Article de méthode

Assemblage rapide, évolutive et dans divers Nanocarriers synthétique Via Flash nanoprécipitation apport de protéines bioactives et Immunostimulants

DOI :

10.3791/57793

⸱

11 août 2018

 ,  , 
1Interdisciplinary Biological Sciences, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanomatériaux fournit des mécanismes polyvalents des livraisons surveillées de thérapeutiques pour les sciences fondamentales et applications translationnelles, mais souvent, leur fabrication nécessite une expertise qui n’est pas disponible dans les laboratoires biomédicaux plus. Nous présentons ici les protocoles pour la fabrication évolutive et thérapeutique chargement de divers nanocarriers auto-assemblés en utilisant flash nanoprécipitation.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanomatériaux présente un large éventail d’options pour personnaliser l’administration CONTROLEE de charges moléculaires simples et combinés pour des applications thérapeutiques et d’imagerie. Cette spécificité accrue peut avoir des implications cliniques importantes, y compris une diminution des effets secondaires et les doses inférieures avec la plus grande puissance. En outre, le in situ ciblant modulation contrôlée des sous-ensembles spécifiques de cellules peut améliorer les études in vitro et in vivo des phénomènes biologiques fondamentaux et sonder la fonction des cellules. Malheureusement, les compétences requises en nanoscale science, chimie et génie souvent interdire sans expérience dans ces domaines, les laboratoires de fabrication et la personnalisation des nanomatériaux comme outils pour leurs recherches ou de véhicules pour leur stratégies thérapeutiques. Ici, nous fournissons des protocoles pour la synthèse et l’Assemblée évolutive d’un système de copolymère polyvalent non-toxiques bloc se prêtent à la formation facile et chargement des véhicules nanométriques pour applications biomédicales. Flash nanoprécipitation est présentée comme une méthodologie pour la fabrication rapide de diverses nanocarriers de poly(ethylene glycol) -bl-copolymères poly (sulfure de propylène). Ces protocoles permettra de laboratoires avec un large éventail d’expertise et de ressources à facilement et reproductible fabriquer nanocarrier avancée vecteurs pour leurs applications. Processus de conception et construction d’un instrument automatisé qui utilise une pompe à seringue à grande vitesse pour faciliter la nanoprécipitation flash et pour permettre un contrôle amélioré sur l’homogénéité, la taille, la morphologie et le chargement de nanocarriers de polymersome est décrit.

Introduction

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Nanocarriers permettant la livraison surveillée du fret petit et macromoléculaire, entités actives y comprises qui, si non encapsulés, serait soit hautement dégradable et/ou trop hydrophobe pour l’administration in vivo. Des morphologies nanocarrier régulièrement fabriqués, vésicules polymériques analogues aux liposomes (également appelés polymersomes) offrent la possibilité de charger simultanément cargaison hydrophile et hydrophobe1,2. Malgré leurs avantages prometteurs, polymersomes sont encore rares dans les applications cliniques, en partie, à plusieurs grands défis dans leur fabrication. Pour l’usage clinique, des formulations de polymersome il faut faire par lots à grande échelle, stériles et cohérentes.

Un certain nombre de techniques peut être utilisé pour la forme polymersomes d’un copolymère à deux blocs, tels que poly(ethylene glycol) -bloc-poly (sulfure de propylène) (PEG -bl- PPS), qui incluent des solvants dispersion3, film mince réhydratation1 , 4, microfluidique 5,6et hydratation direct7. Dispersion de solvant implique fois longue incubation en présence de solvants organiques, ce qui peuvent dénaturer certaines charges bioactifs, comme les protéines. Réhydratation minces n’offre pas de contrôle sur la polydispersité de le polymersomes formé, nécessitant souvent des techniques d’extrusion et coûteux pour atteindre monodispersion acceptable. En outre, tant microfluidique et hydratation directe sont difficiles à échelle pour les plus gros volumes de production. Les méthodes de fabrication différentes nanocarrier, flash nanoprécipitation (FNP) offre la possibilité de faire des formulations à grande échelle et reproductibles8,9,10. Alors que les FNP était précédemment réservé pour la formulation des nanoparticules de base solide, notre laboratoire a récemment élargi l’utilisation des FNP d’inclure la formation uniforme de divers PEG -bl- PPS nanostructure morphologies11, 12, dont polymersomes11 et bicontinues nanosphères12. Nous avons constaté que FNP était capable de former des formulations monodisperses de polymersomes sans la nécessité pour l’extrusion, ayant pour résultat les valeurs d’index de polydispersité supérieure par rapport aux non extrudé polymersomes formé par dispersion de réhydratation et solvant de film mince 11. bicontinues nanosphères, avec leurs vastes domaines hydrophobes, n’ont pas pu être formé par réhydratation minces, malgré la formation sous certaines conditions de solvants avec FNP12.

Ici, nous fournir une description détaillée pour la synthèse de la PEG - copolymère à deux blocsbl- PPS utilisé dans la formation de polymersome, le batteur de jets (CIJ) impingement confiné utilisé pour les FNP, le FNP Protocole lui-même et la mise en œuvre d’un système automatisé de réduire la variabilité de l’utilisateur. Informations sur la façon de stériliser le système suffisamment pour produire des formulations exemptes d’endotoxines pour utilisation in vivoet les données représentatives concernant la caractérisation des polymersomes formé par les FNP est inclus. Avec cette information, les lecteurs avec intérêt en utilisant polymersomes pour travaux in vitro et in vivo seront en mesure de fabriquer leurs propres formulations monodispersés stérile. Lecteurs ayant une expérience dans les formulations de nanocarrier et avec l’expertise de la synthèse de polymère sera en mesure de rapidement tester leurs propres systèmes de polymère utilisant des FNP comme une alternative possible à leurs techniques de formulation actuelle. En outre, les protocoles décrits dans les présentes peuvent servir comme outils pédagogiques pour la formulation de nanocarriers en cours de laboratoire de nanotechnologie.

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Protocole

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1. synthèse du Poly(ethylene glycol) -bloc-poly (sulfure de propylène)-Thiol

  1. Synthétiser de mésylate de méthoxy-poly(ethylene glycol) (Mn : 750) (MeO-PEG17-Ms, j’ai).
    1. Dissoudre 10 g de MeO-PEG17-OH dans 200 mL de toluène 100 % dans un ballon à fond rond de 3-cou (RBF) sous agitation magnétique à 600 tr/min.
    2. Raccorder le RBF 3-cou à un appareil de Dean-Stark, elle-même attaché à un condenseur, garder l’ensemble du système sous gaz inerte, azote ou argon.
    3. Placer le RBF 3-cou dans un bain d’huile, chaleur à 165 ° C sous agitation à 600 tr/min.
    4. Enlever trace de l’eau et 100 mL de toluène à l’aide de distillation azéotropique.
    5. Enlever le RBF 3-cou de l’huile, retirez l’appareil de Dean-Stark tout en maintenant des conditions de gaz inerte et laisser refroidir à température ambiante.
    6. Ajouter 5,6 mL de triéthylamine 100 % (3 EQ molaire) et 300 mL de toluène anhydre de 100 % à MeO-PEG17-OH solution tout en remuant à 600 tr/min.
    7. Déplacer le RBF 3-cou à un bain de glace, maintenir en agitant, à 600 tr/min et des conditions de gaz inerte.
    8. Diluer 3,1 mL de 100 % chlorure de méthanesulfonyle (équation molaires 3) avec 30 mL de toluène 100 %, ajouter lentement le RBF 3-cou via un entonnoir addition tout en remuant à 600 tr/min.
    9. Remuer pendant la nuit à 600 tr/min à température ambiante dans des conditions inertes.
    10. Solution de filtration à travers un entonnoir Buchner rempli de terre de diatomées (voir Table des matières) pour enlever les sels.
    11. Enlever toluène par un évaporateur rotatif avec le bain d’eau réglé à 40 ° C, rotation à 120 tr/min et pression réglée entre 50-100 millibars.
    12. Dissoudre à nouveau produit dans 200 mL de 100 % de dichlorométhane (DCM) et filtrer à travers un entonnoir Buchner, rempli de terre de diatomées (voir Table des matières).
    13. Retirez le DCM par un évaporateur rotatif avec le bain d’eau réglé à 40 ° C, rotation à 120 tr/min et pression réglée entre 450-600 millibars.
    14. Avec parcimonie dissoudre à nouveau produit dans 100 % DCM et précipiter lentement produit en l’ajoutant goutte à goutte (via la pipette Pasteur) à 500 mL de glacée 100 p. cent d’éther. Maintenir en agitant, à 300 tr/min.
    15. Décanter ou aspirer pour retirer l’éther diéthylique précipité produit, MeO-PEG17- mésylate et magasin du jour au lendemain dans le dessiccateur à vide pour sécher complètement.
    16. Utiliser le produit immédiatement, ou stocker sous gaz inerte à-20 ° C pendant plusieurs mois.
  2. Synthétiser méthoxy-poly(ethylene glycol) thioacétate (MeO-PEG17-TA, II).
    1. Dissoudre 5 g de MeO-PEG17-Ms (I) dans 200 mL de 100 % anhydre diméthylformamide (DMF) dans un RBF 3-cou, remuer à 600 tr/min à température ambiante sous gaz inerte.
    2. Ajouter 2,5 g de carbonate de potassium 100 % (3 EQ molaire) à remuer la solution.
      Remarque : le carbonate de Potassium se dissoudra pas complètement dans la solution.
    3. Diluer 1,3 mL de 100 % l’acide thioacétique (équation molaires 3) dans 100 mL de 100 % DMF anhydre et ajouter quelques gouttes de solution via un entonnoir de l’addition.
      Remarque : L’acide thioacétique a une odeur forte et désagréable. Il faut garder tous les objets souillés dans la hotte chimique pendant la nuit avant l’élimination ou le nettoyage.
    4. Remuez vigoureusement (tr/min 600 ou supérieur) pour la nuit à température ambiante.
      Remarque : Formation de sels peut facilement perturber l’agitation de cette solution. Il faut maintenir en remuant pendant la nuit.
    5. Solution de filtration à travers un entonnoir Buchner rempli de terre de diatomées (voir Table des matières).
    6. Retirez le DMF par un évaporateur rotatif avec le bain d’eau réglé à 60 ° C, rotation à 120 tr/min et pression réglée entre 5-15 mbar.
    7. Dissoudre le produit dans 100 mL de 100 % le tétrahydrofurane (THF) et ajoute une colonne emballée à l’alumine neutre pour enlever les impuretés de couleurs rouge/orange.
    8. Retirez le THF par un évaporateur rotatif avec le bain d’eau réglé à 40 ° C, rotation à 120 tr/min et pression réglée entre 200 et 300 millibars.
    9. Avec parcimonie dissoudre à nouveau produit dans du DCM de 100 %. Si un précipité sel forme, solution de filtration à travers 6 μm pore Taille papier de filtre à l’aide d’un entonnoir Buchner.
    10. Précipiter lentement produit en ajoutant goutte à goutte par l’intermédiaire de pipette Pasteur à 500 mL de diéthyle oxyde du 100 % glacée, en remuant à 300 tr/min. Éther diéthylique devrez peut-être être davantage réfrigérés à-20 ° C dans un congélateur antidéflagrant pendant plusieurs heures si le précipité tombe pas en panne de solution à 4 ° C.
    11. Décanter ou aspirer pour retirer l’éther diéthylique précipité produit, OPE-PEG17-thioacétate. Entreposer le produit du jour au lendemain dans un dessiccateur à vide, puis sous gaz inerte à-20 ° C.
  3. Synthétiser dibloc copolymère poly(ethylene glycol) -bloc -poly(propylene sulfide)-thiol (PEG17-bl- PPS35-SH, III).
    1. Dissoudre le MeO-PEG17-TA (II) dans 10 mL de 100 % DMF anhydre dans une fiole de Schlenk sous argon, tout en remuant à 400 tr/min dans un bain-marie à température ambiante.
    2. Ajouter 1.1 eq molaire de méthylate de sodium (solution 0,5 M dans du méthanol), permettent de remuer à 400 tr/min pendant 5 minutes.
    3. Ajouter 35 eq molaire du sulfure de 100 % de propylène, rapidement, à la solution. Permettre à remuer à 400 tr/min pendant 10 minutes.
    4. Ajouter 10 eq molaire de l’acide acétique glacial 100 %, permet de remuer à 400 tr/min pendant 5 minutes.
    5. Retirez le DMF par un évaporateur rotatif avec le bain d’eau réglé à 60 ° C, rotation à 120 tr/min et pression réglée entre 5-15 mbar.
    6. Dissoudre à nouveau produit avec parcimonie dans 100 % DCM, précipiter dans 80 mL de méthanol à 100 %, partagé entre deux tubes à centrifuger coniques 50 mL.
    7. Tubes à centrifuger coniques à 7500 x g pendant 5 minutes à 4 ° C. Aspirer le surnageant à l’extérieur.
    8. Conserver le produit, PEG17-bl- PPS35-SH, du jour au lendemain dans un dessiccateur à vide, puis sous gaz inerte à-20 ° C.

2. Assembler PEG -bl -PPS Nanocarriers via Hand-Powered Flash nanoprécipitation

  1. (Facultatif) Stériliser le mélangeur de jets (CIJ) impingement confiné.
    1. Dans une hotte de sécurité biologique (BSC), immerger la table de mixage avec toutes les pièces démontées dans NaOH 0,1 M pendant la nuit.
    2. Remonter le mélangeur de la CIJ et traversent l’eau exempte d’endotoxine utilisent des seringues luer-lock.
    3. Tester le pH de l’eau et continuer à s’écouler l’eau à travers jusqu'à ce que des registres de pH neutre.
  2. Dissoudre le PEG17-bl- PPS35-SH polymère et hydrophobe cargo dans le THF (solution 1 d’impingement).
    1. Peser 20 mg de PEG17-bl- PPS35-SH dans un tube de 1,5 mL.
    2. Ajouter les colorants hydrophobes (p. ex.,DiI, ICG), médicaments (p. ex.,la rapamycine) ou autres marchandises.
      Remarque : Cargo peut être sec ou dissous dans un solvant miscible à l’eau, préférablement de THF. Si la cargaison est insoluble dans le THF ou le DMF, un autre solvant miscible avec l’eau peut servir, mais avec parcimonie, le polymère est peu susceptible d’être solubles. La quantité de marchandise qui peut être chargée est dépendent des propriétés de cargaison elle-même (par exemple, le poids moléculaire, l’hydrophobie, considérations stériques) et devraient être étudiées sur une base de cas-par-cas11,12.
    3. Ajouter 500 µL de 100 % THF pour le polymère et de la cargaison, vortex vigoureusement pour dissoudre.
  3. Dissoudre la cargaison hydrophile dans un tampon aqueux (solution 2 d’impingement). Pour ce faire, dissoudre hydrophile fret à charger dans les vésicules de polymère dans 500 µL d’un tampon aqueux (p. ex., tampon phosphate salin eau pure, etc.) selon les besoins.
  4. Ajouter tampon au réservoir.
    1. Ajouter 2,5 mL d’un tampon aqueux de choix (par exemple, 1 x solution saline tamponnée au phosphate) à un réservoir de taille appropriée (p. ex., un flacon de scintillation de verre de 20 mL). Placez le réservoir sous la table de mixage CIJ telle que la sortie du mélangeur pénètre directement dans le réservoir.
  5. Charger des solutions impingement dans des seringues jetables en plastique séparé 1 mL.
  6. Empiètent les uns contre les autres pour former des nanostructures et de les charger avec la charge utile en même temps des solutions.
    1. Insérez les adaptateurs Luer-lock au dessus de la table de mixage CIJ seringues.
    2. Dans une requête unique, lisse et rapide, appuyez sur les deux seringues simultanément et avec la même force.
      Remarque : Si vous effectuez plusieurs infractions séquentielles, d’abord rassembler écoulement dans un réservoir vide.
    3. (Facultatif) Effectuer plusieurs infractions. Solution du Split nanostructure naissante entre deux seringues et répétez les étapes 2.6.1-2.6.2 jusqu'à 4 fois plus.
    4. Recueillir l’écoulement dans le réservoir rempli de tampon aqueux préparé en 2.4.1 et remuer doucement pour assurer un mélange.
  7. Enlever la cargaison déchargée et solvant organique.
    1. (Option 1) Dialyser nanocarrier formulation dans le même tampon aqueux servant d’impaction et dans le réservoir, utilisez un tuyau d’une coupure de MW appropriée pendant au moins 24 heures, au moins 2 changements de tampon. Cela peut être effectuée à la température ambiante.
      Remarque : Nanocarriers sera retenu par le tube avec une fréquence de coupure MW < 100 000 kDa et peuvent potentiellement être retenus par des seuils plus élevés aussi bien. Cette option conserve la stérilité lorsque effectuée à un baccalauréat ès sciences en utilisant le tampon stérile.
    2. (Option 2) Filtrer la formulation par une exclusion de taille ou de la colonne échangeuse de dessalage/tampon (par exemple, Sépharose 6 b colonne) à l’aide de 1 x PBS comme le tampon aqueux.
      Note : Cette option maintient stérilité lorsque effectuée à un baccalauréat ès sciences avec une colonne qui a été complètement stérilisé.
    3. (Option 3) Enlever le solvant organique volatil, à l’aide de la dessiccation sous vide pendant la nuit.
    4. (Option 4) Formulation à l’aide d’un système de filtration de flux tangentiel en utilisant un filtre de kDa de 50-100 à un débit de 20 à 60 mL/min pendant 15 minutes à 1 heure, en fonction du poids moléculaire de la cargaison « désencapsulées » étant purifié loin du filtre (plus grande cargaison prendra plus de temps).
  8. (Facultatif) Concentrer la formulation de nanocarrier.
    1. (Option 1) Concentré à l’aide d’un système de concentrateur de spin (p. ex., colonne avec MW coupure > 100 000), utilisé comme indiqué par le fabricant.
      Remarque : Nanocarriers devrez peut-être être remis en suspension entre les spins et peut nécessiter un nombre de tours pour se concentrer vers le bas pour volume désiré. Concentration de spin peut réduire la stérilité des préparations nanocarrier.
    2. (Option 2) Réduire le volume à l’aide de dessiccation sous vide.
      Remarque : Le changement de Volume est difficile à contrôler dans ces conditions, et il faut maintenir l’osmolarité avant et après la concentration.
  9. Magasin nanocarriers à 4 ° C pour les semaines ou mois. Avant de l’utiliser après stockage, brièvement les formulations de nanocarrier vortex.

3. caractériser Nanocarrier Formulations

  1. Mesurer l’efficacité de chargement
    1. Si la cargaison est fluorescent ou absorbe fortement à une longueur d’onde donnée en dehors de 260-450 nm, mesurer fluorescence/absorption à l’aide d’un fluorimètre/spectrophotomètre.
      Remarque : PEG -bl- PPS absorbe fortement de 260-310 nm et polymersome formulations absorbent de 310-450 nm, ce qui peut compliquer la quantification de la cargaison qui absorbe la même longueur d’onde.
    2. Si la cargaison absorbe au sein de la région 260-450 nm et est hydrophile, perturber PEG -bl- PPS nanostructures en ajoutant 25 μL de la formulation à un volume égal de 1 % ou 1 % H2O2 Triton X-100 et ensuite dissocier et distinguer cargaison d’absorbance de polymère par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) à l’aide d’une colonne d’exclusion de taille compatible avec aqueuse met en mémoire tampon (par exemple, une colonne de Sépharose 6 b) 11.
    3. Si la cargaison absorbe au sein de la région 260-450 nm et est soluble dans le THF ou le DMF, lyophiliser la formulation par le gel de 100 μl dans un tube en plastique de 1,5 mL à-80 ° C durant la nuit. Placez ensuite le tube dans un récipient en verre sous vide et de mettre en place dans un lyophilisateur. Attendre 24 heures pour la lyophilisation à se produire et par la suite dissoudre à nouveau dans le 50 μL de DMF ou THF avant la séparation et la détection par HPLC.
  2. Mesure nanocarrier taille et morphologie
    1. Utilisez diffusion dynamique de la lumière (DLS)11 ou nanoparticules analyse13 de suivi pour mesurer la taille de nanocarrier.
      Remarque : Nanocarriers formé à partir de PEG17-bl- PPS35-SH sont censés entre 100-200 nm de diamètre moyen, avec une polydispersité index < 0,3.
    2. Déterminer la morphologie nanocarrier aide cryogéniques transmission electron microscopy (cryoTEM)14.
      Remarque : Nanocarriers formé à partir de PEG17-bl- PPS35-SH sont censés être des vésicules de polymère (polymersomes) avec une membrane POLYMÉRIQUE clairement discernable et forme en grande partie sphérique.
  3. (Facultatif) Test des formulations d’endotoxine
    1. (Option 1) Utiliser un test de base de cellules pour la présence d’endotoxines, par exemple, les cellules bleues brutes ou cellules HEK TLR4 bleu (voir Table des matières), telle que décrite par le fabricant, en soit un dosage quantitatif ou qualitatif pour les lipopolysaccharides (LPS)13 .
    2. (Option 2) Utiliser un kit de test de15 Limulus Amebocyte Lysate (LAL), telle que décrite par le fabricant.

4. fabrication d’une pompe à seringue à grande vitesse pour les FNP

  1. Fabriquer des composants de l’instrument personnalisé.
    Note : des modèles 3D pour l’usinage de tous les composants personnalisés sont fournis dans les documents complémentaires.
    1. Machine de châssis multicouche instrument de ¾" feuilles d’acrylique et assembler (voir Fichiers complémentaires 1-5).
      Remarque : Acrylique a mauvaise résistance aux produits chimique. Si l’instrument doit être utilisé avec des solvants agressifs, la base d’un métal considéré apte à l’application de la machine.
    2. Pièces en impression 3D avec imprimé avec du plastique de polylactide (PLA).
      1. Imprimer l’appareil de traitement à 2 pièces seringue expulsion (SE) : SE partie 1 - bloc arrière FNP holding transport (Figure 5F, la partie grise ; Le dossier complémentaire de 6) et SE partie 2 - guide de l’Expulsion avant (Figure 5F, partie noire ; Fichier supplémentaire 7). Voir 2 de fichier supplémentaire pour les schémas.
      2. Imprimer les accolades de capteur infrarouge (Figure 5I, boîtes noires ; Des fichiers supplémentaires 8 et 9).
      3. (Facultatif) Imprimer l’accolade de piston de seringue double.
  2. Fixez les superpositions de châssis d’instruments ainsi que des boulons M5 et ajouter les pieds en caoutchouc à la base.
  3. Configurer un ordinateur monocarte avec le système d’exploitation de Raspbian GNU/Linux 8.0 (Jessie) (basé sur Linux Debian).
    Remarque : Le logiciel pour l’exploitation de l’Instrument est disponible sur demande. Code de source logiciel instrument disponible sur demande. Lorsque vous recevez un fichier zippé, télécharger toutes les dépendances spécifiées dans le fichier README. Ce logiciel inclut une interface utilisateur graphique simple qui permet de contrôler le fonctionnement de l’appareil, y compris les paramètres fondamentaux de course (vitesse du moteur, direction, etc.). Les utilisateurs sont encouragés à développer sur le code source existant et des modules personnalisés de programme sur mesure pour les utilisent dans leurs propres expériences. Tous les logiciels a été écrit à l’aide de Python 2.7.12 et ne sont pas actuellement compatible avec Python 3. Modules de multitraitement, PicoBorgRev, kivy et RPi sont utilisés. Le fichier Lisez-moi contient des informations détaillées concernant la licence de distribution de logiciels.
  4. Installer un 24 V brossé, moteur à courant continu (Figure 5 a) et lame de précision (4.5"(114,3 mm) AVC ; vis de 1,27 mm plomb) (Figure 5).
    Remarque : Le moteur de 24 V DC utilisée ici a un tr/minmax, j’aimaxet le couple de pleine charge de 4 252 tr/min, 4.83 A et ~0.2 N * m, respectivement.
    1. (Facultatif) Placez un matelassage sous le moteur pour amortir les vibrations pendant le fonctionnement.
      Remarque : Il est recommandé qu’un tampon de caoutchouc épais de 2 à 3 mm est coupé pour s’ajuster aux dimensions de transport moteur de la base de l’instrument.
    2. Monter la lame de précision à la base de l’instrument.
      1. Retirer la tige filetée temporairement.
      2. Montez la diapositive à l’aide de deux vis de machine plate #8-32.
    3. Alésages de moteur de C.C de montage à glissière de précision utilisant un couplage de faisceau de vis (longueur 1-1/4") contenant 6/16" et 1/4" de diamètre.
      Remarque : Selon l’épaisseur de la résine utilisée pour usiner les couches de base instrument, cales peuvent être nécessaire pour mettre à niveau les arbres moteur et precision diapositive.
  5. Monter expulsion plate-forme de plaques métalliques et renforts d’angle en forme de L (Figure 5). Monter des métaux de base plate-forme à plate-forme coulissante (fixé sur la tige filetée) à l’aide de vis #6-32. Voir schéma de glissière de précision fournie par le fabricant pour plus de détails concernant les contraintes de montage.
  6. Assembler la seringue expulsion configuration du système.
    1. Fixez le mouvement linéaire des blocs d’oreiller (plates-formes de montage + roulement de mouvement linéaire) dans M8 chromé des rails en acier inoxydable (les rails parallèles en acier peuvent être facilement observés dans la Figure 5).
    2. Visser les rails par le biais de rails de guide/support et serrure axe linéaire. Utilisez trois guides par rail. Mont SE parties 1 et 2 dans des blocs d’oreiller à l’aide de vis M4.
    3. Vaguement rejoindre SE parties 1 et 2 avec boulons M8. Configurer l’espace entre la partie SE 1 et 2 avec hélice ressorts de compression couvrant chaque boulon sécurisés entre deux douilles en nylon faisant face vers l’intérieur (voir Figure 5F). Monter ces douilles à l’extérieur de la partie SE 1 et SE 2.
  7. Circuit de fil (voir la Figure 6 pour le schéma de câblage de base)
    1. Connectez le contrôleur de moteur à la I2C/SDA, 3,3 V, et tiges de GND l’ordinateur monocarte.
    2. Raccorder aux bornes moteurs DC les M - M + blocs et des membres du contrôleur de moteur. Connectez le 24 V, 2,5 une alimentation de puissance (Figure 5 b) aux blocs du contrôleur moteur V + et GND (le contrôleur est enfermé dans une boîte électronique simple dans la conception finale, voir la Figure 5 H).
    3. Connecter les broches 3V3 et 5V de la carte de commande moteur aux broches respectives sur l’ordinateur monocarte. Connecter les pins SDA et SCL du contrôleur de moteur à broches 3 et 5 de l’ordinateur monocarte, respectivement.
      Remarque : Les commandes sont émises pour le moteur à courant continu de l’ordinateur monocarte, grâce à un contrôleur de moteur. Vitesse du moteur est contrôlée par la régulation de la tension aux bornes de moteur par l’intermédiaire de modulation de largeur d’impulsion. Dans cette configuration, le courant maximal circulant à travers le moteur de 24 V DC (pleine charge ampérage : 4.83 A) est limitée à 2,5 A par l’alimentation 24 V. Il est recommandé que le circuit du moteur est câblé à travers un normalement fermé (NC) arrêt d’urgence (Figure 5J). Cela fournit un moyen de perturber le circuit automobile pour permettre une opération de base d’arrêt d’urgence.
    4. Connectez avant et arrière infrarouge capteurs (capteurs de distance numérique, Figure 5I) aux broches GPIO RPi 24 et 23, respectivement.
      1. Câblage du capteur voie par des conduits dans la base de l’instrument.
        Remarque : Les capteurs IR sont des capteurs de mouvement sans contact pause-faisceau avec une portée de détection de 2 à 10 cm.
      2. 4.7.4.2 enclenchez les capteurs IR filaires en croisillons imprimés 3D de capteur infrarouge (Figure 5I, boîtes noires) et montez sur la base de l’instrument. Lorsque vous définissez correctement dans l’orthèse, le visage de capteur doit dépasser vers l’extérieur de la 14 x 7 mm rectangulaire ouvrant de l’orthèse.
        Remarque : ces accolades de capteur peuvent être temporairement montés à l’aide de Velcro ou un adhésif (fixation temporaire est utile pour bien ajuster et optimiser le positionnement du capteur IR). Vous pouvez également monter en permanence en perçant des trous de petit guide dans la base de l’instrument et en vissant les accolades avec vis M2.
    5. Connecter un écran tactile LCD de 7" au 5V, GND et affichez les broches de l’interface série (DSI) de l’ordinateur monocarte. Les 7" RPi et l’écran LCD affiche Assemblée est illustrée à la Figure 5.

5. fabriquer Polymersomes via FNP à l’aide de la seringue à grande vitesse sur mesure

  1. (Option 1) Utilisez le mode d’exécution automatique.
    1. Dans le menu principal, sélectionnez Auto Run . Le système demandera aux utilisateurs de permettre au moteur de positionner automatiquement la plate-forme d’expulsion seringue vers le début de la lame de précision. Assurez-vous que le chemin devant et derrière la plaque de métal est clair avant de procéder.
    2. Charger des seringues en plastique de 1 mL tel que décrit à la section 2.5 et Mont seringues sur les connecteurs Luer femelles du mélangeur CIJ. Charger des CIJ mélangeur (avec des seringues attachés) dans l’ouverture rectangulaire du chariot arrière expulsion (voir Figure 5E).
    3. Régler la vitesse du moteur souhaitée (unités : tr/min) en utilisant le curseur dans l’interface utilisateur (voir la note ci-dessous pour des considérations importantes). La vitesse du moteur optimale dépendra la pompe spécifique et le programme d’installation mais doit assurer un débit d’au moins 1 mL/s pour les CIJ mélangeur canal dimensions fournis ici.
      Remarque : Étudier ce qui suit en débit de réglage. Dans la configuration de FNP verticale manuelle, réactifs sont expulsés les seringues à un taux d’environ 1 mL/s, mais peut être très variable quand main conduit. C’est tout simplement le débit à travers le corps de la seringue, qui est contrôlé par la vitesse à laquelle l’utilisateur passe le piston de la seringue. Notez que le taux de 1 mL/s est pas se référant à la vitesse d’écoulement de sortie de la buse de diamètre plus petite. Lors de ce qui précède a précisé dimensions de canal, ~ 1 mL/s doit être maintenu pour assurer le nombre d’un Reynold appropriée pour le mélange turbulent10. Les débits différents peuvent être utilisés aussi longtemps que le diamètre du canal est ajusté en conséquence pour maintenir le nombre d’un Reynold supportant des conditions turbulentes. Les pistons de seringue sont avancés par une plaque métallique perpendiculaire, qui se déplace le long d’une lame de haute précision en aluminium couplé à 24 V brossé moteur à courant continu. Dans cette configuration, le débit maximal de baril est influencé par un certain nombre de facteurs, y compris (1) la vitesse maximale du moteur (tr/min 4 252) et la tête de vis de la lame de précision (1,27 mm) qui est couplée au moteur d’axe (2) le couple du moteur (~0.2 N * plein-l m OAD de couple), qui est nécessaire pour surmonter la résistance à l’écoulement (3) contribution de contre-pression de fluide d’entrée et de sortie du mélangeur de la CIJ et (4) la force des seringues utilisées (utilisateurs doivent être conscients des forces agissant sur les seringues et utiliser des seringues de Force appropriée). Concernant le point (2), lors de l’augmentation des flux couple suffisant de taux est nécessaire pour éviter de caler le moteur tout en maintenant constante expulsion dos pressions croissantes. Baril de débits – pour illustrer le flux baril note que le système susmentionné peut atteindre, considérons le cas où le FNP est effectuée à l’aide de réactifs chargés dans deux seringues un-millilitre. Pour atteindre un débit mL/s 1, taux à travers le Canon, le moteur doit avancer la plaque métallique la distance définie par la longueur du piston (~ 68 mm pour une seringue typique un mL) en une seconde. Condition que la tête de vis de 1,27 mm de la lame de précision, il s’ensuit qu’un moteur à courant continu fonctionnant à 4 252 tr/min est capable de faire avancer la plate-forme jusqu'à ~ 90 mm/s (tr/s 71 * 1,27 mm/TR). Cela correspond à un débit de baril de ~1.3 mL/s, ce qui est supérieur au taux de cible 1 mL/s.
    4. Avant d’exécuter l’instrument, vérifiez l’installation pour garantir que le chemin d’accès de la plate-forme ne comporte pas d’obstacles, et que les détecteurs de proximité IR avant et arrière sont claires des obstructions (les capteurs IR sont les petites boîtes noires près de la lame de précision terminaux ; Voir Figure 5I). Également s’assurer que la prise d’un tube capillaire par le mélangeur de la CIJ est acheminée dans un récipient de collecte approprié (ex : verre, gobelet, etc.).
    5. Pour expulser les réactifs de la seringue et dans le mélangeur de la CIJ, appuyez sur le bouton exécuter dans l’interface du logiciel.
  2. (Option 2) Utilisez le mode exécution manuels. Référez-vous aux indications Mode d’exécution automatique ci-dessus et notez la modification suivante pour entrer 5.1.5 : Appuyez sur le bouton avant enfoncé en permanence grâce à l’achèvement de l’exécution (par exemple, la plate-forme avance en réponse à un événement sur presse et le moteur s’arrête en réponse à un événement sur libération).
  3. (Option 3) Utilisez la plate-forme manuel positionnement mode ; ce mode permet aux utilisateurs de la plate-forme du poste de rotation du moteur à basse vitesse (20 % de puissance) en réponse aux boutons avant et arrière de l’interface du logiciel.

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Résultats

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Ici, nous avons présenté un protocole simple pour la formulation de nanocarriers capable de charger la cargaison hydrophile et hydrophobe qui sont sans danger pour les souris in vivo et de primates non humains administration11,13. Nous avons également inclus un protocole détaillé pour la synthèse du polymère utilisé dans nos résultats représentatifs, ainsi qu’une description pour la fabrication d’un instrument personnalis...

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Discussion

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Nous fournissons des instructions détaillées pour la fabrication rapide de polymersomes à l’aide de PEG17-bl- PPS35-SH comme le copolymère à deux blocs. Polymersomes vésiculaires sont la morphologie globale primaire Assemblée à ce ratio PEG hydrophile et hydrophobes PPS bloc de poids moléculaire. Lorsque empiété plusieurs fois, ils ont un diamètre et polydispersité qui correspond polymersomes extrudée à travers une membrane nm 200 après avoir été formé par hydratation de film mince...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

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Nous reconnaissons que le personnel et instrumentation prennent en charge de l’installation de biologie structurale à la Northwestern University. Le soutien de la R.H. Lurie complète Cancer Center de l’Université Northwestern et les installations de biologie structurelle Northwestern University est reconnu. Le détecteur d’électrons direct Gatan K2 a été acheté avec des fonds fournis par le Consortium de recherche biomédicale de Chicago avec l’appui des fonds Searle à The Chicago Community Trust. Nous remercions également les équipements suivants à la Northwestern University : l’installation interdisciplinaire des sciences Surface Keck, l’installation de biologie structurale, l’installation d’imagerie biologique, du Center for Advanced Molecular Imaging et l’analytique Bionanotechnologie équipement Core. Cette recherche a été financée par la subvention de la Fondation nationale des sciences 1453576, instituts nationaux de santé directeur New Innovator Award 1DP2HL132390-01, le Center for Regenerative nanomédecine Catalyst Award et le prix de catalyseur de McCormick de 2014. SDA a été en partie soutenue par les NIH pré-doctoral biotechnologie formation Grant T32GM008449.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - Édition 32 GoCanaKitUPC 682710991511
(petite) - Diamètre 8mm Adafruit1179
Mouvement linéaire Arbre de 8 mm, longueur 330 mm, chromé, cémenté, métriqueVXBkit11868
Guide/support d’arbre de rail linéaire - 8 mm de diamètreAdafruit1182
Glissière de précision à position manuelle Course de 4,5 po, capacité de charge de 15 lbMcMaster-Carr5236A16
MTPM-P10-1JK43 Moteur à courant continu IronHorse Iron HorseMTPM-P10-1JK43
Écran LCD officiel de la Fondation Raspberry Pi 7 po RaspberryPiB0153R2A9I (ASIN)
PicoBorg Reverse - Contrôle de moteur avancé pour Raspberry PiPiBorgBURN-0011
Pololu Carrier avec capteur de distance numérique Sharp GP2Y0D810Z0F 10cmPololu1134
Ruland PSR16-5-4-A Accouplement à vis de réglage, Aluminium poli, Pouce, 5/16 » Alésage A Diamètre, 1/4 » Alésage B Diamètre, 1 » OD, 1-1/4 » Longueur, 44 lb-in Couple nominalRulandPSR16-5-4-A
Polyéthylène glycol monométhyl étherSigma Aldrich202495
Chlorure de méthanesulfonyleSigma Aldrich471259
ToluèneSigma Aldrich179418
Toluène, AnhydreSigma Aldrich244511
TriéthylamineSigma AldrichT0886
Celite 545 (Terre de diatomées)Sigma Aldrich419931
DichlorométhaneSigma Aldrich
Éther diéthyliqueSigma Aldrich296082
N,N-Diméthylformamide, anhydreSigma Aldrich227056
Carbonate de potassiumSigma Aldrich791776
Acide thioacétiqueSigma AldrichT30805
TétrahydrofuraneSigma Aldrich360589
Aluminium oxyde, neutre, activé, Brockmann ISigma Aldrich199974
Solution de méthoxyde de sodium, 0,5 M dans du méthanolSigma Aldrich403067
Sulfure de propylèneSigma AldrichP53209
Acide acétiqueSigma AldrichA6283
MéthanolSigma Aldrich320390
Solution d’hydroxyde de sodium 1,0 NSigma AldrichS2770
Eau sans endotoxinesGE Healthcare Life SciencesSH30529.01
Bandelettes de pH en papierFisher Scientific13-640-508
Sans endotoxines Dulbecco’s PBS SigmaAldrichTMS-012
Flacons à scintillation en verre borosilicatéFisher Scientific03-337-4
1 mL seringue tout plastiqueThermo ScientificS75101
Sepharose CL-6BSigma AldrichCL6B200
Colonne de chromatographie liquideSigma AldrichC4169
CIJ mélangeur, HDPECustom
Triton X-100Sigma AldrichX100
Solution de peroxyde d’hydrogèneSigma Aldrich216763
HEK-Blue hTLR4InvivoGenhkb-htlr4
RAW-Blue CellsInvivoGenraw-sp
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1
PYROGENT Gel Caillot LAL AssaysLonzaN183-125
Plate-forme de roulement linéaire 320269

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Discher, B. M., et al. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
  3. Vasdekis, A. E., Scott, E. A., O'Neil, C. P., Psaltis, D., Hubbell, J. A. Precision intracellular delivery based on optofluidic polymersome rupture. ACS Nano. 6 (9), 7850-7857 (2012).
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