Une approche de mutagenèse roman Saturation : Seule étape caractérisation des protéines régulatrices accepteurs en ARN utilisant Phosphorothioates

Résumé

Les protéines qui se lient à des séquences d’ARN spécifiques jouent un rôle crucial dans l’expression des gènes. Une caractérisation détaillée de ces sites de liaison est cruciale pour notre compréhension de la régulation des gènes. Ici, une approche pas à pas pour la mutagénèse de saturation des sites de liaison protéique dans l’ARN est décrite. Cette approche est pertinente pour tous les sites de liaison aux protéines dans l’ARN.

Résumé

Régulation des gènes joue un rôle important dans le développement. Nombreuses protéines de liaison DNA et RNA lient hautement leur séquence cible pour contrôler l’expression des gènes. Ces protéines régulatrices contrôlent l’expression des gènes au niveau de l’ADN (transcription) ou au niveau de l’ARN (l’épissage de l’ARN pré-messager, polyadénylation, mRNA transport, décomposition et traduction). Identification des séquences régulatrices aide à comprendre non seulement comment un gène est activé ou désactivée, mais aussi quels gènes en aval sont réglementés par une protéine régulatrice particulière. Nous décrivons ici une approche une étape qui permet de mutagénèse de saturation d’un site de fixation de protéines dans l’ARN. Il s’agit de dopage la matrice d’ADN avec les nucléotides non-sauvage au sein de l’accepteur, la synthèse d’ARN séparés avec chaque nucléotide phosphorothioate et l’isolation de la fraction liée après incubation avec les protéines. Interférence de nucléotides non-sauvage se traduit par leur exclusion préférentielle de la fraction liée aux protéines. Ceci est contrôlé par électrophorèse suivant un clivage chimique sélectif avec l’iode des liaisons phosphodiester contenant phosphorothioates (phosphorothioate mutagénèse ou PTM). Cette approche de mutagenèse seule étape saturation est applicable à la caractérisation de n’importe quel site de liaison des protéines dans l’ARN.

Introduction

Régulation des gènes joue un rôle important en biologie. Gènes peuvent être réglés au niveau de la transcription, épissage de l’ARN pré-messager, 3' fin formation, exportation RNA, traduction, localisation de l’ARNm, carie, modification poteau-de translation/stabilité, etc. les deux protéines de liaison à l’ADN - et l’ARN jouent un rôle clé dans le gène Règlement. Alors que les analyses de génétiques moléculaires ont identifié de nombreuses protéines régulatrices, seulement un petit sous-ensemble d’eux ont été caractérisés entièrement pour leurs fonctions cellulaires ou de sites de liaison in vivo. Mutagenèse et analyse phylogénétique séquence offrent des approches complémentaires pour caractériser les interactions ADN - ou ARN-protéine.

Protéines de liaison à l’ARN sont importants dans le processus de développement, y compris la différenciation sexuelle. La protéine de Drosophila Sex-lethal (SXL) ou la protéine sex-interrupteur général est absente dans les mâles, mais présent chez les femelles. Il reconnaît les séquences riches en uridine ou pyrimidiques adjacentes aux sites d’épissage spécifiques dans les cibles du pré-ARNm en aval (transformateur, Sex-lethalet spécifique aux mâles lethal2) dans les cellules somatiques^{1,2 ,3,4}. En outre, il réglemente polyadénylation site commutation en se liant aux séquences enhancer riche en uridine polyadénylation dans renforceur de rudimentaires (e(r)) transcription^5,6. SXL probable réglemente des cibles supplémentaires dans les cellules germinales femelles qui restent à être identifiés^{1,7,8,9,10,11, 12 , 13}.

Caractérisation d’un site de liaison implique généralement, mutagenèse, par exemple, par la suppression ou la substitution d’un ou de plusieurs nucléotides. Chaque site de liaison mutant, par rapport à la séquence d’ARN sauvage, est ensuite analysée à l’aide d’une série de concentrations de protéines afin de déterminer son affinité (K_d ou équilibre de dissociation constante) pour la protéine d’intérêt ; K_d est la concentration de protéines nécessaire pour obtenir 50 % ARN contraignantes. Ce processus fastidieux de la mutagénèse détaillé implique la génération et l’analyse de nombreux mutants — trois nucléotides non-wild type pour chaque poste dans le site de liaison. Ainsi, il y a un besoin pour une approche différente pour la mutagénèse de saturation plus rapide, plus simple et peu coûteux de sites de fixation de protéines dans l’ARN.

Nous décrivons ici une approche une étape qui permet de mutagénèse de saturation d’un site de fixation de protéines dans l’ARN. Il s’agit de dopage la matrice d’ADN avec les nucléotides non-sauvage au sein de l’accepteur, la synthèse d’ARN séparés avec chaque nucléotide phosphorothioate et l’isolation de la fraction liée après incubation avec les protéines. Interférence de nucléotides non-sauvage se traduit par leur exclusion préférentielle de la fraction liée aux protéines. Ceci est contrôlé par électrophorèse suivant un clivage chimique sélectif avec l’iode des liaisons phosphodiester contenant phosphorothioates (phosphorothioate mutagénèse ou PTM). Cette approche de mutagenèse seule étape saturation est applicable à la caractérisation de n’importe quel site de liaison des protéines dans l’ARN.

Protocole

NOTE : Figure 1 donne un aperçu de la mutagénèse phosphorothioate et résume les étapes clés du processus.

1. génération d’une bibliothèque de Mutants — dopage la matrice d’ADN avec les nucléotides Non-wild Type

1. Synthétiser l’amorce T7 (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') par synthèse chimique sur un synthétiseur d’ADN.
2. Synthétiser un oligonucléotide dopé (brin complémentaire) par synthèse chimique sur un synthétiseur d’ADN correspondant au site de liaison des protéines. Utiliser un mélange approprié de leur au cours de la synthèse chimique pour chaque site de dopage (X ci-dessous) avec une proportion de 90 % A comme le nucléotide de type sauvage et 10 % T comme le nucléotide de type non-sauvage (voir résultats représentatifs pour plus de détails sur ce ratio).
   Note : Ici, la séquence de l’oligonucléotide dopé est 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. La séquence a souligné est le complément inverse du site de liaison protéine SXL, plus des nucléotides supplémentaires en dehors du site de liaison qui fournissent des contrôles utiles confirmant que pas chaque changement dans l’ARN n’affectait contraignant, comme étant le chargement des contrôles pour comparaison et normalisation des nucléotides au sein du site de liaison. La séquence de site SXL-liaison UUUUUGUUGUUUUUUUU, qui est présent dans le transformateur pré-ARNm^14,15,16,17, a été utilisée pour élaborer la méthodologie proposée. La séquence en italique est complémentaire de la séquence d’amorce T7 et le promoteur T7 pour la transcription in vitro .

2. synthèse de l’ARN

1. Synthétiser l’ARN en une réaction de transcription de 20 µL, comme précédemment décrit¹⁸.
   1. Tampon de transcription T7 Mix et 1 oligonucléotide de T7 µM, 1µm dopé oligonucléotide, 10 mM le dithiothréitol (DTT), 2 mM GTP, 1 mM de chaque ATP, CTP et UTP (uridine, adénosine, cytidine et guanosine triphosphate) et 2 U/µL ARN polymérase T7.
   2. Ajouter, dans les deux tubes de microcentrifuge distinct, 0,167 mM α-thio ATP ou 0,05 mM α-thio UTP à intégrer RNAs de phosphorothioates (voir schémas dans la Figure 2).
      Remarque : Pour des protocoles alternatifs, ajouter 0,2 mM α-thio CTP ou 0,2 mM α-thio GTP pour contrer une réaction appropriée de transcription contenant un oligonucléotide dopé pour tester les deux autres substitutions nucléotidiques.
   3. Incuber le mélange de réaction de synthèse de RNA pendant 2 h à 37 ° C.
2. Ajouter 2,5 µL phosphatase alcaline thermolabile et 2,5 µL de tampon de 10xphosphatase à l’échantillon de RNA. Incuber à cette réaction de 25 µL à 10 – 30 min à 37 ° C pour éliminer 5' phosphates.
3. Inactiver l’enzyme phosphatase alcaline par chauffage à 80 ° C pendant 2 à 5 min.
4. Radiolabel l’extrémité 5' de l’ARN déphosphorylée (pmole 5) à l’aide de 1 µL T4 polynucléotide kinase et 1 µL γ -³²P ATP dans un volume réactionnel de 10 µL. Incuber le mélange réactionnel durant 30 à 60 min à 37 ° C.
5. Inactiver les enzymes de kinase de polynucléotide T4 par chauffage à 65 ° C pendant 20 à 30 min.
6. Gel de purifier l’ARN par électrophorèse dans un 10 % dénaturante sur gel de polyacrylamide. Repérez les RNA sur le gel par autoradiographie. La tranche de gel contenant des ARN radioactif de l’accise, écraser dans un tube de microcentrifuge en appuyant contre les murs avec un embout de la pipette et tremper dans le tampon de protéinase K (PK) (100 mM Tris, pH 7.5, 12,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, dodécyl sulfate de Sodium 1 %). Tourner le tube à la température ambiante de 2 h à une nuit.
7. Centrifuger la gel de boue, jeter le gel et recueillir la solution tampon.
8. Extraire la solution deux fois avec un volume égal de phénol-chloroforme et une fois avec du chloroforme et recueillir la phase aqueuse.
9. Ajouter du volume de la phase aqueuse 0,1 de 3M acétate de Sodium, pH 5,2, porteur d’ARNt ou glycogène et 2,5 volume d’éthanol. Conserver l’échantillon à-80 ° C pendant 1 h.
10. Centrifuger l’échantillon pendant 5 – 10 min dans une microcentrifugeuse haute vitesse à 16 873 x g. Retirez soigneusement la solution tampon/éthanol sans déranger le culot de RNA.
11. Laver le culot avec 70 % d’éthanol et centrifuger pendant 2 à 5 min. Retirez l’éthanol soigneusement. Sécher le culot dans l’air.
12. Resuspendre le culot dans 20 à 50 µL diéthyl pyrocarbonate (DEPC)-l’eau traitée. Conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
    Remarque : Effectuez toutes les étapes avec ARN radioactif en utilisant les précautions appropriées et un bouclier de plexiglass pour protéger contre la radioactivité. Actuellement, colonnes à centrifuger sont plus couramment utilisée et plus facile à enlever la radioactivité non constituées en société, comme une alternative au gel de purification de l’ARN.

3. fixation de réaction et la séparation de l’ARN lié aux protéines

1. Exprimer la protéine recombinante dans et purifier d’e. coli.
2. Estimer la concentration de la protéine recombinante en spectrophotométrie ou en séparant dans un gel SDS-polyacrylamide à côté d’une albumine de sérum protéiques connus standard, bovine (BSA). Visualiser la protéine d’intérêt et la BSA standard par coloration du gel avec le bleu de Coomassie brillant bleu R-250. Quantifier la protéine en comparaison des quantités connues de dilutions de BSA sur le même gel.
   NOTE : Stocker la protéine recombinante à - 80 ° C jusqu'à l’utilisation et diluer dans 20 mM 4-(2-hydroxyéthyl) pipérazine-1-ethanesulfonic d’acide (HEPES), pH 8,0, 1 mM le dithiothréitol (DTT), 0,2 mM acide tétraacétique (EDTA), 0,05 % NP-40, 20 % de glycérol. Utilisation de 0,5 à 1,0 mM protéase inhibiteur phenylmethane fluorure (PMSF) est facultatif.
3. Effectuer la réaction (20 à 100 µL) de liaison à l’ARN en 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 millimètre DTT, 50 mM KCl, inhibiteur de RNase 0,5 unités/µL, 0,09 µg/µL acétylé albumine sérique bovine, 1 mM EDTA, 0,15 µg/µL ARNt, l’extrémité 5'-radiomarquée ARN et 6 µL de concentration appropriée (une concentration au cours de laquelle environ 50 % de l’ARN se lie aux protéines) de la protéine.
   Remarque : Ce tampon de liaison travaille pour trois protéines ARN-contraignantes (SXL, U2AF⁶⁵et PTB), mais doit être normalisée pour une protéine d’intérêt. Estimer la concentration de protéines empiriquement, à l’aide de diverses dilutions pour une préparation de protéine donnée, qui est tenue d’obtenir environ 50 % ARN contraignantes. Cette condition ou K_d représente la partie la plus sensible de la courbe de liaison à l’ARN.
4. Incubez la réaction de liaison protéique pendant 20 à 30 min à 25 ° C (ou sur la glace).
5. Séparer la fraction d’ARN protéinique de la fraction non liée à l’aide d’une des deux approches :
   1. Liaison de filtre de nitrocellulose
      1. Appliquez la réaction de liaison (20 à 100 µL) sur un filtre de nitrocellulose relié à un collecteur sous vide à température ambiante.
         Remarque : Uniquement le complexe ARN-protéine est piégé dans le filtre et non consolidé des flux de RNA à travers le filtre. L’approche de liaison filtre permet une récupération plus élevée de l’ARN dépendant et est plus rapide et plus simple, par rapport à l’analyse de décalage de mobilité de gel. En plaçant une membrane DEAE sous le filtre de nitrocellulose, il est également possible de recueillir la fraction de RNA libre ou gratuit RNA pour comparaison avec la fraction liée.
      2. Couper la partie du filtre de nitrocellulose contenant la rétention ARN radioactive en petits morceaux pour s’insérer dans un tube de microcentrifuge, tremper dans la mémoire tampon PK suffisante (300 – 500 µL contenant 10 à 20 µg PK) de plonger les morceaux de filtre et éluer l’ARN du filtre pour 2 à 3 h ou toute une nuit.
      3. Extrait avec du phénol-chloroforme, chloroforme et recueillir la phase aqueuse. Ajouter de l’éthanol et acétate de sodium et, après incubation dans le congélateur, centrifuger, laver, sécher et remettre en suspension les ARN dans l’eau traitée DEPC. Procédez comme indiqué dans les étapes 2.10 à 2.14 ci-dessus.
   2. Décalage de mobilité de gel
      1. Préparer et polymériser un gel de polyacrylamide native de 5 % (60 : 1 Acrylamide:bis-acrylamide) à 0,5 x TBE (tampon Tris-Borate-EDTA étalon) avant de démarrer la réaction de liaison, comme une alternative à la méthode de fixation du filtre.
      2. Courir avant le gel pendant 15 min à 250 V dans une chambre froide (4 ° C).
      3. Chargez chaque réaction de liaison (voir ci-dessus) dans des puits séparés du gel avant exécution ci-dessus.
         Remarque : Le tampon de conservation des protéines offre glycérol suffisante pour le chargement de l’échantillon dans les puits.
      4. Séparer l’ARN liés aux protéines par électrophorèse sur gel dans une chambre froide à 250 V pendant 1 à 2 h, selon la taille de RNA et la protéine spécifique.
      5. Localiser la position du complexe ARN-protéine sur le gel par autoradiographie. La tranche de gel contenant le complexe ARN-protéine de l’accise. Éluer l’ARN de la tranche de gel en écrasant la tranche de gel et de trempage dans le tampon de PK.
      6. Extrait avec du phénol-chloroforme, chloroforme et recueillir la phase aqueuse. Ajouter de l’éthanol et acétate de Sodium et, après incubation dans le congélateur, centrifuger, laver, sécher, à l’air et remettre en suspension les ARN dans l’eau traitée DEPC. Procédez comme indiqué dans les étapes 2.10 à 2.14 ci-dessus.

4. analyse des produits Phosphorothioate clivée iode pour la détection des Positions nucléotidiques Mutant

1. Ajouter iode 1 mM dans une eau traitée DEPC contenant jusqu'à 10 µg transporteur de 20 µL ARNt pour cliver l’ARN (ARN dépendant et total) sur les sites d’incorporation phosphorothioate. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
   Remarque : De plus amples renseignements sur le clivage de l’iode avec des conditions légèrement différentes — iodoethanol de 7 % (v/v), chauffage à 95 ° C pendant 3 min, se trouvent à Gish & Eckstein 1988¹⁹.
2. Précipiter RNA clivé par l’ajout de sodium acétate/éthanol, tel que décrit ci-dessus. Resuspendre dans une teinture de chargement pour dénaturation des gels. Faire chauffer et charger l’échantillon afin de séparer les fragments d’ARN par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide dénaturisation de 15 à 20 %.
3. Exposer le gel de polyacrylamide à une radiographie.
4. Détecter les bandes dans la fraction liée par rapport à la masse totale par autoradiographie.
   Remarque : Effectuez toutes les étapes avec de l’iode dans un conduit d’évacuation. Pour la séparation de RNA ci-contre, un gel en forme de coin est employé, qui est réalisé en doublant l’épaisseur des deux entretoises en bas des plaques de gel en insérant une entretoise supplémentaire pouces de long au fond du gel. Cette forme permet plus uniforme et plus proche espacement plus courts fragments d’ARN. Alternativement, un phosphorimager peut être utilisé au lieu de films radiographiques pour la détection et la quantification de la radioactivité.

Résultats

Principe de la mutagénèse de saturation à l’aide de dopage :

Pour un ratio molaire approprié de type sauvage et autres nucléotides, utilisez un mélange égal de tous les quatre nucléotides si seulement une position doit être analysé. Toutefois, si plusieurs positions sont analysées en même temps, il faut régler le ratio de type non sauvage aux nucléotides de type sauvage, c'est-à-dire réduite. Sinon, outre les substitutions...

Discussion

Mutagenèse a longtemps été utilisé pour caractériser les sites de fixation des protéines. Tout d’abord, une série de mutants peut être construite et testée individuellement en tests d’analyser leurs effets sur l’affinité de liaison. Alors qu’une approche de mutagenèse standard offre la possibilité d’analyser plusieurs séquences, plusieurs étapes impliquées dans l’approche standard, comme construire des mutants et exécutent une série de réactions pour chaque mutant de liaison, est laborieux et prend du temps et ne peut pa...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Uridine 5' a-thio triphosphate	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-017
Adénosine 5' a-thio triphosphate	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-016
Collecteur à vide	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore  ; 25 ans ; mm Microanalyse du verre Filtre à vide
Collecteur à vide	Millipore	XX2702552	1225 Collecteur à vide d’échantillonnage
Nitrocellulose	Millipore	HAWP
Nitrocellulose	Schleicher & Schuell	PROTRAN
Kit de déphosphorlyation	NEB	M0508
T4 Polynucléotide kinase	NEB	M0201S
Protéinase K	NEB	P8107S
T7 ARN polymérase	NEB	M0251S
RNasin	Promega		Inhibiteur de RNase
Plaques de verre	Standard
Équipement d’électrophorèse	sur gel Standard
Standard Films radiographiques	Standard	Standard
Solutions de gel de polyacrylamide	Standard	Standard