In Situ Techniques d’hybridation pour échantillons de corail adultes paraffine

Résumé

L’objectif de ce protocole consiste à effectuer l’hybridation in situ sur des échantillons de corail adultes qui ont été incorporés à la paraffine et sectionnés sur lames de verre. Il s’agit d’une méthode qualitative permettant de visualiser l’expression spatiale d’une sonde d’ARN anti-sens dans les tissus inclus en paraffine.

Résumé

Les coraux sont des invertébrés océan important qui sont essentiels pour la santé globale de l’océan, mais aussi la santé humaine. Toutefois, en raison des impacts anthropiques tels que la hausse des températures de l’océan et l’acidification des Océans, les coraux sont plus en plus sous la menace. Pour relever ces défis, les progrès en biologie cellulaire et moléculaire ont prouvé très importante pour le diagnostic de la santé des coraux. Modifiant certaines des techniques couramment utilisés en médecine humaine pourrait améliorer considérablement la capacité des chercheurs pour traiter et sauver les coraux. Pour y remédier, un protocole pour l’hybridation in situ , utilisé principalement pour la médecine humaine et biologie évolutive du développement a été adapté pour une utilisation chez les adultes coraux sous contrainte.

Le but de cette méthode est de visualiser l’expression spatiale d’une sonde d’ARN dans le tissu corail adulte qui a été incorporé à la paraffine et sectionné sur lames de verre. Cette méthode met l’accent sur l’élimination de la paraffine et la réhydratation de l’échantillon, le prétraitement de l’échantillon afin d’assurer la perméabilité de l’échantillon, hybridation pré incubation, hybridation de la sonde d’ARN et la visualisation de la sonde d’ARN. Il s’agit d’une méthode puissante lors de l’utilisation des organismes non-modèles à découvrir où certains gènes sont exprimés, et le protocole peut être facilement adapté pour d’autres organismes non-modèle. Toutefois, la méthode est limitée car il s’agit avant tout qualitative, parce que l’intensité de l’expression peut varier selon la quantité de temps utilisé lors de l’étape de visualisation et de la concentration de la sonde. En outre, la patience est nécessaire, comme ce protocole peut prendre jusqu'à 5 jours (et dans bien des cas, plus longtemps), selon la sonde utilisée. Enfin, la coloration de fond non spécifique est commune, mais cette limitation peut être surmontée.

Introduction

Les coraux sont des bâtisseurs de l’écosystème critique et important pour la biodiversité dans l’océan et la santé humaine^1,2,3. Ils sont menacés en raison des changements climatiques et autres facteurs de stress anthropiques, et nombreuses espèces de coraux sont considérés comme en danger critique d’extinction. Ainsi, il y a un besoin important pour des outils moléculaires et cellulaires diagnostiquer les coraux sous contrainte. En outre, il est peu compris sur où sont expriment des gènes dans le tissu corail adulte et donc peu de compréhension des fonctions de ces gènes. Po....

Protocole

1. enlèvement de paraffine

ATTENTION : Effectuez les opérations suivantes sous une hotte aspirante.

1. Déparaffinage les coupes minces paraffine diapositives avec 100 % de xylène sous le capot en bocaux de verre Coplin pendant 10 min. Ne pas utiliser de pots Coplin, que xylène fond plastique. Stériliser les bocaux de Coplin dans un autoclave avant utilisation.
2. Préparer quatre pots de Coplin de verre stériles par ce qui suit : 100 % éthanol, éthanol à 80 %, éthanol à 70 % et 60 % d’éthanol. Diluer l’éthanol avec de l’eau exempte de RNase.
   1. Transférer les lames à la coloration de verre stériles avec 100 % d’éthanol et ....

Résultats

À l’issue de ce protocole, l’identification des cellules et des tissus qui expriment la sonde de l’ARN d’intérêt se réalisera. Les résultats représentatifs de ce protocole sont pour AP-1, OSF et TNFR41. Ces résultats, publiés précédemment par Traylor-Knowles et coll. ¹¹, spectacle expression spatiale de l’ARN sondes sur des coraux adultes qui ont été exposés au stress thermique. Deux exemples de différents types de coloration sont présentés dans la

Discussion

La méthode décrite dans le présent protocole a été modifiée à partir de travaux antérieurs dans la recherche médicale et évolutive du développement^8,9,10,12,17. Ce protocole met l’accent sur les nuances d’une hybridation in situ avec une sonde d’anti-sens RNA creuser-étiquetés sur les coraux adultes, qui ont été préservés et intégrés à la paraffine. C.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
La solution de Denhardt	Affymetrix	70468 50 ML
Bioworld Tampon de phosphatase alcaline	Fisher	50-198-724
Enveloppes de lames	Fisher	12-587-17B
Bioworld Tampon de phosphatase alcaline	Fisher	50-198-724
50 mL Tubes Falcon	Fisher	14-959-49A
Solution d’ADN de spermatozoïdes de saumon UltraPure	Invitrogen	15632-011
PBS - Saline tamponnée au phosphate (10X) pH 7,4	Invitrogen	AM9625
Eau distillée sans DNase/RNase UltraPure, 10 x 500 mL	Invitrogen	10977-023
Eau distillée sans DNase/RNase UltraPure, 10 x 500 mL	Invitrogen	10977-023
Solution d’ADN de spermatozoïdes de saumon UltraPure	Invitrogen	15632-011
Slide blanc apex adhésif supérieur	Leica Biosystems	3800080
solution PBS, pH 7,4	Life Technologies	10010072
Proteinase K, qualité moléculaire, 2 mL	New England Biolabs	P8107S
Super Pap Pen Bloqueur de liquide	Promega	22309
DIG Anti-Digoxigénine-AP Fab fragments	Roche	11093274910
BM Purple, 100 mL	Roche	11442074001
DIG Wash and Block Buffer Set	Roche	11585762001
NBT/BCIP	Roche	11681451001
Formaldéhyde solution, format 500 mL	Sigma-Aldrich	252549-500ML
Tampon SSC 20X concentration	Sigma-Aldrich	S6639-1L
Anhydride acétique	Sigma-Aldrich	320102-100ML
Formamide	Sigma-Aldrich	47670-250ML-F
Triéthanolamine	Sigma-Aldrich	90279-100ML
Sel d’héparine sodique de la muqueuse intestinale porcine	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
Xylènes, AR (ACS), à usage	histologiqueVWR	MK866806
Ethanol	VWR	EM-EX0276-4S
TE buffer	VWR	PAV6232
four d’hybridation	VWR	97005-252, 97005-254
Vibrateur orbital	VWR	89032-088