Analyse unicellulaires lymphoblastiques et Production de cytokines dans le sang périphérique par cytométrie de flux massique

Résumé

Nous décrivons ici une approche protéomique unicellulaires Evaluer immunitaire phénotypique et fonctionnelle (induction de cytokines intracellulaires) des altérations dans les échantillons de sang périphérique, analysés par cytométrie en masse.

Résumé

Cytokines jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse des maladies auto-immunes. Par conséquent, la mesure des niveaux de cytokine a fait l’objet de plusieurs études pour tenter de comprendre les mécanismes précis qui conduisent à la rupture de l’autotolérance et l’auto-immunité ultérieure. Les approches jusqu’ici ont été fondées sur l’étude d’un aspect spécifique du système immunitaire (un seul ou quelques types de cellules ou de cytokines) et n’offrent pas une évaluation globale d’une maladie auto-immune complexe. Alors que des études axées sur les sérums patients ont donné des renseignements importants sur l’auto-immunité, ils ne fournissent pas la source cellulaire spécifique des cytokines dysrégulation détectés. Une approche globale de la cellule unique pour évaluer la production de cytokines en plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires, dans le cadre de « intrinsèque » spécifique au patient plasmatique circulant des facteurs, est décrite ici. Cette approche permet la surveillance du phénotype immunitaire spécifique au patient (marqueurs de surface) et fonction (cytokines), soit dans son indigène » intrinsèque pathogènes » maladie, État, ou en présence d’agents thérapeutiques (in vivo ou ex vivo).

Introduction

Les maladies auto-immunes sont une cause majeure de morbidité et de mortalité touchant 3-8 % de la population. Aux États-Unis, les maladies auto-immunes sont parmi les principales causes de décès chez les femmes jeunes et d’âge moyen (âges < 65 ans)^1,2. Maladies auto-immunes sont caractérisées par une présentation clinique hétérogène et divers processus immunologiques sous-jacents. Le spectre de l’hétérogénéité est bien représenté à travers différents troubles, comme articulaire dans la polyarthrite rhumatoïde (PR) et les maladies neurologiques dans la sclérose en plaques (MS). Toutefois, ce niveau d’hétérogén....

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Colorado plusieurs institutionnels Review Board (COMIRB) de l’Université du Colorado. Toutes les procédures décrites ci-dessous doivent être effectuées sous une hotte de vitroplants stérile, sauf indication contraire, avec des pointes de pipette filtrée, et tous les réactifs filtrée.

1. préparation des réactifs pour le traitement du sang périphérique

1. Préparer ruxolitinib stocks aliquotes (10 – 15 μL/flacon à usage unique) à 10 mM en diluant le réactif lyophilisé dans le DMSO selon les instructions du fabricant (conserver à-80 ° C). Maintenir les concentrations de DMSO dans ....

Résultats

Figure 1 illustre le flux de travail pour la stimulation et traitement des échantillons de sang périphérique, y compris la répartition des aliquotes d’échantillons sanguins, date de l’ajout d’agents de stimulation, protéine de transport cocktail inhibiteur et incubation fois jusqu'à la lyse des globules rouges (GR) et de la fixation. Le choix des agents stimulants dépendra des voies de signalisation et de cytokines qui sont ciblés pour évaluation. Par exemple.......

Discussion

Nous décrivons ici un roman, unicellulaires, approche protéomique à évaluer simultanément plusieurs types de cellules immunitaires et détecter leurs diverses perturbations de cytokine dans le milieu du patient spécifiques « pathogènes » plasma sanguin périphérique facteurs circulants. Cette méthode emploie le sang périphérique comme véhicule analytique et masse cytométrie de flux comme outil pour évaluer les anomalies immunitaires cellulaires phénotypiques et fonctionnelles. La méthode est facilement applicable à l’homme.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ruxolitinib	Santa Cruz	SC-364729A	Stock Conc : 10 mM ; Conc final : 5 &mu ; M
R848	Invivogen	tlrl-r848-5	Stock Conc : 1 &mu ; g/&mu ; L; Conc final : 1 &mu ; g/mL
LPS-EK	Invivogen	tlrl-eklps	Stock Conc : 1 &mu ; g/&mu ; L; Concentration finale : 0,1 &mu ; g/mL
Stérile PBS	Lonza	17-516F
Tampon Lyse/Fix BD	biosciences	558049	Stock Conc : 5X ; Conc final : 1X (dilué dans ddH2O)
BD Phosflow perm/wash buffer I	BD biosciences	557885	Stock Conc : 10X ; Teneur finale : 1:10 (dilué dans ddH2O)
RPMI	Gibco	21870-076
Azoture de sodium (NaN3)	Sigma-Aldrich	S-8032	Teneur en stock : >99,9 %; Processeur final : 0,0002
Inhibiteur de transport de protéines (PTI)	eBiosciences	00-4980-93	Processeur : 500X ; Conc final : 1X
Intercalateur d’ADN	Fluidigm	201192B	Stock Conc : 500 &mu ; M; Concentration finale : 0,1 &mu ;
Média de coloration des cellules M (CSM)			PBS + 0,5 % BSA, 0,02 % NaN3
MaxPar Barcode Perm Buffer	Fluidigm	201057	Stock Conc : 10X ; Conc final : 1X
20-plex Barcode Set	Fluidigm	S0014	Stock Conc : n/a ; Conc final : n/a
EQ TM< / sup> Perles d’étalonnage à quatre éléments	Fluidigm	201078	Stock Conc : 10X ; Cône final : 1X
16 % sans MeOH Solution de formaldéhyde	Thermo	28908	Processeur : 16 % (p/v) ; Cône final : 1,6 % (p/v)
Tubes stériles en polystyrène à fond rond	VWR	60818-496	Processeur : n/a ; Commande finale : n/a
Tubes en grappe de polypropylène	Light Labs	A-9001	Référence stock : n/a ; Conc final : n/a
Helios CyTOF instrument	Fluidigm	Helios	Toutes les solutions à utiliser dans l’analyse CyTOF doivent être exemptes de contamination métallique. ddH2O est utilisé dans la préparation de toutes les solutions doivent avoir une résistivité d’au moins 18,0 M&Omega ;. cm. ddH2O et toutes les solutions auto-préparées doivent être stockées dans des bouteilles neuves en plastique ou en verre qui n’ont jamais été autoclavées.
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
Anticorps utilisés pour la cytométrie de masse
Marqueurs de surface
CD1c	Biolegend	L161	Masse : 161
CD3	BD	UCHT1	Masse : 144
CD4	Biolegend	SK3	Masse : 174
CD7	BD	M-T701	Masse : 149
CD8	Biolegend	SK1	Masse : 142
CD11b	Fluidigm	ICRF44	Masse : 209
CD11c	BD	B-ly6	Masse : 152
CD15	BD	HI98	Masse : 115
CD14	Biolegend	M5E2	Masse : 154
CD16	eBioscience/Thermo	B73.1	Masse : 165
CD19	Santa Cruz	SJ25C1	Masse : 163
CD21	Biolegend	Bu32	Masse : 141
CD27	BD	L128	Masse : 155
CD38	Fluidigm	HIT2	Masse : 172
CD45 total	Biolegend	HI30	Masse : 89
CD45RA	Biolegend	HI100	Masse : 153
CD56	Miltenyi	REA196	Masse : 168
CD66	BD	B1.1/CD66	Masse : 113
CD86	Fluidigm	IT2.2	Masse : 150
CD123	Fluidigm	6H6	Masse : 143
CD278/ICOS	Biolegend	C398.4A	Masse : 156
CD179/PD1	Biolegend	EH12.2H7	Masse : 162
IgD	Biolegend	IA6-2	Masse : 146
IgM	Biolegend	MHM-88	Masse : 151
CXCR5	BD	RF8B2	Masse : 173
HLADR	Biolegend	L243	Masse : 167
Cytokines
IL-1&alpha ;	Biolegend	364-3B3-14	Masse : 147
IL-1&beta ;	Biolegend  ;	H1b-98	Masse : 169
IL-1RA	Santa Cruz	AS17	Masse : 157
IL-6	Biolegend	MQ2-13A5	Masse : 164
IL-8	BD	E8N1	Masse : 160
IL-12/IL-23p40	Biolegend  ;	C8.6	Masse : 171
IL-17A	Biolegend  ;	BL168	Masse : 148
IL23p19	eBioscience/Thermo	23dcdp	Masse : 176
MIP1&beta ;	BD	D21-1351	Masse : 158
MCP1	BD	5D3-F7	Masse : 170
IFN&alpha ;	Miltenyi  ;	LT27:295	Masse : 175
IFN&gamma ;	Biolégende	4S. B3	Masse : 165
PTEN	BD	A2B1	Masse : 159
TNF&alpha ;	Biolegend	Mab11	Masse : 166
Note : Si le fabricant est indiqué comme Fluidigm, cet anticorps a été acheté auprès de Fluidigm avec du métal préconjugué. Si le fabricant est indiqué comme autre que Fluidigm, cet anticorps a été auto-conjugué à l’aide de l’étiquetage multi-métaux MaxPar. Kit (Fluidigm Cat : 201300) selon le protocole du fabricant.