Article de méthode

Différenciation, l’entretien et l’analyse des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien humain : un modèle de maladie-dans-un-plat pour les Mutations BEST1

DOI :

10.3791/57791

⸱

24 août 2018

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester, School of Medicine and Dentistry

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole afin de différencier les cellules (pre) de l’épithélium pigmentaire rétinien des cellules souches pluripotentes humaines portant le patient dérivé des mutations. Les lignées de cellules mutantes peuvent servir pour des analyses fonctionnelles dont immunoblotting, immunofluorescence et patch clamp de. Cette approche de la maladie-dans-un-plat contourne la difficulté d’obtenir des cellules humaines natifs de RPE.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bien que plus de 200 mutations génétiques du gène BEST1 humain ont été identifiées et liées aux maladies dégénératives de la rétine, les mécanismes pathologiques demeurent insaisissables principalement en raison de l’absence d’un modèle de bonne in vivo pour étudier BEST1 et ses mutations dans des conditions physiologiques. Best1 encode un canal ionique, à savoir BESTROPHIN1 (BEST1), qui fonctionne dans l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) ; Toutefois, l’accès extrêmement difficile pour les cellules humaines natifs de RPE constitue un défi majeur pour la recherche scientifique. Ce protocole décrit comment générer des RPE humaines portant des mutations pathogènes BEST1 de différenciation induite par les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs). Comme hPSCs sont des renouvelables, cette approche permet aux chercheurs d’avoir une source stable de RPE-hPSC pour diverses analyses expérimentales, comme immunoblotting, immunofluorescence et patch clamp de l’et fournit ainsi un modèle de maladie-dans-un-plat très puissant pour Best1-rétiniennes conditions associées. Notamment, cette stratégie peut être appliquée pour étudier la physiologie de la RPE (patho) et d’autres gènes d’intérêt exprimé en mode natif en pre.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il a été établi qu’au moins cinq maladies dégénératives rétiniennes sont causées par des mutations génétiques dans le BEST1 gène1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, avec le nombre de mutations signalées déjà plus de 200 et toujours croissant. Ces BEST1-maladies associées, également connu sous le nom de bestrophinopathies, provoquent une perte progressive de la vision et même la cécité, et il n’y a actuellement aucun traitement efficace. Le produit protéique de BEST1, à savoir BESTROPHIN1 (BEST1), est un Ca2 +-canal Cl– activé (CaCC) spécifiquement exprimé dans l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) des yeux5,6, 8,9. Ce qui est important, un phénotype clinique de BEST1-maladies associées est la réponse visuelle réduite à des stimuli lumineux, appelé light peak (LP) mesurée dans l’electrooculogram10,11; LP est censé être médiée par un CaCC RPE12,13,14. Afin de mieux appréhender les mécanismes pathologiques des mutations BEST1 et de œuvrer en faveur des thérapies potentielles, il est essentiel d’étudier mutant BEST1 canaux exprimés dans les cellules humaines de RPE.

Cependant, les cellules directement à partir de patients vivants obtention RPE est très peu pratique. Bien que les cellules RPE natifs peuvent être récoltées de biopsies de cadavres humains et des foetus, l’accessibilité difficile à ces sources limite considérablement la recherche scientifique. Par conséquent, il est essentiel de disposer d’autres sources RPE autres que l’oeil humain. Cet appel a répondu par des avancées récentes dans les techniques de cellules souches, cellules fonctionnelles de RPE peuvent maintenant être différencier des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs), y compris les cellules souches embryonnaires (CSEh) et induit des cellules souches pluripotentes (hiPSCs), ce dernier généré en reprogrammant les fibroblastes de l’épiderme primaire de donateurs16,17,18. Ce qui est important, l’auto-renouvellement et la pluripotence des hPSCs s’assurer une source fiable pour générer des RPE, tandis que la patient-spécificité de hiPSCs et potentiel de modification génomique des CSEh (p. ex., par CRISPR) proposent un modèle polyvalent de la maladie-dans-un-plat pour mutations BEST1 désirées.

hPSC-RPE a plusieurs avantages par rapport aux souris modèles RPE : 1) chez des souris knockout BEST1 ne s’affichent pas toute anomalie rétinienne19, évoquant la possibilité d’une condition génétique différente de BEST1 en pre entre les souris et les humains ; 2) seulement 3 % des cellules humaines de RPE sont binuclées, comparativement à 35 % en souris20; 3) hiPSC-RPE potentialise autogreffe en clinique des troubles de traitement de la rétine21. Néanmoins, les modèles animaux sont encore indispensables pour l’étude des RPE physiologie et pathologie dans un système live, et le potentiel oncogène de hiPSC ne peut être négligé.

La procédure ici décrit un hPSC utile et modérément simple protocole de différenciation RPE qui peut être utilisé pour la recherche et à des fins cliniques. Ce protocole utilise nicotinamide (vitamine B3) pour augmenter la différenciation des hPSCs de tissu neural, qui est davantage induit à se différencier en RPE par un traitement avec l’activine-A. Nicotinamide traitement s’est avéré augmenter le nombre de cellules pigmentées (signe de différenciation en RPE), éventuellement en atténuant l’activité apoptotique de différencier les cellules22. Les cellules qui en résulte de la hPSC-RPE affichent les mêmes marqueurs clés, la morphologie pavées et fonctionnalité cellulaire comme native humaine de cellules RPE22. Ainsi, dans un contexte de recherche, les cellules hPSC-RPE qui en résulte sont adaptés pour des analyses fonctionnelles en aval dont immunoblotting, immunocoloration et pince à germes entiers patch, pour lesquelles des procédures expérimentales détaillées sont également fournis. Cliniquement, les cellules RPE dérivés de cellules souches ont montré grand potentiel pour le traitement de la transplantation de la dégénérescence maculaire dans les études chez l’animal et essais humains23.

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Protocole

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1. différenciation des hPSC à RPE

  1. Maintenir et passage hPSCs comme décrit précédemment18.
    Remarque : Toutes les cellules (y compris hPSCs et hPSC-RPE) sont cultivées à 37 ° C à 5 % de CO2 pendant toute la durée des croissance et la différenciation des protocoles.
  2. Avant la différenciation, divisé hPSCs confluentes à 6 plats revêtus.
    1. Enduire plaques, décongeler la matrice de la membrane basale sur glace pendant environ 1 h, suspendre la matrice liquéfie dans le milieu DMEM 4 ° C à un 01:50 dilution, ajouter 800 mélange de revêtement µL à chaque puits et incuber pendant au moins 1 heure à 37 ° C.
    2. Lorsque le revêtement est terminé, aspirer le mélange et ajouter immédiatement 1,5 à 2 mL de milieu dans les puits.
    3. Pour soulever les hPSCs sur les plaques de culture ancienne, incuber les cellules avec PBS plus 0,5 mM EDTA pendant 5 min à température ambiante, aspirer la solution et remettre en suspension les cellules en petits bouquets avec milieu de culture.
    4. Cellules de semences à la confluence de ~ 20 % dans les nouvelles plaques.
      NOTE : Stocker la matrice de la membrane basale dans 100 µL d’extraits à-20 ° C et utilisez une aliquote de revêtir une plaque 6 puits. Le temps pour le revêtement peut être étendu jusqu'à 4 h à 37 ° C, ou une nuit à température ambiante. Il est important de le suspendre et hPSCs des semences en petites touffes de 3 – 5 cellules plutôt que les cellules individuelles.
  3. Lorsque les cellules sont cultivées à confluence complet, remplacer le milieu de culture avec moyen de différenciation (4 mL/puits) (tableau 1, sans l’activine-A). Culture pendant 14 jours, en changeant le milieu (4 mL/puits) 3 x / semaine.
    NOTE : HPSC plaque double densité environ chaque 24 h. mort cellulaire importante est attendue après le début de la procédure de différenciation. Agrégats de cellules mortes et les débris dans les puits sont visibles à l’oeil nu lors des changements de la moyennes.
  4. Du 15 au jour 28, Supplément moyen de différenciation avec 100 ng/mL homme activin-A (tableau 1, avec l’homme l’activine-A). Changer le milieu (4 mL/puits) 3 x / semaine.
  5. Arrêter la supplémentation activin-A partir du jour 29 (tableau 1, sans homme activin-A). Continuer la cellule mise en culture dans un milieu de différenciation pour 8 à 10 semaines, jusqu'à ce que les grappes hPSC-RPE pigmentées apparaissent (Figure 1 a-B).
    NOTE : Amas de cellules pigmentées peuvent être considérées comme petits points sombres sur une plaque de culture cellulaire à l’oeil nu (Figure 1 a-B, en haut). Différentes cellules pigmentées avec la forme de pavé de signature peuvent être vu au microscope X 20 (Figure 1 a-B, en bas).

2. isolement et Culture des cellules différenciées RPE

  1. Enlever le support de différenciation, laver une fois avec du PBS, ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine plus 1 U/µL de collagénase dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 20 à 30 min. Retirer la trypsine/collagénase et doucement ajouter 2 mL de milieu RPE préchauffé dans chaque puits de la plaque 6 puits (< C0 > tableau 2).
    Remarque : Utiliser un microscope inversé pour analyser la morphologie des cellules hPSC-pre, qui sont polygonales avant le traitement de la trypsine/collagénase, et deviennent ronds après digestion suffisante.
  2. Utiliser un bec Bunsen à traction verre pipettes Pasteur.
    1. Avec les deux mains, tenir un long (9 pouces) pipette Pasteur aux deux extrémités est horizontale et au-dessus du brûleur Bunsen environ 2/3 sur toute la longueur de la partie mince de la pipette.
    2. Une fois le verre devient molle de la flamme, rapidement séparer les deux extrémités, tels qu’une micro pointe de grattoir-like est formée à la nouvelle extrémité de la pipette (Figure 2).
    3. Répétez plusieurs fois pour créer plusieurs « grattoirs de cellules ». Vaporiser les pipettes tirés d’éthanol à 70 % pour la stérilisation et les sécher à l’air dans la hotte de la culture cellulaire.
  3. Sous un microscope, utiliser un micro « grattoir de cellules » dissocier doucement les amas pigmentaires hPSC-RPE de la plaque.
    1. Tapotez doucement (ne grattez pas) directement sur les cellules pigmentées, qui flottera vers le haut dans le milieu de culture une fois qu’ils se dissocient du fond du puits.
    2. Utiliser immédiatement une micropipette de 20 µL à doucement les cellules dissociées hPSC-RPE de succion et les transférer sur une plaque de 6 puits revêtue avec RPE moyenne24.
    3. Recueillir environ 5 x 103 cellules (~ 10 % confluence tel qu’observé au microscope X 20) chacune revêtues d’une plaque de 12 puits en répétant les étapes 2.3.1–2.3.2 plusieurs fois, selon les besoins. Porter le volume final de milieu à 2 mL.
      Remarque : Pour éviter dissocié hPSC-RPE cellules de flotter loin, éviter mouvement des plaques au cours du processus de dissociation tels que les cellules dissociées flottent dans le milieu mais restent concentrés localement.
  4. Cellules de culture hPSC-RPP nouvellement isolé (P,0) sur des plaques de 12 puits dans le milieu de la RPE pour un autre 6-8 semaines pour leur permettre de former une monocouche pigmentée (Figure 1).
  5. Changer la moyenne 3 x / semaine. Lors du changement de milieu, laisser environ 1/3 volume de l’ancien milieu dans chaque puits et ajoutez 2/3 volume de milieu RPE fraîche, préchauffé. À ce stade, utiliser 2 mL de milieu RPE pour chaque puits dans une plaque de 12 puits (donc échanger 1,3 mL de milieu chaque fois).
    Remarque : La monocouche de cellules de P0 hPSC-RPE peut-être former des dômes, suggérant que les cellules sont activement transportant des liquides et sont ancrés par des jonctions serrées,25. Formation de dôme est donc un indicateur de maturité RPE.

3. pre sort Validation par immunotransfert

  1. Faire la cellule hPSC-RPE lysat en utilisant le tampon d’extraction de protéine chez les mammifères additionné d’inhibiteur de la protéinase cocktail. Incuber le lysat cellulaire sur la glace pendant 30 min avant la centrifugation à 13 000 x g pendant 15 min à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires non dissous. Mesurer la concentration des protéines totales du lysat.
  2. Dénaturer 40 µg de protéines totales dans un tampon échantillon Laemmli SDS à 75 ° C pour 10 min. séparer la protéine échantillons sur un gel de Tris-glycine SDS-PAGE 10 % à une tension constante de 90 V pendant 15 minutes et ensuite 150 V jusqu'à ce que les tronçons avant teinture bas du gel.
  3. Transférer les protéines sur une membrane de nitrocellulose dans un tampon Tris-glycine refroidi préalablement additionné de 10 % de méthanol à 100 V pendant 1 h.
  4. Bloquer la membrane dans une solution saline tamponnée de Tris avec 0,1 % de détergent non ionique (TBST) et 5 % non-lait écrémé pendant 1 h à température ambiante.
  5. Incubez la membrane avec des anticorps primaires dilués dans le tampon de blocage à 4 ° C durant la nuit. Diluer les anticorps ciblant les protéines marqueurs spécifiques RPE comme suit : RPE65, 1:1, 000 ; CRALBP, 1:1, 000 ; BEST1, 1:1, 000. Diluer l’anticorps contre la β-actine à 1/10 000 pour détecter des β-actine comme un contrôle de chargement.
  6. Nettoyer la membrane avec un mélange TBST 3 fois, avec 5 min pour chaque lavage.
  7. Incuber la membrane avec un fluorophore anti-souris de chèvre Conjugué IgG anticorps secondaire dilué 1/10 000 dans un tampon bloquant pendant 1 h à température ambiante.
  8. Nettoyer la membrane avec un mélange TBST 4 fois, avec 10 min pour chaque lavage.
  9. Détecter les protéines à l’aide d’un système (Figure 3) d’imagerie infrarouge.

4. vérifier la localisation sous-cellulaire BEST1 par immunomarquage

  1. Laver une fois les cellules hPSC-RPE avec 2 mL de PBS et fixer dans 2 mL de paraformaldéhyde à 4 % pendant 45 min à température ambiante.
  2. Laver deux fois avec 2 mL de PBS et incuber les cellules dans 2 mL de PBS avec 0,1 % non ioniques tensioactif et 2 % âne sérum pendant 45 min bloquer les sites de fixation non spécifique.
  3. Incuber les cellules avec BEST1 anticorps (dilution 1 : 200) pendant 2 h à température ambiante.
  4. Laver les cellules avec 2 mL de PBS 3 fois. Incubez avec un fluorophore Conjugué IgG secondaire (1:1, 000) pendant 1 h à température ambiante.
  5. Laver avec 2 mL de PBS 3 fois pour éliminer les anticorps secondaire indépendant.
  6. Observer les cellules colorées en microscopie confocale (Figure 4).

5. enregistrement Ca2 +-dépendante courant Cl– hPSC-RPE par Patch Clamp de la cellule entière

  1. 24 à 72 h avant le patch clamp, de diviser un entièrement confluentes bien (sur une plaque de 12 puits) des cellules de hPSC-pre matures P0 (en forme de pavé et pigmentée). Aspirer la moyenne, laver une fois avec du PBS et ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine plus 1 collagénase U/µL dans le puits.
    NOTE : Réchauffez la trypsine/collagénase à 37 ° C juste avant utilisation.
  2. Incuber à 37 ° C pendant 8 min.
    NOTE : Après cette étape, les cellules hPSC-RPE sont toujours adhérent et connectés.
  3. Utiliser une micropipette de 1 mL à laver délicatement les cellules de la plaque et transférer les cellules dans le mélange de digestion dans un tube conique de 15 mL. Laver le puits avec 1 mL de trypsine/collagénase préchauffé pour recueillir les cellules résiduelles et les combiner dans le tube conique de 15 mL.
    Remarque : Les cellules hPSC-RPE sont toujours en grosses touffes à ce stade. Ne pas essayer de rompre les agglomérats de cellule en pipettant également, vigoureux. Quelques massifs peuvent coller à la paroi interne de la pointe de 1 mL.
  4. Incuber le tube conique dans un bain sec de 37 ° C pendant 8 min.
  5. Utiliser une micropipette de 1 mL à la pipette doucement de haut en bas 10 à 15 fois le mélange de la digestion.
    NOTE : Amas de cellules deviennent beaucoup plus petites mais toujours visibles. Évitez de pipetage vigoureux.
  6. Répétez les deux étapes précédentes.
    Remarque : La plupart des cellules devraient être en suspension monocellulaire après pipetage. Il y a peut-être encore quelques massifs de minuscules cellules, qui sont acceptables. Facultatif : Incuber le tube conique à 37 ° C pendant un 5 min supplémentaire suivi de pipetage doux. La durée totale de la trypsine/collagénase à 37 ° C ne doit pas dépasser 30 min (8 + 8 + 8 + 5 = 29).
  7. Ajouter 5 mL de préchauffé moyen RPE au tube 15 mL conique contenant les cellules digérées. Tourner à 200 x g pendant 5 min recueillir les cellules. Remettre en suspension et semences de cellules sur plats revêtus de 35 mm à la confluence de 10 à 20 % (par exemple, un 100 % confluentes bien sur une plaque de 12 puits à cinq plats de 35 mm pour 10 % confluence).
    NOTE : En tout temps, éviter de pipetage vigoureuse, qui peut provoquer la mort cellulaire importante représentée par les débris de cachot obscur apparent dans le surnageant après centrifugation. Bien séparées unicellulaires ensemencement est indispensable pour l’enregistrement de patch clamp.
  8. Exécuter le patch de cellules entières attacher comme décrit plus haut18,26,27,28,29,30,31. Acquérir les traces actuelles d’une famille de potentiels d’étape (-100 à + 100 mV à partir d’un potentiel d’exploitation de 0 mV) (Figure 5).
    Remarque : Les recettes de solutions internes et externes sont décrites dans le tableau 3 et tableau 4, respectivement.

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Résultats

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L’étape plus techniquement difficile est l’isolement manuel, dont l’objectif est d’atteindre une haute pureté d’une population de hPSC-RPE0 P différenciée. Après une réussite de l’isolement, > 90 % des cellules dans la population de0 P vont croître et à mûrir pour afficher des morphologies RPE de signature (Figure 1). L’existence d’une petite partie de non-RPE ou cellules RPE immatures dans la population de0 P est presque i...

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Discussion

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La procédure la plus importante à l’approche de la maladie-dans-un-plat est de différencier les hPSCs avec une mutation pathogène à la lignée cellulaire correcte qui est pre pour BEST1. Ainsi, après chaque expérience de différenciation, les cellules hPSC-RPE qui en résulte doivent être soigneusement validés pour leur statut mature de morphologies spécifiques RPE et protéines marqueurs16,17,18. Pour minimiser les artéfac...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce projet a été financé par le NIH subventions EY025290, GM127652 et University of Rochester fonds de démarrage.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Knock-Out (KO) DMEMThermoFisher10829018
KO Remplacement du sérumThermoFisher10829028
Acides aminés non essentielsThermoFisher11140050
GlutamineThermoFisher35050061
Pénicilline-streptomycineThermoFisher10378016
NicotinamideSigma-AldrichN0636
Activine humaine-APeproTech120-14
MEM (une modification)Sigma-AldrichM4526
Sérum de veau fœtalVWR97068-085
N1 supplémentSigma-AldrichN6530
Glutamine-pénicilline-streptomycineSigma-AldrichG1146
Acides aminés non essentielsSigma-AldrichM7156
TaurineSigma-AldrichT0625
HydrocortisoneSigma-AldrichH0386
Triiodo-thyronineSigma-AldrichT5516
mTeSR-1 mediumStemcell Technologies5850
MatrigelCorning356230
CollagénaseGibco17104019
TrypsineVWR45000-664
M-PER réactif d’extraction de protéines de mammifèresPierce78501
cocktail d’inhibiteurs de protéinaseSigma-Aldrich4693159001
RPE65Novus BiologicalsNB100-355
AnticorpsCRALBPAnticorps Abcamab15051
BEST1Novus BiologicalsNB300-164
Anticorps bêta-actineThermoFisherMA5-15739
Alexa Fluor 488-conjugué âne anti-sourisIgG ThermoFisherA-21202
Chèvre anti-souris IgGThermoFisherSA5-35521
Chèvre anti-lapinIgG LI-COR Biosciences926-68071
Hoechst 33342ThermoFisher62249
HEKA EPC10 Amplificateur à pince de patchWarner Instruments895000
PatchmasterWarner Instruments895040
anticorps

Références

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Diff renciation de cellules souches pluripotentesIsolement de cellules de l EPRPatch clamp en configuration cellule enti reAnalyse par immunoblottingMarquage par immunofluorescenceFraction vasculaire stromaleProtocole de culture cellulaire

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