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Article de méthode

Sensille unique Recordings pour Locust Palp sensilles basiconiques

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DOI :

10.3791/57863

⸱

23 juin 2018

 ,  , 
1Department of Entomology, China Agricultural University, 2Bio-tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit un protocole détaillé et très efficace pour les enregistrements de sensille unique de la basiconica de sensilles sur les palpes des insectes pièces buccales.

Résumé

Les palpes de pièces buccales de Criquet pèlerin sont considérés comme des organes gustatifs classiques qui jouent un rôle important dans le choix des aliments d’un criquet, en particulier pour la détection des signaux chimiques non volatile par l’intermédiaire de sensilles chétiformes (précédemment nommé sensilles terminales (ou sensilles huppés). Il y a maintenant de plus en plus évident que ces palpes ont également une fonction olfactive. Un récepteur odorant (LmigOR2) et une protéine de liaison odorant (LmigOBP1) ont été localisés dans les neurones et les cellules accessoires, respectivement, dans le basiconica de sensilles des palpes. Sensille unique enregistrement (SSR) est utilisé pour enregistrer les réponses des neurones de récepteur odorant, qui est une méthode efficace de dépistage actifs ligands sur les récepteurs spécifiques odorant. SSR est utilisé dans les études fonctionnelles des récepteurs odorants dans des sensilles palpe. La structure de la basiconica de sensilles située sur le dôme des palpes diffère quelque peu de la structure de celles sur les antennes. Donc, lorsque vous effectuez une SSR provoquée par les substances odorantes, quelques conseils spécifiques peut être utile pour l’obtention de résultats optimaux. Dans cet article, un protocole détaillé et très efficace pour un SSR de palp insectes sensilles basiconiques est introduit.

Introduction

Animaux ont développé une gamme d’organes chemosensoriels qui détectent les signaux chimiques exogènes. Chez les insectes, les plus importants organes chemosensoriels sont les antennes et les palpes. Sur ces organes, plusieurs types de poils chemosensoriels, appelés chemosensoriels sensilles, sont innervés par les neurones chemosensoriels (SCSN) dans les poils. Notes de sensilles chemosensoriels reconnaissent les signaux chimiques spécifiques par le biais de transduction d’un signal de stimulus chimiques à des potentiels électriques qui sont ensuite transférées jusqu’au système nerveux central1,,2,3 .

SCSN exprimant divers récepteurs chemosensoriels [p. ex., récepteurs odorants (ORs)], ionotropiques récepteurs (IRs) et les récepteurs gustatifs (GRs) sur leurs membranes, qui codent des signaux chimiques exogènes liés à différents types de chémosensation 4,5,6. La caractérisation des notes de stratégie est essentielle pour l’élucidation des mécanismes moléculaires et cellulaires d’insecte chemoreception. Maintenant seule sensille enregistrement (SSR) est une technique largement utilisée pour la caractérisation d’insecte notes dans les sensilles de nombreux insectes, y compris les mouches7,8de papillons, coléoptères9, pucerons,10,11de criquets, et 12de fourmis. Cependant, peu d’études ont appliqué un SSR à insectes palpes13,14,15,16,17, parce que les structures particulières de leurs sensilles font une enregistrement électrophysiologique difficile18.

Des essaims de criquets pèlerins (Orthoptera) causent souvent des dommages aux cultures grave et une perte économique19. Les palpes sont censées jouer un rôle important dans le choix des aliments des criquets20,21,22,23,24. Deux types de sensilles chemosensoriels sont étudiés par un microscope électronique à balayage (SEM). En général, 350 sensilles chétiformes et 7-8 sensilles basiconiques sont observées sur chaque dôme du criquet pèlerin palpes18. Sensilles chétiformes sont des sensilles gustatives qui détectent les signaux chimiques non volatile, tandis que sensilles basiconiques ont une fonction olfactive, détection de signaux chimiques volatils.

Palpes de Criquet pèlerin, les diamètres des sockets cheveux des sensilles basiconiques (env. 12 µm), sont beaucoup plus élevées que celles des sensilles chétiformes (ca. 8 µm)18,25. La paroi cuticulaire de le basiconica de sensilles sur les palpes est beaucoup plus épaisse que celle des sensilles18. En outre, le dôme de la palpe a fluide contenu dans une cuticule très flexible. Ces caractéristiques font qu’une pénétration avec une microélectrode et une acquisition de bons signaux électrophysiologiques est plus difficile que pour les sensilles. Dans cet article, un protocole SSR détaillé et très efficace pour locust palp sensilles basiconiques est présente avec une vidéo.

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Protocole

1. préparation des Instruments et des insectes

  1. Préparation de tungstène électrodes et des stimuli solutions
    1. Fixer un nouveau fil de tungstène (diamètre de 0,125 mm, longueur 75 mm) dans un micromanipulateur et aiguiser dans une solution de nitrite (NaNO2) sodium 10 % (p/v) dans une seringue à 10 V fourni par une source d’alimentation pendant environ 1 min avec un stéréomicroscope (grossissement de 40 X).
    2. Tremper le fil de tungstène affûté à plusieurs reprises dans la solution2 NaNO de 10 %, environ 4 mm 5 V < 1 min (Figure 1 a).
    3. Examiner le diamètre de la pointe de tungstène affûté fréquemment sous le stéréomicroscope jusqu'à ce qu’il fait assez beau pour pénètrent la cuticule d’une sensille olfactive palpe du criquet pèlerin (Figure 1 b).
    4. Préparer les solutions de stimulation. Diluer chacun de la substance chimique stimulus dans l’huile minérale. Diluer 1-nonanol et acide nonanoïque à des dilutions de 10 %. Diluer le E-2-hexénal et hexanal à 10-2, 10-3, 10-4et 10-5.
    5. Préparer les tubes transportant les stimuli de Pasteur : insérer des bandes de papier filtre (longueur de 2 cm, largeur de 0,5 cm) dans les tubes de Pasteur, ajouter les solutions de stimulation dilué (chaque 10 µl) pour les bandes de papier filtre et puis branchez les tubes de Pasteur avec pointes de pipette (1 ml).
  2. Préparer l’insecte
    1. Arrière criquets (Locusta migratoria) avec des plantules de blé frais dans des conditions surpeuplées à une humidité relative de 60 %, une température de 28-30 ° C et une photopériode de 18:6 h (lumière : obscurité). Choisissez 1 à 3-jour-âgé de 5ème stade larvaire des larves de Criquet pèlerin et retirer les antennes avec des ciseaux fins pour éviter toute interférence lors de l’enregistrement.
  3. Préparer le titulaire du palpe maxillaire locust
    1. Utiliser une lame de verre (25 mm x 75 mm) comme la base du palpe maxillaire porte (MPH). Attacher un morceau de plastique (1 mm de hauteur, 10 mm de largeur et 35 mm de longueur) à un coin de la lame de verre avec un ruban adhésif double-face et enfin fixer une lamelle couvre-objet (18 x 18 mm) sur le dessus de la pièce en plastique avec adhésif double-face. Placer un petit morceau de ruban de caoutchouc rouge sur la lamelle couvre-objet comme une couche anti-dérapante. La pièce en plastique et le couvercle en verre constituent la plateforme pour le palp locust. La hauteur de la plate-forme est d’environ 1,5 mm.
    2. Installer un fil de tungstène (de 0,125 mm de diamètre, longueur de 36 mm) à une distance de 1,5 mm parallèle à l’intérieur bord du quai. Fixer les deux extrémités du fil sur la plateforme avec un ruban adhésif double-face.

2. préparation des palpes maxillaires Locust

  1. Couper un tube à centrifuger (1,5 ml) verticalement en deux et couper le bas. Placer le pèlerin dans le tube de préparation. Quitter la région ventrale et la tête du pèlerin exposé. Fixer l’ensemble à la lame de verre avec un ruban adhésif double-face (Figure 2 a).
  2. Tirez le palpe maxillaire droite sur la plate-forme.
  3. Mettre le fil de tungstène au quatrième segment de la palpe. Placez mastic adhésif de chaque côté du fil de tungstène, environ 2 mm de la palpe maxillaire (Fig. 2 a et 2 b).

3. seul sensille Recordings

  1. Placer la préparation du palpe maxillaire locust sous un microscope à un faible grossissement (X 100). Ajustez la position de la préparation jusqu'à ce que le palpe est perpendiculaire à l’électrode d’enregistrement (Figure 3 a).
  2. Insérer l’électrode de référence (électrode de tungstène) dans le œil de Criquet pèlerin à l’aide d’un micromanipulateur. Déplacer l’électrode d’enregistrement (électrode de tungstène) proche du palpe maxillaire avec le micromanipulateur (Figure 3 b et 3C).
  3. Ajuster le dispositif d’administration odeur à environ 1 cm de la palpe maxillaire (Figure 3 b).
  4. Ouvrez le logiciel d’enregistrement Auto Spike 32. Définissez les paramètres d’enregistrement comme suit : l’échelle de l’enregistrement sur 500 µV ; le niveau de coupure haute du filtre sur 300 Hz, le faible niveau de coupure sur 200 Hz ; et le pretrigger sur 10 s.
  5. Connecter l’électrode d’enregistrement pour un 10 x amplificateur AC/DC universel.
  6. Passer au microscope à un fort grossissement (X 500). Insérez l’électrode d’enregistrement dans la base d’une sensille basiconiques sur le palpe maxillaire et réglez délicatement l’électrode d’enregistrement afin d’obtenir de bonnes pointes spontanées (Figure 3D).
  7. Ouvrir le contrôleur de stimulation afin d’offrir un flux d’air continu à 20 ml/s. régler l’heure de la stimulation à 1 s. signaux d’enregistrement pour 10 s, à partir de 10 s avant le début de l’impulsion de stimulus.
  8. Un amplificateur d’AC/DC universel 10 x permet d’amplifier les signaux. Nourrir les signaux dans les 4 IDAC. Analyser les signaux avec le logiciel Auto Spike 32. Des signaux AC sont passe-bande filtré entre 200 à 300 Hz. utilisation Auto Spike 32 pour distinguer les amplitudes de crête à creux de bruits. Calculer les réponses des neurones comme l’augmentation des fréquences de potentiel d’action (pointes par seconde) sur la fréquence spontanée. Effectuer une analyse statistique en utilisant GraphPad Prism 7.

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Résultats

Deux sous-types de sensilles (pb1 et pb2) sur le palpe maxillaire de Criquet pèlerin sont identifiées basées sur la dynamique de réponse différente à des substances chimiques odorantes (10 % 1-nonanol et 10 % d’acide nonanoïque). Les neurones en pb1 produisent significativement plus de pics pour 1-nonanol qu’à l’acide nonanoïque tandis que les neurones en pb2 sont significativement que moins activés par 1-nonanol par rapport à l’acide nonanoïque (Figure 4). H...

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Discussion

Insectes s’appuient sur les palpes pour détecter les odeurs de nourriture, et leurs palpes sont censées jouer un rôle important dans la spéciation13,27. Les palpes sont de simples organes olfactifs et suscitent un intérêt croissant comme un modèle attrayant pour l’exploration de le neuromoléculaire réseaux sous-jacents chémosensation28.

Insecte labellar et palpe SSRs ont été réalisées avec succès sur la Dros...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail est soutenu par une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (No.31472037). Toute mention de noms commerciaux ou des produits commerciaux dans cet article est uniquement dans le but de fournir des informations précises et n’implique pas une recommandation.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fil de tungstèneADVENTW559504Utilisé pour fabriquer l’électrode et fixer le palpe
NaNO2Sigma-aldrich563218-25GUtilisé pour affûter le fil de tungstène
Alimentation CASyntechA2-70Fournir la tension lors de l’affûtage du fil de tungstène
StéréoscopeMoticSMZ-163Utilisé pour observer le affûtage du fil de tungstène
MicroscopeOlympusW-51Utilisé pour l’observation de la sensille sur le palpe maxillaire du criquet
Contrôleur intelligent d’acquisition de donnéesSyntechIDAC-4Affichage en temps réel à l’écran de tous les signaux avant et pendant l’enregistrement
Contrôleur de stimulusSyntechCS-55Utilisé pour le contrôle de l’application du stimulus
Électronique micromanipulateurC.M.D.TCFT-8301DUtilisé pour le mouvement mineur de l’électrode d’enregistrement
MicromanipulateurNarishigeMN-151Utilisé pour le mouvement mineur de l’électrode
de référence Haut-parleurEDIFIERR101T06Connecté à IDAC-4 et fournissant le son pour le signal
Base magnétiquePDOK-101Utilisé pour maintenir l’électrode et le tube de distribution du stimulus
Table d’isolation des vibrationsTianHeHAP-100-1208Utilisée pour isoler les vibrations de l’équipement
Lame de verreCITOGLASZBP-407Utilisée pour la fabrication de la base du MPH
Blu-tackBostikBlu-tack-45gFixation du fil de tungstène
Tube PasteurYAREWITEGPose du papier filtre contenant les solutions de stimulus

Références

  1. Carey, A. F., Carlson, J. R. Insect olfaction from model systems to disease control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), 12987-12995 (2011).
  2. Leal, W. S. Odorant reception in insects: roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes. Annual Review of Entomology. 58, 373-391 (2013).
  3. Zhang, J., Walker, W. B., Wang, G. Pheromone reception in moths: from molecules to behaviors. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 130, 109-128 (2015).
  4. Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
  5. Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila. Cell. 136 (1), 149-162 (2009).
  6. Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
  7. de Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. Odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 30, 537-552 (2001).
  8. Roelofs, W., et al. Sex pheromone production and perception in European corn borer moths is determined by both autosomal and sex-linked genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7585-7589 (1987).
  9. Larsson, M. C., Leal, W. S., Hansson, B. S. Olfactory receptor neurons detecting plant odours and male volatiles in Anomala cuprea beetles (Coleoptera: Scarabaeidae). Journal of Insect Physiology. 47 (9), 1065-1076 (2001).
  10. Zhang, R., et al. Molecular basis of alarm pheromone detection in aphids. Current Biology. 27 (1), 55-61 (2017).
  11. Cui, X., Wu, C., Zhang, L. Electrophysiological response patterns of 16 olfactory neurons from the trichoid sensilla to odorant from fecal volatiles in the locust, Locusta migratoria manilensis. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 77 (2), 45-57 (2011).
  12. Sharma, K. R., et al. Cuticular hydrocarbon pheromones for social behavior and their coding in the ant antenna. Cell Reports. 12 (8), 1261-1271 (2015).
  13. de Bruyne, M., Clyne, P. J., Carlson, J. R. Odor coding in a model olfactory organ: the Drosophila maxillary palp. Journal of Neuroscience. 19 (11), 4520-4532 (1999).
  14. Syed, Z., Leal, W. S. Maxillary palps are broad spectrum odorant detectors in Culex quinquefasciatus. Chemical Senses. 32 (8), 727-738 (2007).
  15. Lu, T., et al. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Current Biology. 17 (18), 1533-1544 (2007).
  16. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36, e1725(2010).
  17. Grant, A. J., Wigton, B. E., Aghajanian, J. G., O'Connell, R. J. Electrophysiological responses of receptor neurons in mosquito maxillary palp sensilla to carbon dioxide. Journal of Comparative Physiology A. 177 (4), 389-396 (1995).
  18. Blaney, W. The ultrastructure of an olfactory sensillum on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.). Cell and Tissue Research. 184 (3), 397-409 (1977).
  19. Hassanali, A., Njagi, P. G. N., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annual Review of Entomology. 50, 223-245 (2005).
  20. Chapman, R. F. Contact chemoreception in feeding by phytophagous insects. Annual Review of Entomology. 48, 455-484 (2003).
  21. Chapman, R. F., Sword, G. The importance of palpation in food selection by a polyphagous grasshopper (Orthoptera: Acrididae). Journal of Insect Behavior. 6, 79-91 (1993).
  22. Winstanley, C., Blaney, W. Chemosensory mechanisms of locusts in relation to feeding. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 750-758 (1978).
  23. Blaney, W., Duckett, A. The significance of palpation by the maxillary palps of Locusta migratoria (L.): an electrophysiological and behavioural study. Journal of Experimental Biology. 63, 701-712 (1975).
  24. Blaney, W. Electrophysiological responses of the terminal sensilla on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.) to some electrolytes and non-electrolytes. Journal of Experimental Biology. 60, 275-293 (1974).
  25. Jin, X., Zhang, S., Zhang, L. Expression of odorant-binding and chemosensory proteins and spatial map of chemosensilla on labial palps of Locusta migratoria (Orthoptera: Acrididae). Anthropod Structure & Development. 35 (1), 47-56 (2006).
  26. Zhang, L., Li, H., Zhang, L. Two olfactory pathways to detect aldehydes on locust mouthpart. International Journal of Biological Sciences. 13 (6), 759-771 (2017).
  27. Dweck, H. K. M., et al. Olfactory channels associated with the Drosophila maxillary palp mediate short- and long-range attraction. eLife. 5, e14925(2016).
  28. Bohbot, J. D., Sparks, J. T., Dickens, J. C. The maxillary palp of Aedes aegypti, a model of multisensory Integration. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 48, 29-39 (2014).
  29. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. Journal of Visualized Experiments. 84, e51355(2014).
  30. Ng, R., Lin, H. H., Wang, J. W., Su, C. Y. Electrophysiological recording from Drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility. Journal of Visualized Experiments. 125, e56147(2017).
  31. Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. Journal of Visualized Experiments. 49, e2489(2011).
  32. Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit recording methods to characterize neural activity in the locust (Schistocerca Americana) olfactory circuits. Journal of Visualized Experiments. 71, e50139(2013).
  33. Liu, F., Liu, N. Using single sensillum recording to detect olfactory neuron responses of bed bugs to semiochemicals. Journal of Visualized Experiments. 107, e53337(2016).

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