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Article de méthode

Culture de tissus ovariens pour visualiser les phénomènes dans les ovaires de souris

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DOI :

10.3791/57794

⸱

19 juin 2018

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1Department of Physiology, Aichi Medical University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 3Department of Maternal and Perinatal Medicine, Nagoya University Hospital

Dans cet article

Résumé

Les cultures de tissus ovariens peuvent être utilisés comme modèles de l’atrésie folliculaire développement, ovulation et follicule et indiquer les mécanismes de régulation de processus ovariens dynamiques.

Résumé

Chez les mammifères femelles ovulent périodiquement un nombre d’ovocytes presque constant au cours de chaque cycle oestrus. Pour soutenir cette régularité et la périodicité, la régulation se fait au niveau de l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique et sur le développement de follicules dans l’ovaire. Malgré des études actives, les mécanismes de développement folliculaire ne sont pas claires, en raison des plusieurs étapes de l’activation de dormance follicule primordial à l’ovulation et la complexité de la réglementation qui diffère à chaque phase folliculaire. Afin d’étudier les mécanismes de développement folliculaire et la dynamique des follicules au cours du cycle oestral, nous avons développé un modèle de culture de tissus ovariens de souris qui peut être utilisé pour observer le développement folliculaire à l’aide d’un microscope. Développement systématique de follicule, l’ovulation périodique et l’atrésie folliculaire peuvent être reproduits dans le modèle de l’ovaire cultivées, et les conditions de culture peuvent être modulées de façon expérimentale. Ici, nous démontrons l’utilité de cette méthode dans l’étude des mécanismes de régulation du développement folliculaire et d’autres phénomènes ovariennes.

Introduction

Ovaires de souris femelles contiennent plusieurs milliers de follicules1, et l’ovulation périodique mûrit environ dix ovocytes à chaque cycle oestrus. Follicules sont classées en plusieurs stades de développement : primordial, primaire, secondaire, antre et follicules de Graaf, selon la forme de la couche cellulaire de la granulosa entourant chaque ovocyte. La plupart des follicules primordiaux sont en dormance, et certains d'entre eux sont activent et se développer dans les follicules primaires à chaque cycle oestrus2. Après la phase folliculaire secondaire, le développement folliculaire est principalement régie par gonadotrophines, folliculaires stimulante (FSH) et l’hormone lutéinisante (LH). Cependant, développement du follicule primordial et primaire est indépendant de gonadotrophine et les mécanismes de régulation qui régissent ces étapes restent mal inderstood3,4,5. En plus de facteurs de croissance et les hormones, le follicule primordial et primaire est régi par les interactions entre les follicules6,7. Donc, nous avons effectué des analyses de la dynamique du follicule dans les tissus de souris ovaire et a étudié les mécanismes de régulation associés à l’aide de cultures de tissus ovariens8,9,10.

Ici, nous présentons deux méthodes de modèle de culture de tissu ovarien. Le premier est utilisé pour analyser le développement folliculaire par mesure des zones folliculaires, et le second est utilisé pour étudier le mécanisme de régulation au début du développement folliculaire de primordiale au stade de follicule secondaire avec des souris transgéniques. Pour l’analyse du développement folliculaire, nous avons utilisé principalement ovaires de souris femelles 4 - semaine vieux parce qu’ils permettent de faciliter la visualisation des follicules. Pour induire l’ovulation périodique et élaboration d’un modèle in vivo follicule, nous avons reproduit de LH et l’ovulation observée, l’atrésie folliculaire et la sécrétion d’estradiol dans des conditions de culture de tissus. Images des ovaires cultivées ont été capturés, et les processus de développement du follicule ont été analysées par des changements de traçage dans la région folliculaire. Toutefois, dans les analyses de champ lumineux de la microscopie, la distinction entre les follicules primaires primordiales et au début n’était pas claire. Ainsi, nous avons développé une méthode pour détecter les petits follicules et faire la distinction entre le primordial, principal, et follicule secondaire en culture des tissus ovariens à l’aide de Oogenesin1 pro3 (Oog1). 9 et les ovaires de souris transgéniques R26-H2B-mCherry 0 et 4 jours après la naissance,11. Oog1 expression est détectable dans les ovocytes après l’entrée en méiose et augmente progressivement avec le développement du follicule, permettant l’observation de la transition de primordial à follicules primaires en utilisant des images de Time-lapse du tissu de l’ovaire cultivées11 ,,12. Même si les méthodes morphologiques ont servi à étudier les facteurs qui activent des follicules primordiaux dormants13,14,15,16, développement physiologique de follicules dans les ovaires est difficile à observer, et les effets de divers facteurs restent indéterminés. Les méthodes actuelles de culture ont été conçus pour répondre à cette pénurie en temps réel des analyses de facteurs de la cible.

Dans la présente étude, nous avons suivi le développement folliculaire à l’aide d’une méthode d’imagerie Time-lapse et caractérisé le processus du développement folliculaire. Nos nouvelles méthodes offrent un outil sans précédent pour l’étude de la physiologie des ovaires.

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Protocole

Souris ont été logés dans une environnement contrôlée chambre à 23 ± 1 ° C, avec un cycle foncé h de lumière/12 12 h. Expériences et protocoles de soins des animaux ont été effectuées conformément aux directives pour l’expérimentation animale à l’Université médicale de Aichi et ont été approuvés par le Comité de l’emploi et les animalerie titulaires.

1. préparation du milieu de Culture et de la vaisselle

  1. Pour préparer le milieu de culture de base, ajoutez le sérum fœtal (SVF, 5 % v/v), FSH (100 mUI/mL), LH (10 mU/mL) et la pénicilline-streptomycine (pénicilline, 100 U/mL, streptomycine, 100 mg/mL) au minimum indispensable moyen alpha (MEM-alpha) et mélanger en tubes de 50 mL.
    Remarque : Le volume Total de milieux de culture requis varie selon les expériences, mais 1 mL de milieu de culture est généralement suffisant pour récipients de culture 3,5 cm fond en verre.
  2. Verser 1 ml de milieu de culture mixte dans Pétri de 3,5 cm fond en verre et placer des inserts de culture cellulaire lieu 30 mm en plats. Réchauffez les plats dans un incubateur (5 % de CO2 et 37 ° C) et les médias.

2. préparation de tissu ovarien

  1. Tamponnée au phosphate Préchauffez salin (PBS) (−) et MEM-alpha contenant 5 % FBS, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 100 mg/mL dans un incubateur (5 % de CO2 et 37 ° C).
    NOTE : Environ 3 mL aliquotes de PBS (−) par l’ovaire sont suffisants pour une utilisation au cours de la dissection de l’ovaire, et 1 ml de MEM-alpha n’est pas pour stockage transitoire des ovaires unique dans les plats de 3,5 cm.
  2. Exciser les ovaires des 4 - semaine vieilles souris ICR (nommé d’après l’Institut du cancer) femelles et couper les tissus entourant l’ovaire à l’aide de ciseaux et pince à épiler sous un microscope stéréoscopique. Réserver les ovaires retirés en milieu de culture (Voir l’étape 2.1) jusqu'à utilisation.
    1. Place des ovaires unique sur papier filtre imbibés de préchauffée PBS (−) (reportez-vous à l’étape 2.1) et tranche en 4 morceaux à l’aide d’une lame microtome sous un microscope stéréoscopique.
      Remarque : Les ovaires de 4 - semaine vieilles souris ICR sont environ 2 mm de diamètre. Le nombre de pièces dépend de la taille des ovaires ; Cependant, environ 500 µm morceaux épais permettant observations bon follicule (en morceaux plus épais que 500 mm, transparence du tissu est diminuée ; en morceaux plus mince que 500 mm, de nombreux follicules antraux sont brisés et perdus).
    2. Après dissection, placer les spécimens de l’ovaire en tranches dans le milieu de culture pré chauffé dans les plats de 3,5 cm (reportez-vous à l’étape 2.1).

3. ovaire Culture de tissus

  1. Déposer environ 0,5 µL de milieu de culture par tranches de tissus ovariens sur l’insert de culture cellulaire où le tissu ovarien sera définie à l’aide d’une micropipette.
  2. Placer chaque échantillon en tranches dans une goutte de milieu de culture sur les inserts de culture cellulaire à l’aide de la pince à épiler.
  3. La culture des tissus de l’ovaire à 5 % de CO2 à 37 ° C.
  4. Remplacer le milieu de culture avec un milieu frais préchauffé tous les 2 jours.
    NOTE : Le calendrier des changements moyens pour la culture des sections d’ovaire de 4 - semaine vieilles souris ICR est présenté dans la Figure 1.
    1. Pour reproduire le pic de LH, traiter cultivées 4 - semaine vieux ovaires de souris ICR avec un milieu contenant 100 mU/mL FSH et LH pendant 12 h tous les 4 jours (Figure 1).

4. microscope Images d’ovaires cultivées

  1. Démarrez les ovaires cultivées d’imagerie après jour 1 lorsque les tissus ayant adhéré aux traités sur les inserts de culture cellulaire et effectuer des analyses de microscopie confocale ou ombiliqués à intervalles de 24 heures pour permettre la croissance folliculaire suffisante entre les points dans le temps.
    NOTE : Microscopie confocale est supérieure à la microscopie inversée pour l’observation des follicules dans les ovaires de toute cultures.

5. Time-lapse imagerie des ovaires cultivées

  1. Optimiser les conditions d’imagerie Time-lapse, y compris le laser des intensités et des durées d’exposition, pour le système d’imagerie (tableau 1).
    1. Sélectionnez ovaire appariés échantillons provenant de souris unique pour une utilisation comme groupes de traitement et de contrôle. Varier les intensités de laser et de la durée d’exposition pour obtenir les meilleures images (tableau 1).
    2. Comparer la croissance folliculaire dans chaque condition de culture de mesurer des surfaces de follicule en images des échantillons témoins à 24 h d’intervalle et en Time-lapse échantillons d’imagerie (voir étape 6). En même temps, compter le nombre d’ovocytes ovulés dans chaque ovaire et choisir les conditions optimales d’imagerie Time-lapse.
  2. Capturer des images à des intervalles de 30 min à l’aide du système d’imagerie Time-lapse dans les conditions déterminées (tableau 1).

6. analyse de la croissance folliculaire

  1. Pour analyser le développement du follicule, mesurer les surfaces de follicule dans les images capturées à l’aide de logiciels ImageJ (http://resbweb.nih.gov/ij/).
    1. Au début, définissez l’échelle de l’image en cliquant sur « Définir échelle » sous « Analyze » dans la barre d’outils. Écrire les longueurs de côté de l’image capturée et les numéros correspondants de pixels dans les champs vides de « Distance connue » et « Distance en pixels », respectivement.
    2. Cliquez sur « Mains libres » dans la barre d’outils et précisent les follicules dans les images capturées champ lumineux.
    3. Cliquez sur « Mesure » sous « Analyze » dans la barre d’outils.
      Remarque : Si d’autres données de mesure sont souhaitées, cliquez sur « Set mesure » sous « Analyze » dans la barre d’outils et cochez les cases appropriées dans la liste.

7. l’analyse du développement folliculaire à l’aide de souris transgéniques

  1. Recueillir des ovaires de 0 et 4 (P0 et P4) femelles transgéniques contenant les transgènes Oog1pro3.9 et R26-H2B-mCherret la culture sur plaquettes comme décrit dans étapes 1.1 – 3.2, sauf ne pas jours tranche le P0 et ovaires P4.
  2. Remplacer le milieu de culture avec milieu frais, préchauffé dans les plats de 3,5 cm dans un incubateur contenant 5 % de CO2 à 37 ° C tous les 2 jours.
    Remarque : La concentration de LH dans le milieu de culture des ovaires P0 et P4 peut rester constante car les surtensions LH n’existent pas chez les souris P0 et P4.
  3. Régler le microscope de visualiser les follicules primaires à seulement AcGFP1-positifs dans les ovaires de P4 (tableau 1).
    Remarque : Les follicules primaires et seulement primordiales sont présents dans les ovaires de souris femelle P4.
  4. Capturer des images de la culture P0 Oog1pro3.9/ ovaires de souris transgéniquesR26-H2B-mCherry à des intervalles de 30 min en utilisant les paramètres utilisés pour les ovaires P4 (voir étape 5.2).
  5. Retracer et analyser le développement folliculaire à l’aide de signaux AcGFP1 et H2B-mCHerry.

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Résultats

La figure 1 montre le protocole pour les changements dans les médias au cours de la culture de tissus ovarienne. Suite à ce programme, les ovaires de souris ICR 4 semaines ont été cultivés et imagé à intervalles de 24 h à l’aide de la microscopie confocale (Figure 2). Au cours de la culture de tissus de l’ovaire pendant 3 semaines, plus de follicules antrums et secondaires ont dégénéré de l’atrésie folliculaire et certains étaien...

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Discussion

Dans cette étude, nous avons développé deux nouvelles méthodes pour l’étude de développement folliculaire dans les ovaires de souris. La première méthode consiste en l’élevage des tissus en tranches ovarienne chez la souris adulte suivie d’analyses du développement folliculaire, et la seconde implique l’utilisation de Time-lapse d’imagerie afin de visualiser le développement folliculaire précoce pendant la phase de gonadotrophine indépendant. Auparavant, nous avons utilisé la méthode de culture de tissus ovaire présente ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Dr Naojiro Minami (Université de Kyoto) pour fournir les souris Oog1pro3.9 . Cette recherche a été financée par la SJPS (KAKENHI # JP15H06275) et la Fondation de Nitto.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Hormone folliculostimulante de l’hypophyse humaineSIGMAF4021
Hormone luténisante de l’hypophyse équineSIGMAL9773
Solution de pénicilline-streptomycineWako Pure Chemical Industries168-23191
MEM a, GlutaMax, sans nucléotidesThermo Fisher32561037
Plat à fond de verreMatTekP35G-0-10-CPlat de 35 mm, lamelle n° 0, diamètre du verre de 10 mm
Insert de culture cellulaire MillicellMerck MilliporePICM0RG50Diamètre : 315 mm, taille des pores : 0,4 mm, matériau : PTTE hydrophile
3,5 cm Plats de culture cellulaireGreiner Bio-One627160
50ml / Tube à centrifuger avec capuchon d’étanchéité tripleIWAKI2345-050
Lames jetables à profil bas 819Leica14035838925
LSM 710Carl ZeissMicroscope confocal
CellVoyager, CV1000Yokogawa Electric CorporationImagerie en accéléré
BZ-X700KEYENCEImagerie en accéléré

Références

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