Base de données guidée-cytométrie en flux pour l’évaluation de la Maturation des cellules myéloïdes médullaires

Résumé

Le diagnostic MDS est difficile en l’absence de critères morphologiques ou cytogénétique non informatif. MFC pourrait aider à affiner le processus de diagnostic de MDS. Pour devenir utile pour la pratique clinique, l’analyse MFC doit reposer sur des paramètres avec une spécificité et une sensibilité suffisante, et les données doivent être reproductibles entre les différents opérateurs.

Résumé

Un groupe de travail initié au sein de l’Association Français de cytométrie en flux (AFC) a été développé afin d’harmoniser l’application de la cytométrie multiparamétrique (MFC) pour le diagnostic myéloïde en France. Le protocole présenté ici a été convenue et appliquée entre septembre 2013 et 2015 de novembre dans six laboratoires diagnostiques Français (centres hospitaliers universitaires de Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice et Lille et Institut Paoli-Calmettes dans Marseille) et a permis la normalisation de la moelle osseuse échantillon préparation et acquisition de données. Trois bases de données de maturation ont été développées pour les neutrophiles, monocytes et lignées érythroïde avec la moelle osseuse d’individus donateurs « sain » (individus sans aucune preuve d’une maladie hématopoïétique). Une solide méthode d’analyse pour chaque lignée myéloïde devrait être applicable pour le diagnostic systématique. De nouveaux cas peuvent être analysés de la même façon et comparés à des bases de données habituelles. Ainsi, des anomalies quantitatives et qualitatives phénotypiques peuvent être identifiés et ceux au-dessus de 2SD comparés aux données des échantillons de moelle osseuse normale devraient considérer comme révélateur de la pathologie. La limitation majeure est la variabilité plus élevée entre les données obtenues en utilisant les anticorps monoclonaux obtenus avec les méthodes basées sur les technologies d’hybridomes et actuellement utilisés dans le diagnostic clinique. Établissant des critères de validation technique des données acquises peut contribuer à améliorer l’utilité de MFC pour les diagnostics MDS. La mise en place de ces critères exige l’analyse contre une base de données. La réduction de la subjectivité du chercheur en analyse de données est un important avantage de cette méthode.

Introduction

En l’absence de marqueurs phénotypiques spécifiques aux changements dysplasiques se produisant dans les cellules myéloïdes pendant l’initiation MDS et la progression, une nouvelle approche a été proposée ces dernières années, basée sur l’évaluation des voies de maturation (expression altérée de les antigènes myéloïdes durant la production de cellules myéloïdes matures) ou de la distribution anormale des différents types de cellules dans la moelle osseuse (BM) cellule compartiments^1,2.

Cet article présente une nouvelle méthode d’application normalisée des MFC afin de détecter les cha....

Protocole

Le protocole ci-dessous a été approuvé par le « Comité de Protection des Personnes » (Comité d’éthique indépendant) 1 sud-est de University Hospital de Saint-Etienne, France.

1. paramètres du cytomètre en

Remarque : Les paramètres cytomètre ont été réalisés selon les recommandations découlent de la France, conformément à la EuroFlow procédure « protocole d’exploitation EuroFlow Standard (SOP) pour le réglage de l’Instrument et l’indemnisation (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).

1. Réglage de l’instrument mensuel
   1. Allumez le cytomètre. S’assurer que tous les niveaux de....

Résultats

Les 54 échantillons BM récoltés en anticoagulant K-EDTA ont été inclus dans l’étude. Le MFC ont été analysées en l’absence de toute information sur les patients. Étude rétrospective a montré que les échantillons de BM étaient de 7 donneurs sains (5 mâles et 2 femelles avec un âge médian de 47,4 [35-48], 11 personnes sans aucun signe d’une maladie hématopoïétique (8 mâles et 3 femelles avec un âge médian de 57,9 [35-72]) et 36 cas avec divers certaines pathologies : 1 cas avec anémie et c.......

Discussion

La qualité de l’aspiration de la BM pourrait avoir une incidence sur le résultat final. L’hémodilution de l’aspiration de la BM pourrait fausser la distribution des cellules dans les différents stades de maturation en raison de l’absence de cellules souches ou cellules précurseurs. Probablement employant un vrac lyse méthode peut-être contribuer à la normalisation de la ponction de la BM pour l’hémodilution dans les analyses de cytométrie en flux. En outre, les étapes essentielles pour l’évaluation de dysplasie myéloïde .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BD FACSCanto II cytomètre en flux	BD Biosciences, CA, USA SN	:	configuration 3-laser, 4-2-2, Détails des filtres et miroirs : https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifugeuse	AWEL Industries, FR	SN : 910120016 ; Modèle : 320002001	centrifugeuses à basse vitesse ; capacité 60 tubes FACS
Pipettes de 10µ ; L et 200µ ;
Pipettes
15 mL Tubes
tube en polypropylène pour souris FACS
Anti-Human HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	clone L243 Souris BALB/c IgG2a, &kappa ; Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Souris anti-humaine CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777	clone HI30 souris IgG1, &kappa ; Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Souris Anti-Humaine CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	clone CLB/fcGran1 Souris BALB/c IgG2a, &kappa ; Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Souris anti-humaine CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406	clone L138 Souris BALB/c X C57BL/6 IgG1, &kappa ; Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Souris anti-humaine CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	clone 8G12 Souris BALB/c IgG1, &kappa ; Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Souris anti-humaine CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	clone 104D2 Souris BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Souris anti-humaine CD11b	BD Biosciences, CA, États-Unis	333143	clone D12 souris BALB/c IgG2a, &kappa ; D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Souris Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	clone HI10A Souris BALB/c IgG1, &kappa ; Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Souris Anti-Human CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	clone E11 Souris IgG1, &kappa ; Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Souris anti-humaine CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	clone 10.1 Souris BALB/c IgG1, &kappa ; Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Souris anti-humaine CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	clone UP-H2 Souris BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Souris anti-humaine CD14	BD Biosciences, CA, États-Unis	641394	clone MoP9 Souris BALB/c IgG2b, &kappa ; Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Souris anti-humaine CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	clone CLB-IVC7 Souris IgG1, &kappa ; Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Souris Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	clone 266 Souris BALB/c IgG1, &kappa ; Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Souris Anti-Humaine CD33		345800	clone P67.6 Souris BALB/c IgG1, &kappa ; Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Souris anti-humaine CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	clone M-A712 Souris BALB/c IgG2a, &kappa ; Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Solution de lyse 10x Concentré (IVD)	BD Biosciences, CA, États-Unis	349202
FACSFlow Gaine	fluide BD Biosciences, CA, États-Unis	342003
FACSDiva CS& T Perles IVD	BD Biosciences, CA, USA	656046
PARTICULES D’ÉTALONNAGE ARC-EN-CIEL, 8 PICS	Cytognos, Salamanque, Espagne	SPH-RCP-30-5A	lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Particules de compensation Multicolore CompAds(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	réf. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Logiciel Diva versions 6.1.2 et 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
Comprimés salins tamponnés au phosphate	R& D Systems, Minneapolis, États-Unis	5564
Albumine sérique bovine  ;( BSA)	Sigma-Aldrich, France	A9647
Azoture de sodium 99 %	Sigma-Aldrich, France	199931
logiciel Infinicyt version 1.8.0.e	Cytognos, Salamanque, Espagne

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