La méthode Set de la réplique : Une approche de haut-débit pour mesurer quantitativement Caenorhabditis elegans durée de vie

Résumé

Nous décrivons ici la méthode de jeu de réplicas, une approche quantitative mesure la durée de vie/survie de c. elegans et healthspan d’une manière robuste et haut débit, permettant ainsi la projection de nombreuses conditions sans sacrifier la qualité des données. Ce protocole décrit la stratégie et fournit un outil logiciel pour l’analyse des données de jeu de réplicas.

Résumé

La méthode de jeu de réplicas est une approche pour mesurer quantitativement la durée de vie ou la survie des nématodes Caenorhabditis elegans de manière haut débit, permettant ainsi un seul enquêteur cribler des traitements ou des conditions plus au cours de la même quantité de temps sans perte de qualité des données. La méthode nécessite des équipements communs trouvés dans la plupart des laboratoires travaillant avec c. elegans et est donc simple à adopter. L’approche se concentre sur titrage des échantillons indépendants d’une population à chaque point d’observation, plutôt que d’un seul échantillon au fil du temps comme avec les méthodes traditionnelles de longitudinales. Notation consiste à ajouter du liquide sur les puits d’une plaque multipuite, qui stimule c. elegans pour déplacer et facilite la quantification changements dans healthspan. Autres atouts majeurs de la méthode de jeu de réplicas comprennent la réduction de l’exposition de la surface des géloses de contaminants atmosphériques (p. ex. de moisissure ou champignon), un minimum de manipulation des animaux et la robustesse de sporadiques mal marquant (par exemple appeler un animal comme mort quand il est encore Alive). Pour bien analyser et visualiser les données d’une expérience de style de jeu de réplicas, a également été développé un outil de logiciel personnalisé. Les capacités actuelles du logiciel comprennent le tracé des courbes de survie pour le jeu de réplicas et des expériences traditionnelles (Kaplan-Meier), tant que l’analyse statistique pour le jeu de réplicas. Les protocoles fournis ici décrivent l’approche expérimentale traditionnelle et la méthode de jeu de réplicas, ainsi un aperçu de l’analyse de données correspondante.

Introduction

Une des avancées technologiques plus transformatrices dans la compréhension de la base génétique du vieillissement était le développement de l’alimentation-basé Arni dans c. elegans¹; avant l’utilisation expérimentale de l’ARNi, nombreux phénotypes du vieillissement n’étaient pas génétiquement tractable. Arni axée sur l’alimentation est assurée par la production d’ARNdb dans e. coli qui correspond à un endogène ARNm c. elegans : IPTG induit la transcription bidirectionnelle à travers l’insertion de l’ADNc de c. elegans soit ou une partie d’un cadre de lecture ouvert dans un plasmide^....

Protocole

1. traditionnelle méthode de Scoring c. elegans longévité

1. Préparation des réactifs
   1. Identifier les gènes à être inactivé par l’intermédiaire de RNAi axée sur l’alimentation. Achat de stocks transformées de HT115 e. coli² contenant le clone de RNAi d’intérêt. Sinon, subclone l’ADNc du gène d’intérêt dans le site multicloning du plasmide L4440.
      Remarque : HT115 est une souche de RNase III-deficient Escherichia coli avec activité polymérase T7 IPTG inductible, qui sert à prévenir la dégradation de l’ARNdb dans les bactéries. Pour les études de durée de vie qui n’utilisent pas de RNA....

Résultats

Dans le développement d’une toute nouvelle méthodologie, il est impératif que la nouvelle méthode récapitule les résultats reconnus des approches précédentes et répond à la norme dans un champ. Nous avons déjà démontré empiriquement que les méthodes traditionnelles pour doser la durée de vie de c. elegans et jeu de réplicas produisent des résultats semblables²⁰. Sauvage c. elegans (N2) maintenue à 20 ° C en général vivent entre 20 et 25 jours, que.......

Discussion

Les deux méthodes traditionnelles et replica set nécessitent la synchronisation des animaux âgés chronologiquement. Nous incluons une méthode qui synchronise les animaux à l’aide de traitement hypochlorite d’adultes gravides, où seulement des oeufs fécondés avec les adultes gravides survivent. Ces embryons éclosent en suspension liquide et développemental arrêtent au premier stade larvaire (L1). Après l’ensemencement L1 animaux sur les aliments (p. ex. e. coli exprimant dsRNA à un gène d’intérêt), anima.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
IPTG (isopropyl bêta-D-1-thigalactopyranoside)	Gold Bio	12481C100
FuDR (5-Fluoro-2'-désoxyuridine)	Alfa Aesar	L16497
24 Well Culture Plates	Greiner Bio-One	#662102
Plaque rétangulaire non traitée single-well, 128x86mm	Thermo-Fisher	242811
600 µ ; L Plaques 96 puits	Greiner Bio-One	#786261
2mL Plaques 96 puits	Greiner Bio-One	#780286
Joint à plaque perméable à l’air	VWR	60941-086
Réplicateur de plaques à 96 broches	Nunc	250520
bacto-peptone	VWR	90000-368
gélose bactériologique	Affymetrix/USB	10906
Bibliothèque de clones de l’ARNi de C. elegans dans la bactérie HT115 - Ahringer	Source Bioscience	Collection d’ARNi de C. elegans (Ahringer)	Voir aussi Kamath et. al, Nature 2003.
Bibliothèque de clones ARNi de C. elegans dans la bactérie HT115- Vidal	Source Bioscience	C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)	Voir aussi Rual et. al, Genome Research 2004. Cette bibliothèque est également disponible auprès de Dharmacon.
WormLife - Logiciel pour l’analyse de survie du jeu de répliques	Samuelson Lab	N/A
https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife L4440 Plasmide vectoriel vide	Addgene	1654	https://www.addgene.org/1654/
Wormbase			http://www.wormbase.org/  ;
OASIS			https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/  ;
Graphpad Prism			https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/  ;