Article de méthode

Différenciation, l’entretien et l’analyse des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien humain : un modèle de maladie-dans-un-plat pour les Mutations BEST1

DOI :

10.3791/57791

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24 août 2018

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1Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester, School of Medicine and Dentistry

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons ici un protocole afin de différencier les cellules (pre) de l’épithélium pigmentaire rétinien des cellules souches pluripotentes humaines portant le patient dérivé des mutations. Les lignées de cellules mutantes peuvent servir pour des analyses fonctionnelles dont immunoblotting, immunofluorescence et patch clamp de. Cette approche de la maladie-dans-un-plat contourne la difficulté d’obtenir des cellules humaines natifs de RPE.

Résumé

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Bien que plus de 200 mutations génétiques du gène BEST1 humain ont été identifiées et liées aux maladies dégénératives de la rétine, les mécanismes pathologiques demeurent insaisissables principalement en raison de l’absence d’un modèle de bonne in vivo pour étudier BEST1 et ses mutations dans des conditions physiologiques. Best1 encode un canal ionique, à savoir BESTROPHIN1 (BEST1), qui fonctionne dans l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) ; Toutefois, l’accès extrêmement difficile pour les cellules humaines natifs de RPE constitue un défi majeur pour la recherche scientifique. Ce protocole décrit comment générer des RPE humaines portant des mutations pathogènes BEST1 de différenciation induite par les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs). Comme hPSCs sont des renouvelables, cette approche permet aux chercheurs d’avoir une source stable de RPE-hPSC pour diverses analyses expérimentales, comme immunoblotting, immunofluorescence et patch clamp de l’et fournit ainsi un modèle de maladie-dans-un-plat très puissant pour Best1-rétiniennes conditions associées. Notamment, cette stratégie peut être appliquée pour étudier la physiologie de la RPE (patho) et d’autres gènes d’intérêt exprimé en mode natif en pre.

Introduction

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Il a été établi qu’au moins cinq maladies dégénératives rétiniennes sont causées par des mutations génétiques dans le BEST1 gène1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, avec le nombre de mutations signalées déjà plus de 200 et toujours croissant. Ces BEST1-maladies associées, également connu sous le nom de bestrophinopathies, provoquent une perte progressive de la vision et même la cécité, et il n’y a actu....

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Protocole

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1. différenciation des hPSC à RPE

  1. Maintenir et passage hPSCs comme décrit précédemment18.
    Remarque : Toutes les cellules (y compris hPSCs et hPSC-RPE) sont cultivées à 37 ° C à 5 % de CO2 pendant toute la durée des croissance et la différenciation des protocoles.
  2. Avant la différenciation, divisé hPSCs confluentes à 6 plats revêtus.
    1. Enduire plaques, décongeler la matrice de la membrane basale sur glace pendant environ 1 h, suspendre la matrice liquéfie dans le milieu DMEM 4 ° C à un 01:50 dilution, ajouter 800 mélange de revêtement µL à chaque puits et incuber pendant au moins 1 heure....

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Résultats

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L’étape plus techniquement difficile est l’isolement manuel, dont l’objectif est d’atteindre une haute pureté d’une population de hPSC-RPE0 P différenciée. Après une réussite de l’isolement, > 90 % des cellules dans la population de0 P vont croître et à mûrir pour afficher des morphologies RPE de signature (Figure 1). L’existence d’une petite partie de non-RPE ou cellules RPE immatures dans la population de0 P est presque i.......

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Discussion

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La procédure la plus importante à l’approche de la maladie-dans-un-plat est de différencier les hPSCs avec une mutation pathogène à la lignée cellulaire correcte qui est pre pour BEST1. Ainsi, après chaque expérience de différenciation, les cellules hPSC-RPE qui en résulte doivent être soigneusement validés pour leur statut mature de morphologies spécifiques RPE et protéines marqueurs16,17,18. Pour minimiser les artéfac.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce projet a été financé par le NIH subventions EY025290, GM127652 et University of Rochester fonds de démarrage.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Knock-Out (KO) DMEMThermoFisher10829018
KO Remplacement du sérumThermoFisher10829028
Acides aminés non essentielsThermoFisher11140050
GlutamineThermoFisher35050061
Pénicilline-streptomycineThermoFisher10378016
NicotinamideSigma-AldrichN0636
Activine humaine-APeproTech120-14
MEM (une modification)Sigma-AldrichM4526
Sérum de veau fœtalVWR97068-085
N1 supplémentSigma-AldrichN6530
Glutamine-pénicilline-streptomycineSigma-AldrichG1146
Acides aminés non essentielsSigma-AldrichM7156
TaurineSigma-AldrichT0625
HydrocortisoneSigma-AldrichH0386
Triiodo-thyronineSigma-AldrichT5516
mTeSR-1 mediumStemcell Technologies5850
MatrigelCorning356230
CollagénaseGibco17104019
TrypsineVWR45000-664
M-PER réactif d’extraction de protéines de mammifèresPierce78501
cocktail d’inhibiteurs de protéinaseSigma-Aldrich4693159001
RPE65Novus BiologicalsNB100-355
AnticorpsCRALBPAnticorps Abcamab15051
BEST1Novus BiologicalsNB300-164
Anticorps bêta-actineThermoFisherMA5-15739
Alexa Fluor 488-conjugué âne anti-sourisIgG ThermoFisherA-21202
Chèvre anti-souris IgGThermoFisherSA5-35521
Chèvre anti-lapinIgG LI-COR Biosciences926-68071
Hoechst 33342ThermoFisher62249
HEKA EPC10 Amplificateur à pince de patchWarner Instruments895000
PatchmasterWarner Instruments895040
anticorps

Références

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  1. Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
  2. Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes ....

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Mots-clés

Diff renciation de cellules souches pluripotentesIsolement de cellules de l EPRPatch clamp en configuration cellule enti reAnalyse par immunoblottingMarquage par immunofluorescenceFraction vasculaire stromaleProtocole de culture cellulaire

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