Nous présentons ici un protocole visant à concevoir et fabriquer un embryon de poisson zèbre parant modèle, suivie d’une procédure détaillée sur l’utilisation de ce modèle pour haut débit embryon de poisson zèbre parant dans une plaque de 96 puits.
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Article de méthode
3 Dimensions (3D)-imprimé le modèle pour l’embryon de poisson zèbre haut débit parant
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le poisson-zèbre est qu'un organisme reconnu à l’échelle mondiale d’eau douce fréquemment utilisés en biologie du développement, l’écotoxicologie et la maladie humaine de domaines de recherche connexes. Grâce à ses caractéristiques uniques, y compris la grande fécondité, translucidité de l’embryon, développement rapide et simultané, etc., des embryons de poisson-zèbre sont souvent utilisés pour l’évaluation de la toxicité à grande échelle de produits chimiques et pharmaceutiques/composéent dépistage. Une procédure de dépistage typique implique frai du poisson-zèbre adulte, sélection d’embryons et parant les embryons en plaques multipuits. A partir de là, des embryons sont soumis à l’exposition et la toxicité du produit chimique, ou l’efficacité des médicaments/composés peut être évaluée relativement rapidement basé sur des observations phénotypiques. Parmi ces processus, embryons parant est une des étapes plus longues et fastidieuses qui limite le niveau de débit. Dans ce protocole, nous présentons une approche novatrice qui permet d’utiliser le gabarit arraying imprimés 3D couplé avec vide manipulation pour accélérer cette étape laborieuse. Le protocole ci-après décrit la conception d’ensemble du modèle arraying, un montage expérimental détaillé et procédure pas à pas, suivie des résultats représentatifs. En cas d’implémentation, cette approche devrait s’avérer bénéfique dans une variété d’applications de recherche utilisant des embryons de poisson-zèbre comme sujets de vérification.
Introduction
Comme un organisme modèle populaire, le poisson zèbre est largement utilisé dans les domaines de la toxicologie et médecine1,2,3,4. Par rapport aux plates-formes de in vitro , zebrafish offrent beaucoup plus grande complexité biologique qu’un ou deux types de cellules ne pouvaient pas offrir. En plus d’être un organisme entier, modèle, du poisson-zèbre grande fécondité, rapid et simultané du développement embryonnaire et orgue haute translucidité ont donné cette avantages uniques du modèle à utiliser pour la toxicité à grande échelle ou de médicaments/composé5de dépistage. Les centaines d’embryons produits par une paire de poissons zèbres adultes chaque semaine surpassent tous les autres modèles animaux et rendent convenant au criblage à haut débit.
Une procédure de dépistage typique à l’aide de poisson-zèbre implique une quantité importante de travail manuel, comme le poisson-zèbre adulte frai, la sélection d’embryons et parant les embryons dans des conteneurs où ils sont soumis à une exposition par immersion dans l’eau. Le développement des embryons est surveillé et effets observables tels que de la mortalité, taux d’éclosion et anomalie sont souvent évalués manuellement et utilisés comme l’identification préliminaire de la toxicité des produits chimiques ou des indications de l’efficacité des médicaments ou composés. Pour accélérer la procédure de présélection, approches telles que l’imagerie automatisée et analyse d’images assistée par ordinateur ont été explorées auparavant. Par exemple, microscopes à forte teneur en capacités d’imagerie ont été adaptés pour effectuer le champ lumineux automatisé ou imagerie de fluorescence sur des embryons de poisson-zèbre à divers stades de développement de 96/384 puits plaques6. Dispositifs microfluidiques couplés avec des microscopes ont été utilisés pour placer des larves de poisson zèbre par le biais de la manipulation actuelle pour l’imagerie du cerveau neurones7. Ces approches pourraient améliorer considérablement l’efficacité des acquisitions d’image par rapport au fonctionnement manuel traditionnel. En outre, avec le grand nombre d’images générées, outils d’analyse image ont également été développés pour accélérer le traitement des données, tel que démontré par Liu et al. et Tu et al. 8 , 9.
Le niveau de débit de l’imagerie et analyse d’images augmente, il est devenu clair que l’étape cinétiquement limitante de dépistage réside dans le processus de préparation des embryons de poisson-zèbre pour l’exposition, ce qui signifie généralement les parant en plaques de 96 ou 384 puits. Pour résoudre cette étape de goulot d’étranglement, guidée par vision robotique ont été développés par Mandrell et al. 10 et nous11 précédemment en remplacement de manutention manuelle mais les instruments étaient plutôt sophistiqués et il y a une courbe d’apprentissage profonde pour mettre en œuvre ces techniques. Par conséquent, pour fournir une approche facile à utiliser devient un facteur important pour améliorer encore le niveau de débit du poisson-zèbre dépistage et est le principal objectif de ce travail.
Dans ce travail, nous avons conçu et fabriqué un embryon parant modèle par impression 3D. Un tel modèle arraying a été conçu pour piéger l’embryon de poisson zèbre dans les puits qui correspondent avec une plaque de 96 puits standard. Au lieu de la sélection d’embryons et leur parant dans les puits individuels un par un, on pourrait effectuer array et l’embryon des tous les embryons de 96 dans une plaque multiplie à la fois. À l’aide de ce modèle et le protocole suivant, un pouvant accroître considérablement l’efficacité des parant des embryons en plaques multiplis, ce qui seraient à terme stimuler la capacité de dépistage par rapport au moins dix fois, à commande manuelle. Le protocole décrit ci-dessous inclut un design d’ensemble pour le parant de modèle, le frai du poisson-zèbre, la collecte des embryons et parant. La figure 1 illustre la conception globale du modèle arraying. Figure 2 montre une vue d’ensemble du protocole étape par étape sur l’utilisation du modèle décrit dans les parties 3 et 4.
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Protocole
1. conception et Fabrication d’un embryons de poisson-zèbre parant modèle
-
Concevoir le modèle arraying avec un 12 par 8, mise en page 96 puits qui correspond à un standard des plaques 96 puits. Utilisez les dimensions indiquées dans la Figure 1 a pour la chambre de provocation policière supérieure embryon (voir aussi le fichier supplémentaire).
- Utilisez les dimensions indiquées à la Figure 1 b et 1 D de la provocation policière bien.
- Utilisez les dimensions dans la Figure 1 pour le bas du réservoir vide.
- Utilisez les dimensions dans la Figure 1 b pour l’air / prise de courant.
- Une imprimante 3D (avec une précision de 0,1 mm) permet d’imprimer le modèle ; Voir Table des matières pour la résine recommandée à utiliser pour l’impression.
Remarque : les imprimantes 3D avec une précision de 0,1 mm sont recommandés pour la fabrication du modèle arraying (voir la Table des matières). La couleur suggérée pour la surface du modèle est gris foncé ou noir.
2. embryon de poisson zèbre frai
- Placez deux paires des poissons mâles et femelles par accouplement boîte un jour avant la ponte. Séparés mâles et des femelles par un mélangeur-doseur en plastique transparent.
- Décoller les séparateurs dans la matinée à mélanger des poissons mâles et femelles.
- Retirer les poissons mâles et femelles et récupérer des embryons de poisson-zèbre à l’aide d’une passoire à mailles fines. Lavez les embryons avec oeuf 250 mL d’eau (voir Table des matières).
- Transférez les embryons collectés pour boîtes de Pétri (90 mm de diamètre) avec la solution de Holtfreter (voir Table des matières) et retirer les embryons morts et non fertilisées à l’aide d’un stéréomicroscope.
- Placez les embryons dans un incubateur à 28,5 ° C. 4 h après la fécondation (hpf), observer les embryons et retirer les embryons morts et malsaines. Les embryons sont maintenant prêts pour l’étape suivante.
3. préparation du modèle de parant
- Laver le modèle 2 à 3 fois avec 500 mL d’eau désionisée et mettez-la dans l’étuve (45 ° C) pendant 5 min.
- Ruban adhésif de la chambre en bas avec un morceau de cachetage de film (Figure 2étape 1).
- Raccorder une pompe à vide par la sortie d’air au bas du modèle.
Remarque : Le vide max. recommandé pour la pompe à vide est de 0,1 Mpa. Soyez conscient de la force du vide utilisé. Si la dépression est trop forte, faites un trou en forme de croix sur le film d’étanchéité pour abaisser la pression.
4. parant des embryons de poisson-zèbre dans une plaque à 96 puits
- À l’aide d’une pipette en plastique, placer environ 150 embryons dans le modèle, comme illustré dans la Figure 2, étape 2.
- Branchez la pompe à vide à la sortie d’air pour générer une pression négative dans la chambre scellée par le film d’étanchéité à l’étape 3.3.
- Secouer le modèle entier horizontalement jusqu'à ce que chacun ait bien un embryon piégé (Figure 2, étape 3).
Remarque : Si la Solution de la Holtfreter sèche vers le haut avant les embryons sont pris au piège dans chaque puits, ajouter la Solution de Holtfreter supplémentaire dans la chambre de provocation policière et répétez cette étape. - Jeter la Solution de Holtfreter supplémentaire et les embryons qui ne sont pas piégés dans les puits (Figure 2, étape 4).
- Éteindre et débrancher la pompe à vide.
- Posez une plaque à 96 puits standard envers contre le gabarit (Figure 2, étape 5) et faites pivoter les deux à la fois (Figure 2, étape 6).
- Tapoter le fond du modèle ou de connecter l’air sortie d’un saupoudrage de gaz comprimé peut pour transférer les embryons tout pris au piège depuis le modèle à la plaque à 96 puits (Figure 2, étape 6).
- Répétez l’étape 4.1 à 4.8 pour préparer les plaques multipuits supplémentaires.
- Retirer le film de scellage et laver le modèle 3 fois de haut en bas avec 500 mL d’eau désionisée pour une utilisation future.
Remarque : N’utilisez pas de solvants organiques, comme l’éthanol, pour nettoyer le modèle.
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Résultats
La figure 3 montre un modèle typique d’arraying 3D-imprimés. Ce modèle utilise une résine photosensible comme matière première et a été fait par une imprimante 3D ; une couche de peinture noire a été appliquée pour fournir un meilleur contraste avec la couleur des embryons. La position de 96 puits (12 par 8) a été conçue pour s’adapter avec une plaque de 96 puits standard. De même, un modèle bien de 384 (24 par 16) pourrait également être conçus et fabriqués ...
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Discussion
Il y a deux étapes cruciales dans le présent protocole qui nécessitent une attention particulière pour une mise en œuvre du modèle 3D-imprimés pour parant des embryons de poisson-zèbre.
Le facteur le plus important sur la conception du modèle arraying est la provocation policière. À fait sûr, il n’y a qu’un seul embryon pris au piège dans chaque puits, un devrait porter une attention particulière pour le diamètre et la profondeur du puits provocation policière et le diamètre du trou à travers....
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ont rempli un brevet sur le modèle 3D imprimés décrit.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le programme « jeunesse de 1000plan », les fonds de démarrage de l’Université de Tongji et NSFC Grant # 21607115 et 21777116 (Lin).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Installation de poisson-zèbre | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Boîte d’accouplement | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Flacon de lavage, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Chlorure de sodium | Vetec | V900058-500G | |
| Chlorure de potassium | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Chlorure de calcium | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Bicarbonate de sodium ; | Vetec | v900182-500G | |
| Hydrate de bleu de méthylène | TCI | M0501 | |
| Acide chlorhydrique | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011008 | |
| Sels de mer | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipette | Fisherbrand | 13-675M | |
| Goutte contrôlée Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Incubateur biochimique | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| UnionTech | Lite600 | ||
| Résine photosensible | UnionTech | UTR9000 | |
| Pompe à vide | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhésif PCR Plaque Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well | plate Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 - 300 &mu ; l | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Pulvérisateur de gaz comprimé | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV / UF | |
| Four de séchage | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| Eau | Eau hors de l’installation' s système | ||
| d’eau Oeuf | eau Diluer 60mg " Océan instantané" sels marins et 0,25 mg/L de bleu de méthylène dans 1 L d’eau DI | ||
| Holtfreter' | Dissoudre 7,0 g de chlorure de sodium (NaCl), 0,4 g de bicarbonate de sodium (NaHCO3), 0,1 g de chlorure de potassium (KCl), 0,235 g de chlorure de calcium (CaCl2.2H2O) dans 1,9 L d’eau DI. Ajustez le pH à 7 à l’aide de HCl et ajustez le volume à 2 L à l’aide d’eau Di |
Références
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533(2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
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Réimpressions et autorisations
