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Article de méthode

Analyse informatique des données de séquence d’écrans de 2-hybride de levure lot

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DOI :

10.3791/57802

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28 juin 2018

 ,  ,  , 
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

Dans cet article

Résumé

Séquençage en profondeur des populations de levures sélectionnées pour les interactions 2-hybride de levure positive potentiellement donne une mine de renseignements sur les protéines qui interagissent de partenaire. Nous décrivons ici l’exploitation d’outils bioinformatiques précis et à jour de logiciels sur mesure pour analyser les données de séquençage de ces écrans.

Résumé

Nous avons adapté le dosage 2-hybride de levure pour découvrir en même temps des dizaines statique et transitoire des interactions de protéine au sein d’un seul écran utilisant le séquençage de l’ADN court-lecture haut-débit. Les ensembles de données de séquence qui en résulte peut non seulement suivre quels gènes dans une population qui se sont enrichis au cours de choix pour les interactions 2-hybride de levure positive, mais également donner des informations détaillées sur les sous-domaines pertinentes des protéines permettant de l’interaction. Nous décrivons ici une suite complète de logiciels autonomes qui permettent à des non-spécialistes d’exécuter toutes la bioinformatique et les mesures statistiques pour traiter et d’analyser les fichiers de fastq de séquence ADN d’un dosage de 2-hybride de levure par lots. Les étapes de traitement visés par ces logiciels comprennent : 1) cartographie et comptage lectures de séquence correspondant à chaque candidat de protéine codée dans une bibliothèque de prey 2-hybride de levure ; 2) un programme d’analyse statistique qui évalue les profils d’enrichissement ; et 3) outils pour examiner le cadre translationnelle et la position au sein de la région codante de chaque enrichi plasmide codant pour les protéines qui interagissent d’intérêt.

Introduction

Une des façons de découvrir les interactions de protéine sont le dosage (Y2H) 2-hybride de levure, qui exploite d’ingénierie des cellules de levure qui se développent seulement quand une protéine d’intérêt se lie à un fragment d’une interaction partenaire1. Détection des multiples interactions Y2H est possible maintenant avec l’aide de séquençage massif à haut débit parallèle. Plusieurs formats ont été décrites,2,3,4,5 , y compris celle que nous avons développés où les populations sont cultivées en traitement par lots dans des conditions qui choisir pour la levure contenant des plasmides qui produisent une positive de l’interaction Y2H6. Le flux de travail nous développé, appelé DEEPN (dynamique d’enrichissement pour les réseaux d’évaluation des protéines), identifie les interactomes différentiels des bibliothèques proies même d’identifier les protéines qui interagissent avec une protéine (ou domaine) vs. une autre protéine ou un domaine de mutant conformationnellement distinct. Une des étapes principales dans ce flux de travail est un traitement convenable et l’analyse des données du séquençage de l’ADN. Certaines informations peuvent être glanées par seulement compter le nombre de lectures pour chaque gène avant et après sélection des interactions Y2H de façon analogue à une expérience de RNA-seq. Toutefois, des informations beaucoup plus détaillées peuvent être extraites de ces ensembles de données précisant le sous-domaine d’une protéine donnée qui est capable de produire une interaction Y2H. En outre, alors que l’approche DEEPN est précieuse, analysant les nombreuses répétitions d’échantillon peut être lourdes et coûteuses. Ce problème est atténué en utilisant un modèle statistique qui a été développé spécifiquement pour les ensembles de données DEEPN où le nombre de répétitions est limitée6. Pour rendre traitement et analyse des données de séquençage ADN fiable, robuste, complet et accessible pour les chercheurs sans expertise bio-informatique, nous avons développé une suite de logiciels qui couvrent toutes les étapes de l’analyse.

Cette suite de logiciels autonomes qui s’exécutent sur des ordinateurs de bureau inclut MAPster, DEEPN et Stat_Maker. MAPster est une interface utilisateur graphique qui permet à que chaque fichier fastq en file d’attente pour le mappage vers le génome en utilisant le programme de HISAT27, produisant un fichier .sam standard pour les applications en aval. DEEPN a plusieurs modules. Il assigne et compte lectures correspondant à un gène particulier semblable à une quantification de type RNA-seq en utilisant le module « Gene Count ». Elle extrait les séquences correspondant à la jonction entre le domaine transcriptional Gal4 et la séquence de proies et rassemble la position de ces jonctions pour permettre leur inspection par les tableaux comparatifs et graphiques (via le module « Junction_Make ») Le module « Blast_Query » permet de simple inspection, quantification et comparaison des séquences jonction Gal4 junction. Stat_Maker évalue les lectures par les données sur l’enrichissement des gènes statistiquement comme un moyen d’établir des priorités susceptibles Y2H hits. Nous décrivons ici la façon d’utiliser ces logiciels et d’analyser entièrement la séquence d’ADN données depuis un DEEPN Y2H experiment. Il existe des versions de DEEPN fonctionner sur les systèmes PC, Mac et Linux. Autres programmes, tels que le programme de mappage MAPster et le module de statistiques DEEPN Stat_Maker s’appuient sur les sous-routines qui fonctionnent sous Unix et sont disponibles uniquement sur les systèmes Mac et linux.

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Protocole

1. cartographie des fichiers Fastq

Remarque : DEEPN logiciels ainsi que de nombreux programmes de bio-informatique utilisent données de séquences d’ADN dans laquelle chaque séquence lire a été mappé pour sa position dans l’ADN de référence. Une variété de programmes de cartographie peut être utilisée pour ce, y compris l’interface de MAPster ici qui utilise le programme HISTAT2 pour produire des fichiers .sam utilisés dans les étapes suivantes.

  1. Mapper les données de séquence à la version correcte du génome. Pour les bibliothèques Y2H d’origine de la souris, utilisez le génome de mm10 UCSC ; pour ceux qui utilisent les gènes humains, utilisez le génome de référence hg38 UCSC, gènes de Saccharomyces cerevisiae , utilisez le génome de référence UCSC SacCer3.
  2. Installer MAPster.
    1. Télécharger le logiciel MAPster et installer. Le logiciel se trouve à l’aide d’un navigateur web suivante : https://github.com/emptyewer/MAPster/releases. HISAT2 s’exécute sur les systèmes de type Unix comme un Apple Macintosh. Pour cette raison, le programme MAPster fonctionnera uniquement sur les systèmes compatibles tels que Apple Macintosh et linux.
      NOTE : Configuration requise pour un Mac d’Apple est : OSX 10.10 +, > 4Go de RAM, > 500 Go d’espace disque et un accès internet pour le téléchargement de génomes de référence. Les utilisateurs doivent de le consulter avec un institutionnel personne si leur entreprise a des protocoles de sécurité restreignant les autorisations et les droits d’administrateur.
  3. Entrez les paramètres via l’onglet « Main » (Figure 1) et les fichiers requis. Sélectionnez le bouton « Pairwise » approprié pour entrer les fichiers soit comme paires ou non appariés avec FASTQ le format de fichier par défaut.
    1. Pour l’analyse DEEPN, mettez l’option « Pairwise » sur « Off » pour exécuter en format de lecture unique.
    2. Charger des fichiers dans MAPster par simple glisser-déposer dans la fenêtre appropriée.
    3. Sélectionner une référence de source/génome d’ADN qui correspond à la source des proies Y2H bibliothèque inserts. Indexée des génomes de plusieurs organismes modèles sont répertoriés dans la boîte « Génome » et peuvent être téléchargés automatiquement de la Johns Hopkins University Center for Computational Biology. Les génomes de référence seront stockés localement pour une utilisation ultérieure.
    4. Indiquer le nombre de processus de l’ordinateur sera consacrée au programme de cartographie sous la zone « Threads », depuis HISAT2 supporte multi-threading. MAPster recherchera l’ordinateur et indiquent le nombre maximal de processeurs disponibles par défaut.
    5. Spécifier un nom de fichier de sortie. Ce nom de fichier servira tout au long du processus DEEPN donc un nom court mais descriptif sans espace ni caractères spéciaux est recommandé. Spécifiez un dossier pour les fichiers mappés en utilisant le bouton « Open Output Directory » de sortie.
    6. Une fois que les fichiers appropriés et les paramètres ont été sélectionnés, ajouter le travail de cartographie à la file d’attente de travaux en utilisant le bouton « Add to Queue ». Les noms de fichiers dans la fenêtre principale peuvent être supprimés et remplacés par des fichiers correspondant à un nouvel échantillon et ils peuvent être ajoutés à la file d’attente après avoir fourni un nom de fichier de sortie correspondant.
    7. Cliquez sur le bouton « Lancer la file d’attente » une fois que tous les emplois sont entrées dans la file d’attente de travail.
      Remarque : Une fois un travail de cartographie a été placé dans la file d’attente, la sélection de cet emploi entraîne les paramètres à afficher dans la fenêtre « Paramètres de travail » et l’instruction de ligne de commande avec tous les arguments pour être affiché dans la fenêtre « Commande de Job ». Les options de sortie comprennent la mise en scène que ce soit pour garder les lectures qui ne parviennent pas à aligner et précisant le nombre d’alignements primaires autorisé pour chaque lecture. Le fichier de sortie par défaut de MAPster est au format SAM (par exemple un fichier « .sam »). Il contiendra toutes les lectures de séquence des fichiers fastq spécifié pour cet échantillon, y compris celles qui ont été (mappé) et n’étaient pas (non mappés) correctement mappé à la geome spécifié.

2. traitement de bioinformatique utilisation du logiciel DEEPN

NOTE : Logiciel DEEPN est actuellement compilée pour une utilisation avec des bibliothèques de proies contenant des séquences d’ADNc de souris, ADNc humain séquences ou séquences d’ADN génomique de S. cerevisiae . DEEPN accepte le format de fichier standard .sam et peut accepter un fichier SAM (.sam) contenant des lectures cartographiés et non mappés ou des fichiers séparés pour chacun les lectures non mappés et cartographiées.

  1. Télécharger le logiciel DEEPN et installer. Le logiciel se trouve à l’aide d’un navigateur web suivante : https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases. Choisissez quelle version correspond à la plate-forme informatique et les télécharger. Pour l’installer, ouvrez le package d’installation téléchargé.
    Remarque : Les Versions de DEEPN sont disponibles pour PC, Mac et Linux sysrems. Les systèmes Mac et PC doivent avoir > espace de disque dur de 500 Go et > 4 Go de RAM.
  2. Ouvrez le logiciel DEEPN. Dans la fenêtre principale (Figure 2), sélectionnez les informations correspondantes de bibliothèque des proies dans la boîte de sélection supérieure. Sélectionnez un dossier où les fichiers traités peuvent aller en cliquant sur le bouton « Dossier de travail » et naviguer vers le dossier/répertoire. On peut créer un nouveau dossier/répertoire, si nécessaire. Une fois un dossier « travail » est sélectionné, DEEPN créera trois sous-dossiers intitulé unmapped_sam_files, mapped_sam_files et sam_files.
    1. Si à l’aide de fichiers .sam contenant cartographiés et non mappés lectures telles que celles produites avec les paramètres par défaut du programme MAPster, placez-les dans le dossier « sam_files ». Sinon placer fichiers .sam dans l’unmapped_sam_files et le mapped_sam_files en conséquence.
  3. Commencer en cliquant sur le bouton « Gene Count + jonction Make ».
    Remarque : Le traitement commencera avec le module de Gene Count qui utilisera des positions de mappage pour compter combien de lectures correspondent à chaque gène. Faire jonction extraira ensuite des séquences de jonction (les séquences fusionnées directement en aval du domaine Gal4-activation) de la lecture et de les identifier à l’aide de l’algorithme de Blast. Cela créera un ensemble complet de dossiers illustrée à la Figure 3. Temps de traitement dépend de la taille et le nombre de fichiers de données de séquence et de la vitesse de traitement de l’ordinateur utilisé. Fois typiques vont de 12 à 30 h pour un ensemble de données expérimental de 250 millions de lit. La procédure de Gene Count et la procédure de Junction_Make peuvent être démarrés individuellement en cliquant sur le bouton « Gene Count » ou « Faire jonction ».
  4. Téléchargez et installez Stat_Maker (https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases). Il s’agit d’un logiciel d’analyse statistique conçu pour les ensembles de données DEEPN qui fonctionne actuellement uniquement sur les systèmes Unix Mac.
    1. Ouvrez Stat_Maker et cliquez sur le bouton « Vérifier l’Installation » (Figure 4). Si en cours d’exécution pour la première fois, Stat_Maker installera automatiquement R, PERLY et Bioconductor en tirant ces ressources de l’internet. Une fois R et JAGS Bioconductor sont détectés, Stat_Maker deviendra actif et permet une entrée d’utilisateur.
    2. Cliquez sur le bouton « Choisir un dossier » pour naviguer vers le dossier de travail DEEPN de traitement. Stat_Maker automatiquement Rechercher et répertorier les fichiers pour l’analyse statistique dans la fenêtre.
    3. Glissez et déposez les fichiers appropriés dans la fenêtre de liste de fichiers ci-dessus dans les fichier windows ci-dessous pour chaque jeu de données vectorielles et appât et pour chaque conditions de croissance : non sélectionnés (son + média) et sélectionné (sa - media). Ce qui est important, Stat_Maker exige des ensembles de données en double pour vide vecteur seul, deux échantillons de populations non sélectionnés et deux échantillons de sélectionné. Cela donne une estimation de la variabilité au sein de l’expérience.
    4. Cliquez sur le bouton « Exécuter ». Selon la vitesse de l’ordinateur, le calcul prendra entre 5 à 15 min.
  5. Résultats de l’examen de la sortie de Stat_Maker, qui sont placés dans un nouveau sous-dossier dans le dossier de travail principal intitulé « Résultats Stat_Maker ».
    Remarque : Les résultats sont trouvent dans un fichier CSV (valeurs séparées par des virgules) qui peut être ouvert en commun tableurs. Stat_Maker se classera hits de gènes qui sont susceptibles d’être enrichies différemment sur la sélection avec l’appât d’intérêt sur le vide pTEF-CMM (Figure 5). Tabulées également est le pourcentage de lectures pour chaque jeu de données où l’insertion du gène se trouve en amont, en aval, ou dans le cadre de lecture ouvert et que le gène se retrouve dans le cadre de lecture translationnelle correcte. Souvent, DEEPN saisiront les interactions Y2H robustes d’un appât avec des portions d’un ADNc donné qui sont hors du cadre de lecture adéquat de la protéine correspondante ou à une partie de l’ADNc qui est en aval de son cadre de lecture ouvert correspondant. Analyse la sortie combinée de Stat_Maker simplifie la détection et élimination de ces visites hors de propos.
  6. Pour passer en revue les données sur chaque candidat potentiel, ouvrez le logiciel DEEPN, sélectionnez les informations de bibliothèque de proies correspondantes, puis le dossier de travail correcte en utilisant le dossier « travail ».
    1. Cliquez sur le bouton de « Blast Query ». Ceci charge une nouvelle fenêtre (Figure 6). Dans la zone de texte du haut, tapez le nom de gène ou le numéro de GenBank NM pour sélectionner le gène d’intérêt. Ces noms de gènes correspondent aux noms répertoriés dans le fichier de sortie StatMaker. Type entrée ou retour, qui initie la récupération du gène d’intérêt.
    2. Sélectionnez les ensembles de données sera utilisée pour l’analyse en utilisant les menus « Sélectionnez le Dataset ». En règle générale, ceux-ci incluent le vecteur seulement et appâts échantillons cultivés dans des conditions non sélectif et l’échantillon d’appât cultivées dans des conditions de sélection. Au début, les ensembles de données prendra quelques instants pour charger, toutefois, une requête subséquente des ensembles de données même avec différents gènes vont rapidement. Blast_Query affiche les points de fusion le long de la séquence d’intérêt et comment abondant chaque point de fusion est. Cela peut être affichée dans un format de tableau à l’aide de l’onglet « Résultats » ou un format graphique à l’aide de l’onglet de « Complot ». Ces résultats peuvent être exportés vers un fichier .csv en cliquant sur le bouton « Save.csv » en haut à droite.

3. vérification des candidats identifiés par DEEPN

Remarque : Le DEEPN et Stat_Maker vise à identifier les gènes candidats qui donnent une interaction Y2H positive. Vérification de telles interactions Y2H peut être fait en utilisant un format traditionnel de Y2H binaire en utilisant le plasmide d’appât d’intérêt jumelé avec le plasmide de domaine « proie » Gal4-activation vide ainsi que jumelé avec le plasmide de proies transportant le fragment de gène/cDNA d’intérêt. Il n’est pas possible d’isoler le plasmide réel d’intérêt dans le mélange de l’ADN isolé de la population de levures soumise à sélection Y2H. Cependant, on peut par le calcul reconstruire ce que le fragment de gène/ADNc est qui produit de l’interaction Y2H, concevoir des amorces pour les 5' et 3' extrémités de ce fragment et amplifier ce fragment de l’ADN isolé de la population de levures. Cette section décrit comment trouver l’extrémité 5' et 3' du candidat proies fragment.

  1. Ouvrez le logiciel DEEPN et choisissez les paramètres « Sélectionner le paramètre » et le dossier de travail « Sélectionnez travailler le dossier » correspondant au projet. Lancer le module de Blast_Query en cliquant sur le bouton « Blast Query ».
  2. Tapez le nom du gène d’intérêt ou sa GenBank « NM » numéro dans la zone de texte en haut. Sélectionnez dans le menu déroulant le dataset qui correspond à la population de levures sélectionnées pour l’appât intéressant pour récupérer le tableau des postes de jonction sous l’onglet « Résultats ». Par défaut, Blast_Query ordonnera les différentes positions selon leur abondance dans le dataset, quantifié par le ppm relatif au nombre total de jonctions trouvés dans la base de données.
    1. Trouver le plus abondant de poste qui est "dans ORF » et «dans le cadre ». La valeur de position correspond à la position de nucléotides du gène avec la séquence de référence NCBI (nombre de « NM ») affichée dans la boîte de texte en haut. Cette séquence peut être Récupérée de GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) ou copiée à partir de la zone de texte inférieure dans la fenêtre de Blast_Query.
      Remarque : Un exemple se trouvent dans la Figure 6, panneau central. Dans le centre dataset, les « résultats » montrent comme la jonction plus abondante : « Position » : 867 ; « #Junctions » : 20033.821 ; « Début de requête », 1 ; CD : Dans ORF ; et « Cadre » : dans le cadre. Nucléotides 867 de la séquence de référence NCBI GenBank NM_019648 est le début du fragment proies.
  3. Si la requête ne démarre est 1, concevoir l’extrémité 5' de l’apprêt pour inclure les nucléotides correspondant au numéro de position et s’étendent de 25 nucléotides en aval de cette position (Figure 7). Si le démarrage de la requête est supérieur à 1, il indique qu’il y a des nucléotides supplémentaires entre le domaine d’activation Gal4 et la séquence de proies d’intérêt et que l’apprêt devrait commencer plu en aval selon la valeur de début de requête.
  4. Depuis la fenêtre DEEPN cliquez sur « Lire la profondeur » sous « Analyser les données ». Une fois que la fenêtre de lecture de profondeur est ouverte, saisissez le NCBI référence séquence (NM) nombre gène nom ou dans la zone de texte en haut. Utilisez le menu déroulant pour sélectionner le groupe de données pertinente qui contient le gène enrichi d’intérêt. Utilisez le tableau à gauche et les graphiques s’affichent sur le droit de déterminer combien de lectures trouvées dans les données qui correspondent au gène d’intérêt (Figure 7B).
  5. Concevoir une amorce d’extrémité 3' qui permettra de saisir la séquence du gène fragment calculé par la profondeur de la lecture. Si l’abondance des lectures va au-delà de l’ORF et arrêtez le codon, concevoir l’apprêt afin qu’il inclue le codon d’arrêt et dans la région juste en amont du codon stop. Si les séquences du gène ne s’étendent pas à passé le codon d’arrêt, utilisez le tableau des résultats pour trouver la région 3' plus lointaine qui peut être détectée et utilise ce poste comme le plus éloigné 3' position pour placer l’apprêt.
    NOTE : Le programme de lecture de profondeur analyse par intermittence pour trouver les séquences qui correspondent à la gène/cDNA spécifié d’intérêt. Cela permet de prédire où l’extrémité 5' et 3' du fragment proies plus abondante est pour le gène en question dans l’échantillon. Les fluctuations de la profondeur sur toute la longueur de la séquence sont normales, comme peut être vu à la Figure 7. Si la profondeur est clairement passé le codon d’arrêt, il indique que le fragment de proies s’étend au-delà du codon d’arrêt et l’apprêt 3' peut correspondent donc simplement la région autour du codon stop.
  6. Effectuer une réaction de PCR 50 µL par gène. Chaque réaction contient 25 pmol de chaque amorce avant et arrière correspondant le plasmide de proies-bibliothèque (voir Table des matières). Réactions aussi contenant 25 µL de haute fidélité 2 x PCR Master Mix, 5 µg d’échantillon d’ADN et de l’eau jusqu'à 50 µL.
    1. Amplifier des réactions pour 25 cycles avec des temps d’extension de 3 min à 72 ° C, recuit température de 55 ° C pendant 30 s et dénaturation à 98 ° C pendant 10 s. Precede cyclisme par une dénaturation de 30 s à 98 ° C et faire suivre par une incubation de 5 min à 72 ° C.

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Résultats

Mappage des données de fastq : la première étape
Dans pratiquement toutes les applications de NGS y compris DEEPN la sortie initiale est un fichier de lectures de courte séquence qui doit être mappée en alignement sur la génomique, transcriptomique, ou autre référence ADN8. Récemment, le programme d’alignement de HISAT2 a été développé qui utilise des algorithmes d’indexation de l’état-of-the-art pour augmenter considérablement la cartographie v...

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Discussion

La suite logicielle décrite ici permet de complètement traiter et analyser les données de séquençage ADN à haut débit d’une expérience DEEPN. Le premier programme utilisé est MAPster, qui prend les lectures de séquence d’ADN dans les fichiers standard fastq et cartes de leur position sur une référence ADN pour le traitement en aval par une multitude de programmes informatiques, y compris le logiciel DEEPN. L’utilité de l’interface de MAPster et sa capacité à faire la queue plusieurs travaux, combiner des fichiers d’entré...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health : NIH R21 EB021870-01 a 1 et de subvention de projet de recherche FNS : 1517110.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Mapsterhttps://github.com/emptyewer/MAPster/releases
DEEPN logicielhttps://github.com/emptyewer/DEEPN/releases
Statmakerhttps://github.com/emptyewer/DEEPN/releases
Système informatique minimumAppleMac Intel Core i5 ou
supérieur-4Go de RAM ou
Go Disk spce ou
supérieur-OS10.10 ou supérieur
DellIntel i5-7400 ou
supérieur-4Go de RAM ou
supérieur-500Go Disk spce ou
supérieur-Windows7 ou supérieur
mieux-500

Références

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
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  4. Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).
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Réimpressions et autorisations

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