 uM de colorant intercalator (Table des matières).
   10. Terminez le culot cellulaire + anticorps intracellulaire cocktail avec froid 01:10 tampons Perm/cycle de lavage.
   11. Centrifuger à 600 g à 4 ° C pendant 5 min et aspirer le surnageant. En haut du tube de coloration avec le CSM. Compter et noter le nombre de cellules. Centrifuger à 600 g à 4 ° C pendant 5 min et aspirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de solution d’intercalator de l’étape 4,9. Incuber pendant au moins 20 min à température ambiante pendant l’intercalation complet, ou toute la nuit à 4 ° C (échantillons en solution intercalator peuvent rester à 4 ° C pendant 1 semaine avant de les exécuter sur l’instrument de la cytométrie en flux massique).
2. Préparer les cellules à l’instrument de la cytométrie en masse.
   1. Terminez le tube avec 3 mL de ddH filtrée₂O et centrifuger à 600 x g pendant 5 min à 4 ° C. Remettre en suspension les cellules dans 3 mL de ddH filtrée₂O. passer cette suspension à travers un filtre de 100 μm pour enlever tout débris ou agrégats qui pourraient potentiellement bloquer l’instrument cytométrie en masse.
   2. Compter et enregistrer la filtration après numéro de cellulaire. Centrifuger à 600 x g pendant 5 min à 4 ° C
3. Préparer la solution étalon de la perle (Table des matières) en diluant il 01:10 dans ddH filtrée₂O.
4. Resuspendre le teinté cellules dans le volume requis de 01:10 solution de perle d’étalonnage pour atteindre une concentration cellulaire de ~ 1 x 10⁶ cellules/mL dilué.
   Remarque : Pour un CyTOF1 à 45 µL/min, l’optimum recommandée est de 5 x 10⁵ cellules/mL ; pour Helios à 30 µL/min, 7,5 x 10⁵ cellules/mL.
5. Aller de l’avant pour exécuter l’exemple sur la cytométrie de flux massique instrument⁹.

Figure 1 illustre le flux de travail pour la stimulation et traitement des échantillons de sang périphérique, y compris la répartition des aliquotes d’échantillons sanguins, date de l’ajout d’agents de stimulation, protéine de transport cocktail inhibiteur et incubation fois jusqu'à la lyse des globules rouges (GR) et de la fixation. Le choix des agents stimulants dépendra des voies de signalisation et de cytokines qui sont ciblés pour évaluation. Par exemple, dans le protocole décrit ici, agonistes des TLR sont utilisés pour évaluer les mécanismes de détection immunitaires innées à travers plusieurs types de cellules. Représentant extracellulaires (LPS, TLR4 agoniste) et endoplasmique (R848, TLR7/8 agoniste) agonistes ont été choisis. Autres agents stimulants incluent Phorbol 12-Myristate 13-acétate (PMA) et ionomycine (PMAIONO), qui peuvent agir comme des lymphocytes T activateurs. Cytokines spécifiques peut également être utilisé comme stimulant des agents, ainsi que d’autres antigènes spécifiques des lymphocytes B et T.

Pour illustrer l’approche expérimentale décrite dans le présent protocole, Figure 2, Figure 3et Figure 4 montrent des résultats représentatifs obtenues à l’aide de LPS, R848 et PMAIONO comme stimulant des conditions. Alors que l’utilisation de PMAIONO n’était pas décrite dans le protocole, les données sont indiquées sur la Figure 3 et Figure 4 pour démontrer que les cytokines et types de cellules différentes (et sélective) sont activés/induit en réponse aux agonistes des TLR (LPS et R848) comparativement à une T activateur cellulaire (PMAIONO). Étant donné que les marqueurs de surface 26 (Table des matières) ont servi à délimiter plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires innée et adaptative, divers T, B, NK, monocytes et sous-ensembles de cellules dendritiques peuvent être simultanément étudiées au sein d’un seul échantillon. En outre, des marqueurs d’activation de cellules immunitaires sont également inclus, tels que CD86 ou ICOS pour les lymphocytes B et PD1 pour les lymphocytes T. Un représentant limitée gating stratégie démontrant l’évaluation des monocytes CD14hi est illustré dans la Figure 2. Cependant, décrites plus en détail et blocage élargi de T, B, NK, monocyte, dendritique et sous-ensembles de cellules granulocytaire se trouvent dans nos travaux déjà publié dans O'Gorman et Hsieh et al. et O'Gorman et Kong et al. 14 , 15 en outre, sans surveillance des méthodes d’analyse y compris (et sans s’y limiter) bêche16, visNE17, agrumes18, Phenograph19et Xshift20 peuvent être utilisés pour évaluer les données de masse de cytométrie en flux (pour ne pas abordée ici). Utilisant CD14hi monocytes et les lymphocytes t CD4 comme sous-ensembles représentatifs cellule immunitaire innée et adaptative, données démontrant l’induction de cytokines dans ces types de cellules sont indiquées à la Figure 3. Un certain nombre de cytokines a été choisi pour montrer que R848 induit sélectivement IL-12 (sous-unité p40) et MCP1 dans les monocytes CD14hi tout en LPS ne fonctionne pas (Figure 3). PMAIONO, un puissant T cell activator n’induit pas de cytokines dans les monocytes CD14hi (Figure 3), mais induit interféron gamma (IFNγ) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα) dans les cellules T CD4 (Figure 4). Succès technique dans le traitement et la stimulation d’échantillon de sang périphérique fera la démonstration de patrons d’induction de cytokines spécifique aux conditions stimulantes et sous-ensembles immunitaires, comme l’illustre la Figure 3 et Figure 4. Pour une analyse complète des 14 cytokines décrit ici dans les types de cellules capturées dans les marqueurs de surface 26, veuillez consulter O'Gorman et Hsieh et al.et O'Gorman et Kong et al. 14 , 15

Pour démontrer comment l’approche expérimentale décrite dans le présent protocole capture l’État pathogène « intrinsèque » d’une maladie auto-immune systémique comme dans SLE par rapport à un donneur sain, la Figure 5 illustre l’induction de cytokines (Mip1β et MCP1) dans CD14hi de monocytes dans la sang périphérique malades échantillon seul (partie B), en l’absence de toute stimulation exogène (T6 comparativement à T0). Ces cytokines sont « modulé/a diminué » de JAK inhibition thérapie ruxolitinib (T6 + 5R comparée à T6) dans le sang périphérique malades sample seul (partie B).

Figure 1. Flux de travail expérimental pour la stimulation et le traitement du sang périphérique pour l’analyse de la masse de cytométrie en flux. Protocole pour la lyse de RBC et fixation de maladie artérielle périphérique immédiatement après prélèvement (T0), ou après 6 h d’incubation à 37 ° C avec un inhibiteur de transport de la protéine (PTI) en l’absence de tout agent exogène (T6), ou LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848 ; protéine transport inhibiteur incubation pendant 4 h seulement), ou ruxolitinib (T6 + 5R). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2. Représentant gating stratégie d’identification des monocytes CD14hi. Suite à la fixation et la lyse de la RBC, l’individu lysées/correction d’échantillons cellulaires provenant d’un donneur sain permettait avec code à barres, marquées avec des anticorps contre les marqueurs de surface 26, perméabilisées et colorées avec les anticorps contre les cytokines (Table des matières) 14. La stratégie de blocage limitée qui représente l’identification de monocytes CD14hi est montrée. De gauche à droite, chaque plot 2D représenté est un sous-ensemble de la population de la population parente qui est fermée (boîte bleue) de la parcelle de la 2D immédiatement vers la gauche. Une stratégie de blocage prolongée se trouve dans O'Gorman et Hsieh et al.et O'Gorman et Kong et al. 14 , 15 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3. Exemple d’induction de cytokines dans les monocytes CD14hi après stimulation par le LPS, R848 et PMAIONO. Une analyse représentative cytometry massive de sang périphérique des échantillons provenant d’un donneur sain au temps zéro (T0), non stimulées (T6) et après une stimulation avec le LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), et PMAIONO (T6 + PMAIONO) s’affiche. Un exemple de l’induction de cytokines dans les monocytes CD14hi est illustré ; certaines cytokines avec la spécificité de l’agent stimulant utilisé (agoniste TLR vs T cell activator) sont représentés. On trouvera des données étendues pour toutes les cytokines induction à travers plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires déterminées avec ce panel d’anticorps cytometry masse O'Gorman et Hsieh et al., et O'Gorman et Kong et al. 14 , 15 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4. Exemple d’induction de cytokines dans les lymphocytes T CD4 des cellules après une stimulation avec LPS, R848 et PMAIONO. Une analyse représentative cytometry massive de sang périphérique des échantillons provenant d’un donneur sain au temps zéro (T0), non stimulées (T6) et après une stimulation avec le LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), et PMAIONO (T6 + PMAIONO) s’affiche. Exemple d’induction de cytokines dans les cellules T CD4 est présenté ; certaines cytokines avec la spécificité de l’agent stimulant utilisé (agoniste TLR vs T cell activator) sont représentés. On trouvera des données étendues pour toutes les cytokines induction à travers plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires déterminées avec ce panel d’anticorps cytometry masse O'Gorman et Hsieh et al., et O'Gorman et Kong et al. 14 , 15 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5. Exemple d’induction de cytokines dans les monocytes CD14hi de patients de la maladie de SLE. Une analyse cytometry masse représentatif d’échantillons de sang périphérique de donneur sain (A) et SLE maladie patient (B) sont indiquées. Exemples de l’induction de cytokines dans les monocytes CD14hi ; choisis des cytokines avec la spécificité du processus pathogène SLE maladie « intrinsèque » (T6) (c.-à-d., l’induction de MIP1β et MCP1 uniquement dans des patients de SLE), et l’effet de ruxolitinib immunomodulateur (T6 + 5R) sont représentés. On trouvera des données étendues pour toutes les cytokines induction à travers plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires déterminées avec ce panel d’anticorps cytometry masse en O'Gorman et Kong et al. 15 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.