Article de méthode

Correspondance de contraste de détergent dans les expériences de diffusion de neutrons de petits angles pour l’analyse structurale de protéines membranaires et la modélisation de Ab Initio

DOI :

10.3791/57901

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21 octobre 2018

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1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole montre comment obtenir un modèle basse résolution ab initio et des détails de structure d’une protéine de membrane solubilisée détergent en solution par la diffusion des neutrons de petits angles avec filtrage de contraste du détergent.

Résumé

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L’instrument de diffusion de neutrons de petits angles biologique au haut Flux Isotope réacteur du Oak Ridge National Laboratory est dédié à l’étude des biomatériaux, biocarburants de traitement et les matériaux bio-inspirés couvrant nanomètre à échelles de micromètre de longueur. Les méthodes présentées ici pour étudier les propriétés physiques (p. ex., la taille et la forme) des protéines membranaires (ici, MmIAP, une protéase d’aspartyl intramembranaires de Methanoculleus marisnigri) dans les solutions micellaires formant des détergents sont bien adapté pour cet instrument de diffusion de neutrons de petits angles, entre autres. Autres techniques de caractérisation biophysique sont gênées par leur incapacité à régler les contributions de détergent dans une structure complexe de protéine-détergent. En outre, l’accès au laboratoire Bio-deutération fournit des capacités uniques pour la préparation des cultures à grande échelle et exprimant des protéines marquées du deutérium pour le signal de diffusion accrue de la protéine. Tandis que cette technique ne fournit pas de détails structuraux à haute résolution, ce manque de connaissances structurale des protéines membranaires contient plusieurs zones adressables de recherche sans nécessiter de résolution atomique près. Par exemple, ces domaines incluent la détermination des États oligomériques, formation d’un complexe, des changements conformationnels durant la perturbation et les événements de pliage/dépliage. Ces enquêtes peuvent être facilement exécutées via des applications de cette méthode.

Introduction

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Les protéines membranaires sont codées par environ 30 % de tous les gènes1 et représentent une forte majorité des cibles pour des médicaments modernes. 2 ces protéines effectuent un large éventail de fonctions cellulaires vitales,3 mais en dépit de leur abondance et leur importance, ne représentent qu’environ 1 % du totales structures déposées dans le Research Collaboratory Structural Bioinformatics (RCSB) protéine Banque de données. 4 en raison de leur caractère hydrophobe partiellement, détermination structurale des protéines membranaires a été extrêmement difficile. 5 , 6 , 7

Comme beaucoup de techniques biophysiques nécessite monodispersés particules en solution pour la mesure, isoler des protéines de la membrane des membranes natives et la stabilisation de ces protéines dans un imitateur soluble des membranes natives a été un sujet de recherche active au cours des dernières décennies. 8 , 9 , 10 ces investigations ont conduit au développement de nombreuses nouvelles amphiphiles assemblées de solubiliser les protéines membranaires, comme nanodiscs, bicelles de11,12,13 ,14,15 et amphipols. 16 , 17 cependant, l’utilisation de détergents micelles reste une des approches plus courantes et les plus simples pour satisfaire aux exigences de la solubilité d’une protéine donnée. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 malheureusement, aucun détergent unique ou mélange magique de détergents n’existe actuellement qui satisfait à toutes les protéines de la membrane ; ainsi, ces conditions doivent être empiriquement dépistage pour les besoins uniques de chaque protéine. 26 , 27

Détergents s’auto-assembler en solution au-dessus de leur concentration micellaire critique pour former des structures agrégées appelées micelles. Les micelles sont composés de nombreux monomères détergents (qui vont généralement de 20 à 200) avec chaînes alkyl hydrophobe, formant un noyau de micelles et les groupes de tête hydrophiles en une couche de coquille de micelle face à solvant aqueux. Le comportement de détergents et de la formation des micelles a été classiquement décrite par Charles Tanford dans L’effet hydrophobe, de28 et de tailles et formes des micelles de détergents couramment utilisés dans les études de protéines membranaires ont été caractérisé à l’aide de petits angles diffusion. 29 , 30 organisme de détergent sur les protéines de la membrane a également été étudiée, et la formation des complexes protéine-détergent (PDC) est prévue avec les molécules de détergent entourant la protéine dans un arrangement qui ressemble à du détergent pur micelles. 31

On a ajouté avantage dans l’utilisation de détergents est que les propriétés de micelle qui en résulte peuvent être manipulées en incorporant d’autres détergents. De nombreux détergents pièce mélange idéal, et sélectionnez Propriétés de micelles mixtes peuvent même être prédites par les composants et le ratio de mélange. 22 Toutefois, la présence de détergent peut encore présentent des défis pour la caractérisation biophysique en contribuant au signal global. Par exemple, avec des rayons x et des techniques de diffusion de la lumière, signal de détergent dans le PDC est pratiquement impossible à distinguer de protéine. 32 enquêtes avec particule cryo microscopie électronique (cryo-EM) s’appuient généralement sur des particules (congelés) pris au piège ; des détails de structure de la protéine sont toujours cachés par certains détergents ou une forte concentration de détergent qui ajoute à l’arrière-plan. 33 autres approches vers l’interprétation de la structure complète de PDC (y compris le détergent) ont été faites par des méthodes de calcul qui cherchent à reconstruire le détergent autour d’une protéine de membrane donnée. 34

Dans le cas de la diffusion des neutrons, l’arrangement de noyau-enveloppe de détergent dans la micelle produit un facteur de forme qui contribue à la dispersion observée. Heureusement, les composants de la solution peuvent être modifiées telle qu’ils ne contribuent pas à la dispersion observée nette. Ce processus de « contraste correspondant » est réalisé en remplaçant le deutérium de l’hydrogène atteindre une densité de longueur de diffusion qui correspond à celle de l’arrière-plan (tampon). Un choix judicieux de détergent (avec des homologues deutérés disponibles) et de leur ratio de mélange doivent être considérés. Pour détergents micelles, cette substitution peut être effectuée à l’aide d’un détergent avec le même groupe de tête mais comportant une chaîne alkyle deutéré (d-queue au lieu de h-queue). Étant donné que les détergents sont bien mélangés,35 leurs agrégats aura une densité de longueur de diffusion qui est la fraction molaire pondérée moyen des deux composantes (h-queues et d-queues). Lorsque ce contraste moyen correspond à celle du groupe de tête, les structures globales uniformes peuvent être entièrement assorties pour supprimer toutes les contributions à la dispersion observée.

Nous présentons ici un protocole visant à manipuler le contraste de neutrons des micelles détergents en incorporant des molécules de détergent chimiquement identiques avec des chaînes alkyles marqués au deutérium. 19 , 36 , 37 cette façon contraste simultané complet correspondant de micelle principale et de la coquille, qui est une capacité unique de diffusion des neutrons. 35 , 38 avec ce niveau sensiblement raffiné de détail, contraste correspondant peut activer sinon irréalisables études des structures des protéines membranaires. En outre, cette approche contraste équivalente pourrait être étendue à d’autres systèmes impliquant détergent comme polymère échange réactions39 et huile-eau dispersants,40 ou même d’autres agents solubilisants, tels que bicelles,41 nanodiscs,42 ou bloc copolymères. 43 A approche similaire tel que décrit dans ce manuscrit, mais en employant une seule espèce de détergent avec des substitutions de deutérium partielle sur le groupe alkyle de chaîne et/ou de la tête, a été récemment publié. 37 alors que cela est susceptible d’améliorer la répartition aléatoire de l’hydrogène et de deutérium dans le détergent par rapport à l’approche présentée ici, le nombre limité de postes disponibles sur le détergent de substitution et en deux étapes synthèse de détergent nécessaire pose des défis supplémentaires aux fins d’examen.

Les étapes 1 et 2 du protocole détaillés ci-dessous souvent se chevauchent car la première expérience de planification doit être faite pour présenter une proposition de qualité. Cependant, la proposition est considérée ici comme la première étape à souligner que ce processus doit être démarré bien avant une expérience de neutrons. Il est à noter également qu’une étape préalable, ce qui devrait être démontrée par la proposition, est d’avoir la caractérisation biochimique et physique (y compris la pureté et la stabilité) de l’échantillon soutenant la nécessité d’études de neutrons. Une discussion générale de neutrons de petits angles de diffusion (San) est abordée dans cet article. Une introduction brève mais complète est disponible dans l’ouvrage de référence, Caractérisation des matériaux par Kaufmann,44 et une solution complète de manuels ciblée sur biologique petits angles de diffusion a été publié récemment. 45 autres lectures recommandées est donnée dans la section « Discussion ». Diffusion petits angles utilise le vecteur de diffusion que l'on appelle Q la quantité central qui décrit le processus de diffusion. Cet article reprend la définition généralement acceptée Q = 4π sin (θ) / λ, où θ est la moitié l’angle entre le faisceau entrant et épars et λ est la longueur d’onde du rayonnement neutronique en angströms. Autres définitions existent qu’utilisation différente symboles tels que les de ' pour le vecteur de diffusion et qui peuvent différer par un facteur 2π ou à l’aide de nanomètres au lieu de Angstrom (voir aussi la discussion de la Figure 10).

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Protocole

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1. préparer et soumettre un Neutron installation faisceau temps Instrument et proposition

  1. Consulter les ressources en ligne pour l’identification des installations de diffusion de neutrons qui fournissent l’utilisateur générale neutrons faisceau temps accès, tels que l’Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Une carte des installations de neutrons et d’informations sur la recherche de neutrons dans le monde entier est disponible en ligne. 46 , sachez que ces installations ont généralement des appels à propositions ; Ceci permet de déterminer quand la prochaine fois de faisceau sera disponible. Neutrons sont utilisés pour une variété d’applications ; Rechercher des instruments de diffusion (San) petit angle neutrons, particulièrement ceux avec des capacités d’échantillons biologiques.
  2. Ressources fournies par les installations de neutrons permet d’aider à diriger le processus de soumission de proposition neutrons faisceau fois. Consulter avec un Neutron Scattering scientifique (NSS) qui est associée à l’instrument pour lequel vous allez appliquer. Examiner l’information actuelle de la facilité de neutrons au sujet des appels de propositions, des délais et des conseils pour la présentation ; pour Oak Ridge c’est disponible en ligne. 47 soumettre la proposition de temps de faisceau suite à toutes les directives pour une présentation réussie.
  3. Si deutéré de protéine est nécessaire (voir 2.2), installations de diffusion de neutrons sont souvent prise en charge par les laboratoires et l’expertise dédiée à la production de matériaux deutérées. Pour demander l’accès à la deutération Bio Lab (BDL) à ORNL, sélectionnez la BDL comme deuxième instrument dans le système de la proposition. Tandis que la proposition SANS se poursuite une étude de faisabilité et par un Comité d’examen scientifique, BDL requêtes sont seulement projetés une étude de faisabilité. Pour faciliter l’étude de faisabilité BDL, soumettre une information rempli demande formulaire48 qui décrit le protocole d’expression de protéine et le rendement estimé (disponible en ligne).
  4. Après avoir réussi-examen par les pairs de la proposition de temps de faisceau, confirmer la date attribuée de temps de faisceau avant l’expérience. Assurez-vous que tous les détails d’échantillon et de la mémoire tampon et les formules sont correctement inscrit dans la proposition de révision. Toute modification apportée au plan expérimental proposé, y compris les changements dans la composition de l’échantillon et le tampon, une notification de l’installation.
    Remarque : Modifications devraient être envisagées dès que possible avec le SNRS assigné.

2. déterminer les neutrons contraste Points de Match et le contraste nécessaire pour la mesure de la protéine

  1. Recueillir de l’information (de l’information du fournisseur des produits, des bases de données en ligne, les valeurs publiées, etc.) relatives aux compositions atomiques et de volumes pour les composants de système de détergent soit égalé par le contraste. Cette information est utilisée pour déterminer les densités de la longueur de diffusion neutronique (SLD) et contraste ainsi points de match (CMPs) en solution, ce qui est essentielle à l’obtention de qualité SANS informations structurelles et les données pour la protéine de la membrane d’intérêt dans le cadre d’une PDC. Un tableau résumant les points de match propriétés et contraste physiques pour détergents utilisés couramment dans les études biophysiques des protéines membranaires est inclus (tableau 1).
  2. Déterminer les neutrons SLD à l’aide de l’application web de paillis : ModULes pour l’analyse de contraste Variation données49 (disponible en ligne50 de gratuit). Un lien vers le manuel de l’utilisateur se trouve sur la page d’accueil. Accéder au site Web et lisez la documentation qui l’accompagne. Figure 1 et Figure 2 donnent un aperçu de contraste module d’entrée et de sortie pour deux exemples connexes.
    Remarque : Autres sites Web pour le calcul des SLD est disponibles, tels que celui maintenu par le centre de la technologie (NIST) et le National Institute of Standards pour la recherche de neutrons. 51
    1. Ouvrez le module de contraste en cliquant sur « Contraste » situé dans le volet de navigation de gauche. Prévoir un titre du projet de texte et entrez les détails ci-dessous pour les deux composants (p. ex., détergent groupe de tête et queue) comme "sous-unité 1' et ' sous-unité 2'.
    2. Entrez la formule moléculaire pour chaque composant dans la boîte de texte « Formule ».
      Remarque: le bouton radio am' doit être activée sous « Type de Substance » pour entrer une formule moléculaire. En outre, utiliser la lettre « X » dans la formule pour indiquer des atomes d’hydrogène facilement échangeables. Les séquences de protéines, ARN ou ADN peuvent être saisis si le correspondant « P », « R », ou a ' cases d’option sont sélectionnés. Si plusieurs copies d’un composant existent au sein de la sous-unité, la valeur de « Nmolecules » peut être modifiée en conséquence. Un exemple concret ici se rapporte aux détergents de type lipidique contenant deux queues identiques, permettant ainsi la formule pour une queue devant figurer avec Nmolecules égal à 2.
    3. Entrez le volume en angströms cubes pour chaque composant dans la boîte ci-dessous « Volume (Å3) ». Utilisation formule28 de Tanford pour chaînes alkyles de longueur n, Vqueue = 27,4 + n * 26,9, de calculer le volume approximatif de queue, ou d’obtenir des volumes moléculaires d’informations produit fourni ou publié des valeurs en la littérature.
    4. Entrer dans les détails pour les composants de la mémoire tampon. Changer le « nombre dissous dans le solvant, les espèces » à l’aide du menu déroulant pour ajouter ou supprimer des lignes pour chaque composant de la mémoire tampon. Dans le cas de formation de micelles détergents, inclure les monomères de détergent gratuits comme composants de tampons distincts à la concentration micellaire critique de la lessive (CMC).
    5. Cliquez sur « Soumettre » pour effectuer les calculs de contraste de neutrons et de générer une page de résultats qui fournit un tableau de longueur de diffusion densité et contraste points gagnés ainsi que des formules permettant de déterminer ces paramètres à n’importe quel pourcentage donné D2O en la mémoire tampon. Revoir les paramètres de diffusion avec une attention particulière aux composante CMPs. Si les points de match sont semblables (à moins de 10 % D2O) et la concentration micellaire libre est faible, alors la moyenne CMP peut être utilisé pour faire correspondre le contraste les contributions de détergent. Dans la plupart des cas, la COP/MOP du détergent groupe de tête et le croupion sera différente de plus de 10 à 15 %, produisant un facteur de forme de coeur-écorce dans les données SANS qui obscurcit la collecte directe du signal de diffusion de la protéine seule.
  3. Évaluer le contraste entre détergent groupe de tête et la queue. Lorsque le détergent tête groupe alkyle chaîne arrière et SCPM ne sont pas bien assortis, la disponibilité et l’incorporation d’un détergent substitués en deutérium peuvent permettre à diffusion des densités de longueur de choisir les composants à être manipulés. Dans la plupart des cas, il faudra former une micelle mixte grâce à l’incorporation d’un détergent identique avec des chaînes alkyles deutérium-substitués. L’ajout de deutérium déclenche la densité de longueur de diffusion du noyau formé par les queues de chaîne alkyle. Le point de terminaison souhaité, dans ce cas, est telle que le groupe de tête shell CMP et le noyau de chaîne alkyle CMP ont approximativement les valeurs égales.
    1. Soulever la COP/MOP du noyau détergent micelle est approximativement égale à la COP/MOP de la coque du groupe de tête en déterminant le rapport approprié de mélange entre h-queues et d-queues qui réalise le parfait contraste avec les groupes de tête. Une condition préalable à cette détermination est la connaissance de la COP/MOP pour une queue de chaîne alkyle substitués en deutérium. Un équivalent disponible dans le commerce de n-dodécyl β-D-maltoside (DDM) est disponible à l’hydrogène de chaîne alkyle toutes remplacée par deutérium (d25-DDM). Répéter les calculs de contraste décrits à l’étape 2.1 pour un empennage avait ' à la place de l’h « queue ».
    2. Calculer le rapport molaire de h-queue à queue d requis pour filtrage de contraste avec le groupe de tête CMP. Cette détermination peut aider la formule suivante :
      CMPtête = CMPh-queue * χh-queue + CMPqueue d * χd-queue
      où CMP est la densité de longueur de diffusion et χ est la fraction de volume pour le composant de détergent tête, h-queue, ou d-queue. Pour des solutions tampons de DDM, incorporation de 44 % en poids (43 % en mole) du détergent total comme d25-DDM avec chaînes alkyles substitués en deutérium produit un seul CMP à 48,5 % D2O pour tête et de queue.
  4. Examiner le degré de substitution de deutérium pour la protéine de la membrane. Pour mesurer un signal suffisant de diffusion de la protéine, la COP/MOP pour la protéine doit être au moins 15 % D2O en solution loin le détergent CMP et les conditions de mesure. Le signal augmente avec le carré de cette différence de %. Étant donné que la COP/MOP d’une protéine sans étiquette se produit généralement avec ~ 42 % D2O en solution (un CMP semblable à de nombreux groupes de tête détergents), étiquetage de deutérium de la protéine est presque toujours une nécessité. 52

3. exprimer et purifier la protéine membranaire d’intérêt

  1. Préparer le milieu LB (bouillon de lysogénie) et cultiver des Escherichia coli (e. coli) cellules contenant un vecteur d’expression inductible de l’ordre de protéine cible.
    1. Préparer le milieu minimal. Dans H2O ou D2O, dissoudre 7,0 g/L (NH4)2SO4, 5,25 g/L de Na2HPO4, 1,6 g/L KH2PO4, citrate de 0,50 g/L diammonique hydrogène, glycérol 5,0 g/L, 1,0 mL/L de 20 % p/v MgSO 4·7H2O et 1,0 mL/L de métaux-traces Holme (0,50 g/L CaCl2·2H2O, CoCl de 0,098 g/L2, 0,102 g/L CuSO4, 16,7 g/L FeCl3·6H2O, 0,114 g/L MnSO4· H2O, 22,3 g/L Na2EDTA·2H2O et 0,112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Préparer les solutions antibiotiques appropriées à l’aide de H2O ou D2O.
    3. Préparer une solution isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside H2O ou D2O.
    4. Stérile-filtre toutes les solutions en sec, containers de stérilisation utilisant le flacon vide et filtres avec une porosité de 0,22 micron de seringues.
  2. Adapter les cellules d’Escherichia coli au moyen avant marqués au deutérium mesurent-vers le haut pour la surexpression d’une protéine deutériée.
    1. Inoculer 3 mL de milieu LB avec une colonie isolée d’une gélose de lysogénie bouillon (LB) ou de cellules provenant d’un stock de glycérol congelés. La croissance de cellules à 37 ° C dans un incubateur à agitation à 250 tr/min ou réduire la température à 30 ° C ou en dessous pour éviter la prolifération de la culture lors de l’incubation du jour au lendemain.
      Remarque : La procédure d’adaptation peut varier. 55 , 56 , 57
    2. Une fois que la culture de la LB est passé à une densité optique à 600 nm (OD600) de ~ 1, diluez-la 01:20 dans 3 mL de milieu minimal de H2O et poussent à une OD600 de ~ 1. Répéter le 01:20 dilutions à l’aide d’un milieu minimal contenant 50, 75 et 100 % D2O (ou à concurrence du pourcentage désiré de2O D).
      Remarque: comme la D2O contenu est augmenté, les taux de croissance vont diminuer. La relation entre le pourcentage de2O D dans la substitution de médias et de deutérium de croissance dans la protéine a été rapportée dans la littérature. 58 , 59 , 60
    3. Continuer à croître de la culture dans un bioréacteur pour augmenter le rendement d’une masse cellulaire deutéré (Figure 3).
      Remarque : Procédures pas à pas pour l’opération de bioréacteur ont été examinés ailleurs. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Récolter et lyser les cellules d’Escherichia coli pour la purification d’extraction et de protéine de membrane
    1. Les cellules de granule par centrifugation à ~ 6 000 x g pendant environ 30-45 min à 4 ° C.
    2. Adoucir le culot cellulaire par trempage dans un tampon sur la glace pendant environ 30 min. Puis, doucement Resuspendre le culot de cellules dans un tampon de pipetage doucement avec une pipette sérologique, ou doux balancement sur un rocker 2D, à une concentration finale de 1 ~ g hydro-électriques masse/10 mL du tampon.
      NOTE: un tampon exemple est 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide), pH 7.5, 200 mM NaCl complétée avec une tablette d’inhibiteur de protéase.
    3. Lyser les cellules resuspendues avec trois passe par un homogénéisateur haute pression à 10 000 lb/po2 tout en refroidissant les sorties de fonds.
      Remarque : Selon l’échelle requise, autres méthodes lyse peuvent être utilisé (par exemple, par la presse Français ou la sonication).
    4. Débris cellulaires Pellet par centrifugation à ~ 4 000-5 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Répétez cette étape jusqu'à ce que le liquide surnageant est clarifié.
    5. Ultracentrifugeuse (~ 150 000 x g pendant 30-45 min) le surnageant de l’étape précédente, qui contient le soluble et fractions membranaires. Le diabolo après ultracentrifugation contient la fraction membranaire.
    6. Resuspendre le culot de membrane dans un homogénéisateur Dounce grand et d’isoler la fraction de membrane à nouveau par ultracentrifugation (étape 3.3.5). Répétez cette opération au moins une fois pour éliminer les protéines faiblement liés.
    7. Solubiliser les membranes en balançant doucement pour ~ 30 min à 4 ° C dans un tampon contenant le détergent approprié pour la purification. La solubilisation est visible lorsque la suspension se détourne de nuageux transparent. Enlever les matières insolubles par ultracentrifugation (~ 150 000 x g pendant 30-45 min).
      Remarque : Un tampon exemple est 50 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazole de 20 mM et 4 % (p/v) : DDM de purification par chromatographie d’affinité Ni2 + .
  4. Purifier la protéine selon un protocole précédemment développé pour des formes protonées.
    Remarque : Voir Naing et coll. pour un protocole de purification d’exemple pour une protéine contenant le tag marisnigri M. JR1 intramembranaires aspartyl protéase (d-MmIAP). Le rendement final était de 65 ~ 1 mg de deutéré de croissance de culture cellulaire 5 L deutéré, qui a été utilisé dans l’expérience SANS (Figure 4).
  5. Échanger la protéine purifiée dans le « dernier échange tampon » contraste correspondant.
    1. Préparez 200 mL de « Dernier échange tampon » contenant le mélange correct pour le contraste correspondant, par exemple,20 mM HEPES, pH 7.5, 250 mM NaCl et 0,05 % total DDM (0,028 % DDM et 0,022 % d25-DDM) dans 49 % D2O.
    2. Equilibrer une colonne d’exclusion de taille avec > 2 volumes de colonne (CV) du « Dernier échange tampon » en 3.5.1 en utilisant un système Fast protéine Liquid Chromatography (FPLC).
    3. Après l’injection de l’échantillon, exécutez la colonne et isoler les fractions correspondant à la protéine d’intérêt.
    4. Concentrer les protéines à la concentration finale souhaitée (2-5 mg/mL).
      Remarque : Un volume de ~ 300 μL est tenu de remplir une cuvette de quartz cylindrique de 1 mm utilisée pour les San.
    5. Réserver une partie aliquote de tampon correspondant pour SANS soustraction du fond.
      Remarque : L’aliquote peut être pris directement à partir de la mémoire tampon de prête, ou idéalement d’une fraction d’élution propre à la fin de la course des FPLC.

4. faire les derniers préparatifs pour le temps de faisceau et de percevoir SANS données

  1. Après que la proposition a été acceptée et l’accès au site a été approuvé, complète tous les Instr heure assignée de faisceau. Il s’agit d’été, ainsi que le laboratoire radiologique, sur place et de la formation spécifique à l’instrument de formation basée sur le web.
    Remarque : Exigences de formation peuvent dicter l’arrivée avancée pour la première fois que des utilisateurs. Plus d’informations sont disponibles en ligne. 66
  2. Charger des échantillons et tampons pour la collecte de données.
    Remarque : Une vue d’ensemble de la diffusion des neutrons de petits angles biologique (Bio-SANS) instrument échantillon environnement area est montré dans la Figure 5.
    1. Charger les échantillons et les tampons dans les cellules de quartz. Il existe des cellules de quartz le scientifique de l’instrument ou les installations. Gel-chargement conseils permet d’accéder à l’ouverture étroite de la plupart des échantillons de cellules.
    2. Assurez-vous que l’obturateur du faisceau est fermé, puis aborder le domaine de l’environnement échantillon et placer les cellules de quartz dans le changeur de l’échantillon. Enregistrer la position de changeur d’échantillon pour chaque cellule de l’échantillon.
    3. Vérifiez la zone et s’assurer que la marche des rayons est exempt de l’obstruction, alors quitter la zone de prélèvement environnement et ouvrir l’obturateur de faisceau.
      Remarque : Soigneusement suivre toutes les règles d’installation et de réglementations, obéir à toutes les annonces et tenir compte des conseils de la scientifique de l’instrument. Échantillons pas de retirer de la poutre et manipulés après l’exposition à la poutre sans précautions spéciales suivantes. Consulter avec un technicien de contrôle radiologique (RCT) avant ces procédures.
  3. Exécuter l’analyse de table pour la collecte de données automatisée
    1. Faire fonctionner l’instrument grâce au contrôle personnalisé un logiciel basé sur LabVIEW, environnement de contrôle Instrument spectromètre (épice). Suivez les instructions pour le fonctionnement de l’appareil fourni par le scientifique de diffusion de neutrons. Un aperçu des fenêtres d’exploitation table scan est fourni à la Figure 6.
    2. Après avoir entré les informations requises dans les zones appropriées, exécutez l’analyse de la table et un processus de collecte automatisée des données commencera. Surveiller la progression via l’onglet « Statut de Scan de Table ».

5. réduire SANS données d’Image 2D à 1D emplacement

  1. Identifier chaque fichier de données exemple et tampon de la scan enregistré les numéros. Chaque mesure on attribuera un numéro d’analyse unique. Cette information est utile au cours de la réduction des données pour identifier chaque échantillon correspondant et la paire de tampon.
  2. Utiliser un logiciel MantidPlot et script Python pour la réduction
    1. Neutron Scattering utilisateurs sont fournis avec des informations de compte pour accéder à leurs données sur le Cluster distant d’analyse. 67 , connectez-vous au Cluster Analysis distant et exécuter « MantidPlot » de la ligne de commande. Figure 7 et Figure 8 sont fournies pour aider ces étapes.
    2. Obtenir un Script de réduction de l’utilisateur du Neutron Scattering scientifique (cela arrivera généralement au cours de l’expérience) ; Ce script est basé sur Python et contiendra tous les nécessaire étalonnage et mise à l’échelle des ajustements afin de réduire l’image 2D diffusion dans une intrigue 1D des intensités éparses en fonction de l’angle de diffusion, i.
    3. Ouvrez le Script de réduction de l’utilisateur fourni dans MantidPlot et placez les numéros correspondants de scan ou l’identification pour les paires d’échantillon et de la mémoire tampon dans la liste appropriée.
    4. Exécutez le script pour générer des données réduites sous forme de fichier texte de quatre colonnes (ordre des colonnes est Q, i, i erreur, erreur Q) à l’emplacement spécifié. Cliquez avec le bouton droit sur l’espace de travail approprié dans MantidPlot et sélectionnez « Tracé avec erreurs... » pour un premier examen des profils diffusion.

6. analyser les données pour les paramètres structuraux de la particule de diffusion

  1. Transférez le fichier de données réduites à partir du serveur d’analyse sur un ordinateur local à l’aide de transfert de fichier FTP sécurisé. Cela peut être effectuée à l’aide d’un logiciel comme FileZilla ou CyberDuck. Des instructions supplémentaires et des détails de connexion pour le système de fichiers du serveur analyse sont fournis sur la page de connexion analysis.sns.gov.
  2. Télécharger le ATSAS logiciel suite65,68 (suite ATSAS entière). 69 programmes individuels70 sont également disponibles en ligne pour analyser les données SANS, à savoir déterminer les paramètres structuraux et ab initio de modèles.
    Remarque : Plusieurs options sont disponibles pour SANS analyse des données des biomacromolécules. 45
  3. Utiliser PRIMUS71 pour le traçage des données, mettre en mémoire tampon mise à l’échelle et soustraction et l’analyse de Guinier.
    1. Lancer le ATSAS « Analyse de données SAS » application et charge les données réduites des fichiers correspondant à la paire / échantillon de tampon.
      1. Pour mesurer correctement la mémoire tampon, sélectionnez une plage de données à haute Q (Q > 0.5 Å-1) où les deux profils sont similaires et plates et cliquez sur le bouton de « L’échelle », situé sous les « opérations » onglet. Un facteur d’échelle s’appliquera au tampon telle que ces deux régions plates doivent se chevaucher. Soyez prudent : il devrait y avoir une raison plausible de physique qui justifie la mise à l’échelle de l’intensité de la mémoire tampon pour correspondre à l’échantillon. Si l’écart est grand, consulter un scientifique de l’instrument aux approches valides pour soustraction de fond. 44 , 45 , 72
      2. Augmenter la plage de données pour afficher tous les points. Cliquez sur « Soustraire » pour effectuer cette opération. Cliquez avec le bouton droit sur le fichier de données soustraites à la mémoire tampon dans la légende et enregistrez ce fichier pour une analyse ultérieure. La figure 9 décrit l’utilisation de l’onglet « Opérations ».
    2. Effectuer une analyse de Guinier de l’exemple soustraite à la mémoire tampon de données à l’aide de l’onglet « Analyse » de la demande de « Analyse de données SAS ».
      1. N’oubliez pas que le bon fichier est sélectionné dans la liste, puis cliquez sur « Rayon de giration ». Une tentative automatisée pour effectuer un Guinier ajustement est fournie en cliquant sur le bouton « Autorg ».
      2. Élargir l’éventail des données utilisées pour inclure toutes les données de la basse-Q et commencer à réduire la plage de données en enlevant des points de Q-haut jusqu'à la Qmax * Rg limite est inférieure à 1,3. L’intrigue des résidus permet de vérifier que les données soient linéaires dans la gamme d’ajustement. La Guinier fit donne un approximatif Rg et j’ai0 pour les particules de diffusion.
      3. Faire de petits ajustements à la région fit et surveiller la sensibilité de ces valeurs à l’éventail des données utilisées pour l’ajustement. Figure 10 a illustre l’utilisation de l’outil « Rayon de giration ».
  4. Obtenir la fonction de distribution de probabilité (P(r)) en GNOM. 73 le fichier de sortie généré ici servira comme entrée pour l' ab initio processus de modélisation.
    1. Démarrer l’Assistant Distribution de Distance dans l’onglet « Analyse » obtenir un bon ajustement aux données est essentielle à l’obtention d’un modèle de qualité. Pour plus d’informations sur l’obtention des ajustements précis, veuillez consulter la revue74 par Putnam, et al.
      NOTE: GNOM le programme fournit des informations supplémentaires sur l’ajustement au-delà de l’Assistant Distribution de Distance. Figure 10 b illustre l’utilisation correcte de l’outil « Distance Distribution », et la Figure 11 illustre certaines erreurs communes rencontrées.
    2. Dmax, de déterminer la distance interatomique maximale au sein de la molécule.
      1. Estimer une valeur pour Dmax en décochant la case pour forcer Rmax = 0 et en entrant une valeur élevée pour Dmax (150 Å, par exemple). Le premier x-intercept dans la parcelle de p (r) donne cette estimation.
      2. Faire les modifications incrémentielles apportées à cette valeur Dmax et la plage des données utilisées ou le nombre de points utilisés dans l’ajustement pour optimiser le GNOM correspondent à des données et la courbe p (r).
    3. Continuer à affiner l’ajustement GNOM et enregistrer les fichiers de sortie GNOM avec bons paramètres ajustement pour les ab initio étapes de modélisation.
  5. Simuler SANS profils de modèles d’APB haute résolution en utilisant le programme CRYSON. 75
    1. Ouvrez le programme et choisissez l’option "0". Sélectionnez le nom de fichier PDB dans le navigateur de fichiers de popup. Appuyez sur entrée pour accepter les paramètres par défaut, sauf en spécifiant la chaîne deutération fractions et la fraction de D2O dans le solvant pour obtenir les paramètres de contraste adéquat.
    2. Ajuster le modèle à un ensemble de données expérimental en entrant « Y » et sélectionner le fichier de données dans l’Explorateur de fichiers de popup. Acceptez les valeurs par défaut restants, et les fichiers de sortie seront écrite dans l’emplacement du fichier PDB. Le fichier « .fit » contient des informations pour le profil de dispersion estimée du modèle 3D haute résolution.

7. créer des modèles de calculs Ab Initio de la SANS données.

Remarque: DAMMIF76 et77 au sein de la suite logicielle ATSAS de DAMMIN est utilisé pour reconstruire des modèles de l’atome factice (barrages) en utilisant un procédé de recuit simulé de la GNOM sortie, qui contient des données de p (r) ou des informations sur la probabilité ou fréquence des distances interatomiques dans la particule de diffusion. Ces programmes peuvent être exécutés en mode batch ou sur le serveur web ATSAS-Online.

  1. Lancez l’Assistant de forme PRIMUS depuis le bouton « Dammif » dans l’onglet « Analyse » « SAS d’analyse des données » et utiliser une sélection manuelle des paramètres. L’entrée de l’Assistant est illustrée à la Figure 12.
    1. Définir la plage de Guinier de la fit (étape 6.3.2) et passer à l’étape suivante en utilisant les boutons de navigation. Définir les valeurs fit de l’intrigue de p (r) (étape 6,4) et passez à l’étape suivante.
    2. Fournir des paramètres pour les ab initio processus de modélisation. Entrez un préfixe pour les noms de sortie de modèle (par exemple, SANSEnvelope), choisissez soit modélisation mode « rapide » ou « lent », entrez une valeur pour le nombre de modèles (17 suggérés de signification statistique), sélectionnez une des options offertes pour la symétrie de la particule, anisométrie et échelle angulaire (s’il est connu). Assurez-vous que les cases sont vérifiées au moyen de modèles avec DAMAVER et affiner le modèle final avec DAMMIN.
    3. Lancez le processus en utilisant le bouton « valider ». Une fois le processus terminé, afficher et enregistrer le répertoire de travail.
      Remarque: le processus de modélisation typique pour un single, petite protéine peut prendre jusqu'à quelques heures avec un micro-ordinateur typique. Les fichiers sont stockés dans des répertoires temporaires avant l’enregistrement.
  2. Superposition et superposer la finale SANS enveloppe avec un modèle haute résolution associé à l’aide de SUPCOMB dans ATSAS. Placez une copie du modèle APB haute résolution pour être en forme à l’enveloppe SANS dans le répertoire de travail. Exécutez SUPCOMB à partir de la ligne de commande en utilisant les noms de fichiers PDB comme deux arguments avec la structure du modèle citées en premier : $ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Remarque : Le deuxième nom de fichier répertorié est réécrits dans un nouveau fichier avec un « r » ajouté aux fin et avoir de nouvelles coordonnées pour superposition sur la structure du modèle.
  3. Visualiser les résultats du modèle ab initio utilisant PyMOL (pymol.org), un programme 3D graphiques moléculaires. Figure 13 donne un aperçu des opérations PyMOL.
    Remarque : Il y a des directives de publication pour la modélisation structurelle des données de petits angles de diffusion de molécules en solution. 78
    1. Lancez l’application PyMOL et ouvrir les fichiers .pdb correspondant à la 3D SANS enveloppe et la structure de haute résolution aligné à SUPCOMB pour être lus.
    2. Visualiser l’enveloppe SANS en représentant ce modèle comme une surface. Cliquez sur les "à côté de la modèle et sélectionnez le bouton ' Show : comme : Surface'.
    3. Visualiser la structure d’épine dorsale de protéine à haute résolution en représentant ce modèle comme une bande dessinée. Sélectionnez les ' situé à côté de ce modèle et sélectionnez ' afficher : comme : dessin animé '. Afficher la chaîne comme un arc-en-ciel de N - à extrémité C-terminale en cliquant sur le bouton « C » et "de la chaîne : 'Chainbows.
    4. Modifier la transparence de la représentation de surface pour plus de clarté. Dans la barre de menu « Réglage », sélectionnez "transparence » Surface » 40 %".
    5. Rendre le fond blanc et non opaques. Dans la barre de menu « Affichage », sélectionnez « arrière-plan »' et sélectionnez « Opaque » de décocher cette option et « Blancs » à l’occasion de cette couleur pour le fond.
      NOTE: opérations supplémentaires et les usages pour PyMOL peuvent être trouvés à PyMolWiki.org.

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Résultats

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Une proposition d’instrument et de temps de faisceau doit exprimer clairement toutes les informations nécessaires au Comité de surveillance ainsi qu’une évaluation valable de l’expérience proposée peut être faite. Communication avec un NSS est fortement recommandée pour les utilisateurs inexpérimentés. Le SNRS peut évaluer la faisabilité initiale et soumission de proposition de guide pour souligner la faisabilité, la sécurité et le potentiel de fort impact science. Les informations fourni...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chercheurs de biologie structurale tirer parti des techniques structurelles complémentaires comme solution de diffusion pour obtenir des détails biochimiques et structurales (tels que la taille globale et la forme) de molécules en solution. SANS est une technique particulièrement attractive pour la détermination des structures de faible résolution des protéines membranaires, un objectif de base de biochimie et de biologie structurale moderne. SANS nécessite des quantités de protéines purifiées comparables à ceux des essa...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss et Ryan C. Oliver sont transigés par l’entremise de UT-Battelle avec US DOE pour soutenir le programme d’utilisateur Science neutronique et Bio-SANS instrument à Oak Ridge National Laboratory utilisés dans cet Article.

Ce manuscrit a été co-écrit par UT-Battelle, LLC, sous contrat DE-AC05-00OR22725 avec le nous Department of Energy (DOE). Le gouvernement américain maintient et le serveur de publication, par l’acceptation de l’article pour publication, reconnaît que le gouvernement américain conserve une licence non exclusive, versée, irrévocable, mondiale, pour publier ou reproduire le formulaire publié de ce manuscrit ou d’autoriser d’autres de le faire, aux fins de le gouvernement américain. DOE fournira l’accès du public à ces résultats de recherche parrainé par le gouvernement fédéral conformément au Plan de l’accès Public DOE. 82

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’Office of Biological and Environmental Research appuyé la recherche au centre de ORNL pour biologie moléculaire structurale (CSMB) et Bio-SANS en utilisant les équipements pris en charge par le scientifique à la Division des installations, le Bureau des Sciences fondamentales de l’énergie, le département américain de l’énergie. Travaux structurels sur les protéines de la membrane dans le laboratoire de Lieberman a été soutenu par les NIH (DK091357, GM095638) et NSF (0845445).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Concentrateur Amicon Ultra MWCO 50KDa  ;Matériel de laboratoireEMD MilliporeUFC905096
Citrate d’ammonium dibasiqueFisher ScientificA663Matériau moyen
Sulfate d’ammoniumEMD Millipore2150Composant moyen
Bioflo 310 Système de bioréacteurEppendorfM1287-2110Équipement
Chlorure de calcium dihydratéAcros423525000composant moyen
CarbenicillineIBIIB02025antibiotique
ChloramphénicolEMD Millipore3130antibiotique
Chlorure de cobalt (II)AcrosAC21413-0050Composant moyen
Sulfate de cuivre (II)AcrosAC19771-1000  ;Composant moyen
Oxyde de deutériumSigma-Aldrich756822moyen
composant Purificateur de gaz de drieriteW.A. Hammond Drierite Co. Ltd.27068
EDTA, disodique, dihydratéEMD Millipore4010composant moyen
Emulsiflex-C3AvestinEF-C3équipement
et Auml ; purificateur kta UPC100GE Healthcare  ;équipement
GlycérolSigma-AldrichG5516moyen composant
HEPESSigma-AldrichH4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR colonneGE Healthcare  ;
ImidazoleVWR97064-622
IPTGTeknovaI3325
Chlorure de fer(III) hexahydratéMP Produits biochimiquesICN19404590composant moyen
LB Agar MillerFisher ScientificBP1425-2
Sulfate de magnésium heptahydratéVWR97062-134composant moyen
Sulfate de manganèse(II) monohydratéAcrosAC20590-5000moyen
MaxQ 6000 Agitateur incubé/réfrigéréThermo ScientificSHKE6000-7  ;équipement
n-Dodecyl-d25-&beta ;-D-maltopyranosideAnatraceD310T
n-Dodecyl-&beta ;-D-maltopyranosideAnatraceD310A
Phosphate de potassium monobasiqueVWR97062-346composant moyen
RC 6 Plus Centrifugeuse ThermoScientific Sorvall46910équipement
SIGMAFAST inhibiteur de protéase comprimés cocktails, Sans EDTASigma-AldrichS8830
Chlorure de sodiumSigma-AldrichS3014
Hydroxyde de sodiumSigma-Aldrich795429
Phosphate de sodium dibasiqueSigma-AldrichS7907Composant moyen
Filtre à seringue stérile de 25 mm avec 0,2µ ; m membrane PESVWR28145-501matériel de laboratoire
Filtre stérile jetable avec 0,2µ ; m membrane PESThermo Scientific596-4520  ;Matériel de laboratoire
Superdex 200 10/300 GL  ;GE Healthcare  ;
Superose-12 10/300 GL colonne  ;GE Healthcare  ;
densimètre Ultrospec 10 cellulesGE Healthcare  ;Equipement80211630
Sulfate de zinc monohydratéAcrosAC38980-2500  ;Composant moyen
17116701 composant 1751750117517301

Références

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