Petits dosages colorimétriques de Lactate intracellulaire et Pyruvate chez le nématode Caenorhabditis elegans

Résumé

Nous décrivons une extraction artisanale modifiée et les dosages colorimétriques de lactate et pyruvate chez le nématode elegans de c. Lors de l’utilisation de trousses d’analyse commerciale, le développement technique de leur sensibilité et de précision est important. Précipitation de protéines dans l’extraction est l’étape la plus critique pour le dosage des métabolites intracellulaires.

Résumé

Lactate et pyruvate sont des intermédiaires clés des voies métaboliques intracellulaires de l’énergie. Le rapport lactate/pyruvate dans les cellules de surveillance permet de déterminer s’il existe un déséquilibre dans le métabolisme de l’énergie liée à l’âge entre la phosphorylation oxydative mitochondriale et de la glycolyse aérobie. Ici, nous montrons l’utilisation des kits de dosage colorimétrique commercial de lactate et pyruvate dans l’organisme modèle c. elegans. Récemment, la sensibilité et la précision des kits de dosage colorimétrique/fluorimétrique ont été améliorées considérablement par la recherche et de développement menées par les fabricants de réactifs. Les réactifs améliorées ont permis l’utilisation des essais à petite échelle avec une plaque à 96 puits chez c. elegans. En général, un dosage fluorimétrique est une sensibilité supérieure à un dosage colorimétrique ; Toutefois, l’approche colorimétrique est plus approprié pour l’usage dans des laboratoires communs. Une autre question importante à ces essais pour la détermination quantitative est la précipitation de protéines de homogénéisé c. elegans échantillons. Dans notre méthode de précipitation de protéines, précipitants communs (e.g., acide trichloracétique, acide perchlorique et acide métaphosphorique) sont utilisés pour la préparation de l’échantillon. Un échantillon de test sans protéine est préparé en ajoutant directement froid précipitant (concentration finale de 5 %) au cours de l’homogénéisation.

Introduction

Les concentrations de lactate et pyruvate sont largement considérées comme intermédiaires du métabolisme énergétique et sont liées aux États de la glycolyse, cycle des acides tricarboxyliques (TCA) et chaîne de transport des électrons dans les cellules des organismes aérobies. Une série de réactions dans la glycolyse oxyder le glucose en pyruvate, qui se trouve à un carrefour métabolique et peut être converti d’hydrates de carbone à travers gluconéogenèse, d’acides gras et le métabolisme énergétique à travers l’acétyl-CoA et de l’acide aminé alanine. Le cycle de Krebs se produit en présence d’oxygène dissous suffisante et est fondamental pour la conversion du glucose ....

Protocole

1. synchronisée Culture de c. elegans

1. Avant de semer, culture l' Escherichia coli (e.coli) souche OP50 pendant une nuit à 37 ° C dans 300 mL de milieu liquide de bouillon Luria-Bertani (LB). Stocker le OP50 cultivées à-4 ° C.
   1. Pour rendre le milieu liquid du bouillon LB, utiliser 10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure, 10 g de NaCl et 1,5 mL de NaOH N 1 et ajouter à 1 L avec de l’eau désionisée. Autoclave.
      Remarque : Les souches OP50 et c. elegans sont disponibles depuis le centre de génétique de Caenorhabditis (Université du Minnesota, St. Paul, MN, é.-u.).
2. Pour rendre la gélose de néma....

Résultats

Avec les dosages colorimétriques pour la détermination quantitative des concentrations de lactate et pyruvate, nous avons démontré l’exactitude de ces tests par rapport aux précédents rapports dans c. elegans^7,8. Ici, le processus de précipitation de protéines au cours de l’extraction de l’échantillon a été l’étape la plus cruciale pour générer des valeurs précises. Pour la précipitation de protéines, précipitants communs.......

Discussion

Lorsque vous utilisez ces trousses de dosage colorimétrique, l’étape la plus critique dans l’extraction de l’échantillon pour détecter les cellulaire lactate et pyruvate avec précision chez c. elegans sont le processus de précipitation de protéines au cours de l’homogénéisation (Figure 1). Il n’est pas strictement nécessaire d’utiliser un homogénéisateur de téflon, autres homogénéisateurs (e.g., Dounce et coniques broyeurs de tissu, ou usines de perle) sont également adapté.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit de dosage colorimétrique/fluorimétrique du lactate  ;	BioVision	#K607-100	tests colorimétriques/fluorimétriques 100 ; Stocker à -20°C
EnzyChrom Pyruvate Assay	Kit BioAssay Systems	#EPYR-100	colorimétriques/ fluorométriques 100 dosages ; Stocker à -20oC
BCA Kit de dosage des protéines	Thermo Scientific	#23225	dosage colorimétrique ; stocker à   ; température ambiante
Acide trichloracétique	Wako Pure Chemical	#207-04955	conserver à température ambiante
Homogénéisateur de téflon  ;	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	Au lieu de Iwaki/Pyrex, disponible chez Wheaton