Production et la visualisation des sphéroplastes bactériennes et de protoplastes de caractériser Peptide antimicrobien localisation

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour produire des Gram négatif Escherichia coli (e.coli) sphéroplastes et Gram positif Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplastes pour visualiser clairement et rapidement caractériser interactions peptide-bactéries. Cela fournit une méthode systématique pour définir la membrane localisation et translocation des peptides.

Résumé

L’utilisation de la microscopie confocale comme une méthode pour évaluer les modèles de localisation de peptide au sein de bactéries est généralement inhibée par les limites de résolution des microscopes légers classiques. Comme la résolution d’un microscope donnée ne peut être facilement améliorée, nous présentons des protocoles afin de transformer le petit bâtonnet Gram-négatif Escherichia coli (e. coli) et Gram-positives Bacillus megaterium (b. megaterium) en plus, facilement imagés des formes sphériques appellent sphéroplastes ou protoplastes. Cette transformation permet aux observateurs de rapidement et clairement déterminer si les peptides se loger dans la membrane bactérienne (c.-à-d., localisation de membrane) ou traversent la membrane pour entrer dans la cellule (c.-à-d., translocation). Avec cette approche, nous présentons aussi une méthode systématique pour caractériser les peptides comme membrane de localisation ou de translocation. Bien que cette méthode peut être utilisée pour une variété de peptides actifs membrane et souches bactériennes, nous démontrent l’utilité de ce protocole en observant l’interaction de Buforin II P11A (BF2 P11A), un peptide antimicrobien (AMP), à e. coli sphéroplastes et b. megaterium protoplastes.

Introduction

Peptides antimicrobiens (ampères) ont attiré l’attention en raison de leur utilisation potentielle comme alternatives aux antibiotiques conventionnels^1,2,3,4,5. Ampères tuent les bactéries soit translocation à travers la membrane cellulaire et en interaction avec des composants intracellulaires tels que les acides nucléiques ou de perméabiliser la membrane provoquer des fuites de cellule contenu⁶. Outre leur utilisation comme les antibiotiques, les ampère....

Protocole

1. préparation de la solution

NOTE : Préparer des solutions décrites aux étapes 1,1 et 1,9 et 1,8 – 1.11 afin de produire des sphéroplastes d’e. coli et b. megaterium protoplastes, respectivement.

1. Préparer 1 M Tris-Cl, pH 7,8 en dissolvant 10,34 Tris HCl et 4,17 g de Tris OH dans 50 mL de dH₂O dans un flacon de 125 mL. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané et stocker dans un tube conique à température ambiante.
2. Préparer la solution A (20 mM MgCl₂, 0,7 M de sucrose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) en dissolvant 0,10 g MgCl₂ (95,2 g/mol)....

Résultats

En agrandissant les bactéries et en les rendant sphérique, nous pouvons facilement distinguer peptides localiser à la membrane bactérienne ou déplacer facilement à travers la membrane bactérienne. Les limites de résolution des microscopes lumière conventionnelles rendent difficile de distinguer si les peptides signaux proviennent de la membrane ou l’espace intracellulaire chez les bactéries normales parce que les signaux localisées dans la membrane seront semblent se chevaucher avec la es.......

Discussion

Les protocoles présentés ici rendent possible pour les chercheurs d’obtenir plus rapidement grandes tailles d’échantillon d’images bactériennes parce que les bactéries sphériques, élargies sont beaucoup plus faciles à repérer, orienter et l’image. Cette capacité accrue pour recueillir des données est utile à plusieurs égards. Tout d’abord, elle permet une analyse quantitative plus systématique des schémas de localisation de peptide. Alors que les tendances qualitatives peuvent démontrer de plus petits ensembles d’images,.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Hydrocloride de Trizma (Tris HCl)	Sigma	T3253
Base Trizma (Tris OH)	Sigma	T1503
Chlorure de magnésium	Sigma	M8266
Saccharose	Sigma	S7903
Lysozyme	Sigma	L6876
Déoxyribonucléase I	Sigma	D4527
Acide éthylènediaminetétraacétique	Sigma	106361	Sigma utilisé 106361 dans le développement du protocole original ; 106361 abandonné avec ED2SS en remplacement
l’hydrate de céphalexine	Sigma	C4895
Ampicilline	Fisher Scientific	BP1760
BBL Trypticase bouillon de soja	Fisher Scientific	B11768
BF2 P11A FITC	NeoScientific	Commandé
di-8-ANEPPS	Biotium	61012
DMSO	Sigma	34869	Utilisé Sigma D8779 dans le développement du protocole d’origine ; D8779 abandonné avec 34869 en remplacement de
l’acide maléique	Sigma	M0375
Acrodisc 25 mm Filtre seringue avec 0,2 &mu ; m HT Tuffryn Membrane	Pall Corporation	4192
Microscope confocal à balayage laser	Leica Microsystems	TCS SP5 II	Pour l’acquisition d’images
Leica Application Suite, Advanced Fluorescence	Leica Microsystems		Pour le traitement d’images