Nous présentons ici un protocole pour une purification efficace seule étape de l’humain sans balise active dix-onze translocation-2 (TET2) 5-méthylcytosine dioxygénase utilisant la chromatographie échangeuse d’ions et son dosage à l’aide d’une masse en tandem par chromatographie liquide spectrométrie (LC-MS/MS)-approche de base.
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Article de méthode
Purification efficace et LC-MS/MS-based test développement pour dix-onze Translocation-2 5-méthylcytosine Dioxygenase
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La régulation de la transcription épigénétique médiée par la 5-méthylcytosine (5mC) a joué un rôle essentiel dans le développement eucaryote. La déméthylation de ces marques épigénétiques s’effectue par oxydation séquentielle de dix-onze translocation dioxygénases (TET1-3), suivie par la thymine-DNA glycosylase dépendant base excision de réparation. L’inactivation du gène TET2 due à des mutations génétiques ou par d’autres mécanismes épigénétiques est associée à un mauvais pronostic chez les patients atteints de divers cancers, surtout des malignités hématopoïétiques. Nous décrivons ici une purification efficace seule étape d’enzymatiquement actif non balisés humaine TET2 dioxygénase chromatographie échangeuse de cations. Nous fournissons également une approche liquid chromatography-spectrométrie de masse (LC-MS/MS) qui peut séparer et quantifier les quatre bases normales de l’ADN (A, T, G et C), ainsi que les quatre bases de cytosine mis à jour le (méthyl-5, 5-hydroxyméthyle, formyl-5 et 5-carboxylique). Ce test peut être utilisé pour évaluer l’activité de type sauvage et mutant TET2 dioxygénases.
Introduction
La position de C5 des bases cytosine dans dinucléotides est le site de méthylation prédominant (5mCpG) dans les génomes de mammifères,1. En outre, un certain nombre d’études récentes ont mis au jour une vaste méthylation de cytosine C5 (5mC) dans des sites non-CpG (5mCpH, où H = A, T, ou C)2,3. modification de 5MC sert un silencieux transcriptionnel rétrotransposons endogènes et gènes promoteurs3,4,5. Méthylation de l’ADN à 5mC joue également un rôle important dans l’inactivation du chromosome ....
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Protocole
1. le clonage et la Purification de TET2 humaine non balisés Dioxygenase
- Clonage humain TET2 dioxygénase (1129-1936, TET2 Δ1481-1843) dans le vecteur de destination de pDEST14 à l’aide de la technique de recombinaison site-spécifique comme décrit précédemment22.
Remarque : Les études antérieures ont démontré que le domaine C-terminal TET2 dioxygénase (1129-1936, TET2 Δ1481-1843) est les minimes domaine catalytiquement active21,23. Afin d’exprimer le domaine de dioxygénase TET2 non balisé à l’aide du vecteur pDONR221, séquences Shine Dalgarno et Kozak ont été incorporées dan....
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Résultats
Modification dynamique de 5mC dans l’ADN par TET-famille dioxygénases joue un rôle important dans les règlements transcriptionnelles épigénétiques. TET2 dioxygénase est fréquemment muté dans diverses malignités hématopoïétiques12. Afin d’étudier le rôle de l’enzyme de TET2 dans le développement normal et la maladie, nous avons cloné son domaine catalytiquement actif minimal sans n’importe quelle balise d’affinité dans le vecteur de pDEST1422.......
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Discussion
Des mutations du gène TET2 sont quelques-uns des changements génétiques plus souvent détectés chez les patients atteints de divers cancers hématopoïétiques. À ce jour des centaines de différentes mutations TET2, incluent un non-sens, cadre-Maj et mutations faux-sens, ont été identifiées dans les patients de12. Les patients présentant des mutations de TET2 montrent des niveaux faibles de génomique 5hmC dans la moelle osseuse, comparée à ceux qui wt-TET214. Mutant
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun intérêt financier à déclarer.
Remerciements
Cette recherche a été financée par le département américain de la défense sous la forme d’un Idea Award (W81XWH-13-1-0174), l’anémie aplastique & la MDS subvention de la Fondation, et grant UMRB de M.M. Authors remercie Mohit Jaiswal et Subhradeep Bhar clonage initiale de TET2 dans le vecteur pDEST14.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Sulfate de fer(II) heptahydraté | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| &alpha ;-Acide cétoglutarique (acide 2-oxoglutarique) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| Acide L-ascorbique | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Acide éthylènediaminetétraacétique sel disodique dihydraté | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Acétate d’ammonium | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acétonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Eau de qualité HPLC | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo propre et concentrateur | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nucléase | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (phosphatase alcaline intestinale de veau) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Chlorure de sodium | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycérol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sel de sodium | Berry & ampère; Associés | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-désoxycytidine | Berry & Associés | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Déoxyadénosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Déoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Déoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Technologie Gateway | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifugeuse ; | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| Ä ; Système KTA FPLC | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| Système de lyophilisation FreeZone 4.5 | Labconco | 7750020 | |
| Colonnes de purification Zymo Oligo | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 colonne | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap spectromètre de masse | AB Sciex | ||
| HPLC ; | HPLC de Shimadzu ; | ||
| XK16/20 Colonne FPLC | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
Références
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341
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Réimpressions et autorisations
