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Article de méthode

Un Flexible Low Cost système hydroponique, évaluer les réactions des plantes à petites molécules dans des Conditions stériles

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DOI :

10.3791/57800

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25 août 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE), Brazilian Center for Research in energy and materials (CNPEM), 2University of Campinas (UNICAMP), 3University of Viçosa (UFV), 4CTBE, CNPEM, 5Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE/CNPEM), Max Planck Partner Group

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Un système hydroponique simple, polyvalent et économique le in vitro a été optimisé avec succès, permettant à des expériences à grande échelle dans des conditions stériles. Ce système facilite l’application de produits chimiques dans une solution et leur absorption efficace par les racines pour les études moléculaires, biochimiques et physiologiques.

Résumé

Une large gamme d’études en biologie végétale sont effectuées à l’aide de cultures hydroponiques. Dans ce travail, un système hydroponique croissance in vitro conçu pour évaluer les réactions des plantes aux produits chimiques et autres substances d’intérêt est présenté. Ce système est très efficace pour obtenir des semis homogènes et saines des C3 C4 espèces de modèle Arabidopsis thaliana et Setaria viridis, respectivement. La culture stérile évite les algues et la contamination du micro-organisme, qui sont connus des facteurs limitants pour la croissance normale des plantes et le développement en culture hydroponique. En outre, ce système est évolutif, permettant la récolte de matériel végétal à grande échelle avec des dommages mécaniques mineurs, ainsi que la récolte des différentes parties d’une plante, si vous le souhaitez. Un protocole détaillé démontrant que ce système a un assemblage facile et peu coûteuse, puisqu’elle utilise les grilles de la pipette comme plate-forme principale pour cultiver des plantes, est fourni. La faisabilité de ce système a été validée à l’aide de Arabidopsis semis pour évaluer l’effet de la drogue AZD-8055, un inhibiteur chimique de la cible de la rapamycine (TOR) kinase. L’inhibition de TOR a été efficacement détectée dès 30 min après un traitement de AZD-8055 dans les racines et les pousses. En outre, les plantes traitées AZD-8055 affichent le phénotype d’amidon-excédent prévu. Nous avons proposé ce système hydroponique comme une méthode idéale pour les chercheurs de plantes visant à surveiller l’action des plantes inducteurs ou inhibiteurs, ainsi quant à évaluer les flux métaboliques à l’aide de composés de marquage isotopique qui, en général, nécessite l’utilisation du cher réactifs.

Introduction

Les avantages de la croissance des plantes à l’aide de culture hydroponique ont été largement reconnus dans la production des plantes grandes et uniformes, permettant des expériences reproductibles1,2,3. Dans ce système, la composition de la solution nutritive peut être correctement contrôlée et recyclée le long de toutes les étapes de la croissance des plantes et le développement. En outre, racines ne sont pas soumis aux stress abiotiques, comme cela peut arriver dans les plantes en terre, tels que des éléments nutritifs famine et eau carence en4. Comme plantes cultivées hydroponically présents caractéristiques morphologiques et physiologiques assez semblables à celles cultivées dans le sol, ce système a été largement employé dans la recherche car elle permet la surveillance de la croissance de la racine/tige et leur récolte sans blessures2,5.

En raison de la possibilité de modifier la composition et la concentration de la solution nutritive, la plupart des recherches à l’aide de conditions de culture hydroponiques a été effectuée pour caractériser les fonctions du micro et macronutriments1,3 ,6,7,8. Cependant, ce système s’est avéré pour être très utile pour un large éventail d’applications en biologie végétale, de nature à élucider les fonctions des hormones et de produits chimiques dans les usines. Par exemple, la découverte des strigolactones comme une nouvelle classe d’hormones9 et le phénotype d’une croissance accélérée déclenchée par brassinostéroïde demande10 ont été effectuées dans des conditions de culture hydroponiques. En outre, ce système permet des expériences avec des isotopes marqués (par exemple, 14N /15N et 13CO2)11,12 pour évaluer leur incorporation dans les protéines et de métabolites par spectrométrie de masse.

Compte tenu de l’importance de ce système en recherche sur les plantes, un grand nombre de cultures hydroponiques a été conçu dans les années précédentes, y compris les systèmes qui utilisent (i) le transfert des semis de plaques à conteneurs hydroponique3, 13; (ii) laine de roche qui limite l’accès aux premiers stades de la racine développement2,14,15; (iii) granulés de polyéthylène comme le corps flottant, ce qui rend l’application homogène des petites molécules/traitements difficiles16; ou (iv) un réduit nombre de plantes9,17. Le volume des réservoirs hydroponiques décrit dans plusieurs de ces protocoles sont généralement volumineux (petits volumes allant de 1 à 5 L, jusqu'à 32 L)18, ce qui rend l’application de produits chimiques extrêmement coûteux. Bien que peu d’études décrivent une culture hydroponique sous conditions aseptiques8,19, l’Assemblée du système est généralement très laborieux, consistant en l’ajustement parfait des mailles de nylon en plastique ou en verre conteneurs5,8,17,20.

En raison de l’importance de l’Arabidopsis thaliana comme une plante modèle, la majorité des systèmes de culture hydroponique ont été conçue pour cette espèce1,2,8,14,18, 19 , 20. Néanmoins, il existe quelques études présentant les caractéristiques de la culture hydroponique d’autres espèces végétales avec un prétraitement des semences pour améliorer leur germination et synchronisation des taux in vitro8,16 . Afin de travailler sur une grande échelle, nous avons développé un protocole pour la mise en place d’un système hydroponique de maintenance simple et peu coûteuse qui permet des conditions stériles pour la culture de plantes, dont a. thaliana et autres espèces, comme l’herbe Setaria viridis. La méthode décrite ici est adaptée aux différentes expériences, comme la croissance des semis peut être maximisée, synchronisée et facilement contrôlée. En outre, ce système présente de nombreux avantages comme : (i) son montage est simple et ses composants peuvent être réutilisés ; (ii) elle permet l’application facile des différents produits chimiques dans le milieu liquide ; (iii) les semis germent et poussent directement dans le milieu de culture sans la nécessité du transfert vers le système de culture hydroponique ; (iv) la développement/croissance caulinaire et racinaire peut être étroitement surveillée et les semis sont récoltées sans dommages-intérêts ; et (v) elle permet de travailler sur une grande échelle, maintenir des conditions physiologiques.

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Protocole

1. préparation des milieux de Culture liquides et solides

  1. Préparer un milieu liquide à l’aide de milieu de Murashige et Skoog (MS) de force avec les vitamines [0,0125 mg/L de cobalt (II) chlorure pentahydraté, 0,0125 mg/L de sulfate de cuivre (II) pentahydraté, 18,35 mg/L de sodium ferrique de tétrasodium, 3,10 mg/L de l’acide borique, 0,415 mg/L d’iodure de potassium, 8,45 mg/L de manganèse sulfate monohydrate, 0,125 mg/L de sodium molybdate dihydraté, 4,30 mg/L de sulfate de zinc heptahydraté, 166,01 mg/L de chlorure de calcium, 85 mg/L de phosphate monopotassique, 950 mg/L de nitrate de potassium, 90,27 mg/L de sulfate de magnésium, 825 mg/L de nitrate d’ammonium, 1 mg/L de la glycine, 50 mg/L de myo-inositol, 0,25 mg/L d’acide nicotinique, 0,25 mg/L de chlorhydrate de pyridoxine et 0,05 mg/L de chlorhydrate de thiamine] additionné de 0,25 g/L de MES et ajuster le pH à 5,8 avec 10 M KOH.
  2. Ajouter 10 g/L d’agar pour créer un milieu MS-solide de force. Stériliser le milieu à 121 ° C pendant 20 min avant de l’utiliser.

2. hydroponique système de montage

Remarque : Ces étapes doivent être suivies méticuleusement pour construire le système hydroponique.

  1. Stérilisation de matériel
    1. Emballer dans le sac de l’autoclave l’embout de la pipette racks (sans cache) qui servira de minitanks. Autoclave les grilles à 121 ° C pendant 20 min, 15 lb/po2.
      Remarque : Le panier de pointe de pipette en polypropylène, nous avons utilisé a les dimensions suivantes : 120 mm (longueur) x 89 mm (largeur) x 55 mm (hauteur). La surface plane de pointe de pipette doit avoir un espace pour l’ajout de milieu de culture. Autres supports de pointe peuvent être utilisés (voir Table des matières).
      Remarque : Tout au long de la procédure de montage du système hydroponique, il est nécessaire d’utiliser une hotte à flux laminaire, qui doit être nettoyée et désinfectée avec avant l’utilisation d’éthanol à 70 %. L’expérimentateur doit porter une blouse de laboratoire, se laver les mains et toute exposées de la peau et les désinfecter avec l’éthanol à 70 %. Gants sont facultatifs, à l’exception de la demande de drogue.
    2. Nettoyez tous les accessoires décrits ci-dessus (boîtes en plastique jetables, ruban adhésif, pipettes, ciseaux et pinces à épiler) avec l’éthanol à 70 % avant d’entrer dans la hotte à flux laminaire. Si la hotte permet, allumez la lumière UV pendant 10 min avant l’assemblage du système hydroponique afin de maintenir la zone de travail décontaminée.
  2. Minitank assemblage
    1. Sceller la surface supérieure de l’embout de la pipette plat avec du ruban adhésif (Figure 1 b). Si possible, laisser sous exposition aux UV lumière pendant 10 min.
    2. Ajouter 180 µL fondu solid MS du milieu de culture (tiède) pour chaque bien en utilisant une pipette multicanaux (Figure 1).
      Remarque : Lors de la préparation de nombreux chars, utiliser une plaque chauffante pour empêcher le milieu MS de solidification.
    3. Laisser le milieu solidifier complètement (pour environ 30 min).
      Remarque : Au cours de la période de la solidification, la lumière UV peut être allumée.
    4. Remplir le panier de pointe de pipette complètement avec milieu de culture liquide MS (Figure 1) et s’assurer il y a un contact étroit entre le solide et le milieu liquide.
    5. Retirez les bandes adhésives de l’extrados de l’embout de la pipette plat et montez-la sur le rack avec soin. Le système hydroponique est maintenant prêt à recevoir les graines stérilisées.

3. la stérilisation des semences

  1. Placer 500 graines d’Arabidopsis dans un microtube 1,5 mL. Servir de microtubes nécessaires selon le nombre de plants nécessaires à l’expérience.
  2. Laver les graines avec de l’éthanol 70 % pendant 2 min avec une agitation douce. Laisser les graines s’installent, puis retirer l’éthanol avec précaution.
  3. Ajouter 1 mL d’une solution d’hypochlorite de sodium 10 % contenant 2 µL de détergent polysorbate 20. Agiter la solution pendant 5 min. Retirer la solution avec précaution.
  4. Rincer les graines à l’eau distillée stérile jusqu'à ce que tous les résidus d’eau de Javel sont complètement retirés (environ 5 x).
    NOTE : Après la stérilisation en surface, les graines ont été immergés dans l’eau distillée stérile et stratifiées à 4 ° C dans l’obscurité pour 5D synchroniser la germination.
    NOTE : Graines de Setaria viridis (adhésion A10.1) sont préincubés dans l’acide sulfurique concentré pendant 15 min (briser la dormance physique), lavés dans l’eau distillée stérile et puis désinfectées avec une solution d’hypochlorite de sodium 5 % contenant 0,1 % de polysorbate 20 pendant 5 min avec une agitation douce21. Les étapes restantes de stérilisation étaient identiques à celles décrites pour les graines d’Arabidopsis .

4. Application de semences

  1. Couper légèrement l’extrémité d’une pointe µL 200 à l’aide d’un scalpel stérile.
  2. Pipetter les graines d’Arabidopsis dans le milieu de culture solid sur la surface supérieure du plat de la pipette. Veiller à ce que le milieu ne pas desserrer de l’appartement ; Sinon, les graines sont ombrées et les plants ne seront développera pas correctement (Figure 1E).
    Remarque : Utilisez une pince stérile pour graines Setaria (avec l’embryon positionné vers le haut).
  3. Stocker minitanks autant que possible à l’intérieur d’une boîte en plastique jetable pour maintenir une humidité élevée et de garder l’environnement exempt de micro-organismes (Figure 1F).
  4. Scellez la boîte en plastique jetable soigneusement à l’aide de ruban adhésif pour éviter toute contamination.
  5. Placer les systèmes hydroponiques dans une chambre de culture avec les conditions de croissance approprié pour l’usine d’intérêt.
    Remarque : Dans ce travail, les conditions suivantes ont été utilisées : 75 % d’humidité et 150 µmol m-2 s-1 d’éclairement et de conditions équinoxiales de 12 h de lumière (21 ° C) / 12 h d’obscurité (19 ° C) d’Arabidopsis, ou 300 µmol m-2 s-1 de irradiance et 12 h de lumière (28 ° C) / 12 h d’obscurité (25 ° C) pour Setaria (Figure 1 et 1 H).

5. valider l’utilisation de ce système hydroponique pour inhiber la cible de la rapamycine Kinase

Remarque : Ce système hydroponique a été initialement développé pour faciliter l’administration de substances chimiques aux plantes, qui, en général, sont très chers à appliquer dans les expériences à grande échelle. Comme une preuve de concept, l’inhibiteur compétitif ATP AZD-8055, qui est connu pour cibler spécifiquement le site de liaison ATP du TOR protéine kinase22, a été utilisé pour suivre la répression de l’activité chez les plantules d’a. thaliana Columbia-0 (TOR Le Centre de Nottingham Arabidopsis Stock, NASC ID : N22681). Ici, le protocole utilisé est brièvement décrit.

  1. Hydroponique graines jusqu'à ce stade 1.04 selon le BBCH échelle23 (pour environ 11 jours) dans les conditions climatiques décrites ci-dessus. Remplacer la solution nutritive, soit avec frais moyen contenant 0,05 % DMSO (contrôle), 2 µM AZD-8055 (inhibiteur de la TOR) dilué dans le DMSO ou sans traitement (mock), à la fin de la nuit (fr).
  2. Récolter des semis à des moments différents après le traitement et séparez-les dans les racines et les pousses. Congeler les échantillons dans l’azote liquide, broyer en une poudre fine dans un broyeur de robotique (voir Table des matières) et conserver la poudre à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
  3. Immunoblot contre formes phosphorylées et non-phosphorylés de 40 s protéine ribosomale S6 (RPS6) selon Dobrenel et al. 24.
  4. Semis intacts pour dépigmentation de l’échantillon d’eau de Javel, lavez-les à l’eau distillée, les plonger dans une solution d’iode pour 5 min25et photographier les semis dans un stéréomicroscope (0,63 X 7,5 grandeur x objectif et rapprochement de x 20) pour un évaluation qualitative de l’amidon.
  5. Quantifier l’amidon suite à la dégradation enzymatique et la mesure du glucose libéré par spectrophotométrie par couplant à la réduction du PNDA+ à NADPH26,27.
  6. Effectuer une extraction d’ARN totale, une synthèse de cDNA et dosages quantitatifs de RT-PCR comme décrit par Caldana et al. 28 pour évaluer le niveau d’expression des gènes liés à différentes sortes de contraintes.
  7. Éventuellement, cultiver des semis sur un substrat horticole dans des pots en plastique d’une contenance de 0,1 L sous des conditions climatiques similaires [60 % d’humidité, 150 µmol m-2 s-1 de l’éclairement énergétique et équinoxiales conditions de 12 h de lumière (21 ° C) / 12 h d’obscurité (19 ° C )] afin de les comparer avec les plantules cultivées hydroponically.
    Remarque : Les gènes cibles utilisées pour les essais d’expression de gène ont été ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), et TPS5 (At4g17770) et leurs niveaux d’expression ont été normalisées qui emploient la méthode delta-Ct29 à l’aide de Act2 (At3g18780) ou PDF2 (At4g04890) comme les gènes de référence interne, en supposant que 100 % de l’efficacité de l’amplification PCR dans l’ensemble de tous les échantillons. Les paires d’oligonucléotide utilisés pour la PCR quantitative ont été : ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC ; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG ; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC ; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG ; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG) et PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC ; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).

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Résultats

La kinase TOR est un régulateur majeur qui intègre des éléments nutritifs et l’énergie de signalisation promouvoir la prolifération cellulaire et la croissance chez tous les eucaryotes. Efforts pour élucider les fonctions de TOR chez les plantes incluent la génération d’Arabidopsis lignées transgéniques contenant répression conditionnelle TOR via l’interférence ARN ou des micro-ARN artificiels28,30,

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Discussion

Cette structure hydroponique optimisée permet la culture réussie in vitro de plantes. Les graines germent bien sur le milieu solide à la surface plane de pointe de pipette, un gain considérable par rapport aux systèmes où les graines sont trempées avec la solution nutritive. Un grand avantage de ce système est que, pendant le développement de la plantule, racines obtenir directement en contact avec le milieu liquide sans avoir besoin du transfert. En outre, traitement chimique peut être facilement appliqué dans ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation de recherche de São Paulo (FAPESP ; Accorder 12/19561-0) et la Société Max Planck. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Caroline C. Monte-Bello (FAPESP ; Grant 10407-14/3), Valéria Mafra (FAPESP ; Grant 14/07918-6), et Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013) sommes reconnaissants pour les bourses. Les auteurs remercient Christian Meyer de l’Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, France) pour offrir généreusement anticorps contre RPS6. Les auteurs remercient RTV UNICAMP et Manoel Ed Paulo Aparecido de Souza pour leur soutien technique au cours de l’audio d’enregistrement.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ÉthanolMerck100983
Solution d’hypochlorite de sodiumSigma-Aldrich425044
Polysorbate 20  ;   ;Sigma-AldrichP2287
Murashige et Skoog (MS) milieu avec vitamines  ;Duchefa BiochemieM0222
2-(N-morpholino)acide éthanesulfonique (MES) monohydratéDuchefa BiochemieM1503
Agar  ;Sigma-AldrichA7921
Hydroxyde de potassiumSigma-Aldrich484016
Hotte à flux laminaireTelstarBH-100
Plaque chauffanteARECF20510011
Chambre de croissanceWeiss TechnikHGC 1514
Boîte de Pétri en verre (150 mm x 25 mm)Uniglass189.006
200 & mu; Supports de pointes de pipette L  ;KasviK8-200-5 *
300 &mu ; L pipette multicanauxEppendorf3122000060
300 &mu ; Pointes de pipette LEppendorf30073088
200 &mu ; Pipette L  ;Eppendorf3120000054
200 &mu ; Pointes de pipette LEppendorf30000870
CiseauxTramontina25912/108
Pince à épilerABC Instrumentos702915
Lame de scalpelSigma-AldrichS2771
Ruban adhésif transparent (45mm x 50m)Scotch 3M5803
Boîtes en plastique jetables, dimensions extérieures : 353 mm (L)x 178 mm (L) x 121mm ( H)Maxipac32771

Références

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