Protocole facile pour la synthèse d’auto-assemblage axée sur les polyamines peptides Amphiphiles (AAE) et des biomatériaux

Summary

La synthèse de peptide axée sur les polyamines amphiphiles (AAE) est un défi significatif en raison de la présence de plusieurs atomes d’azote aminé, qui nécessite une utilisation judicieuse de la protection des groupes afin de masquer ces fonctionnalités réactives. Dans cet article, nous décrivons une méthode facile pour la préparation de ces nouvelle classe de molécules d’auto-assemblage.

Abstract

Axée sur les polyamines peptides Amphiphiles (AAE) sont une nouvelle classe d’auto-assemblage amphiphiles biomatériaux liées aux peptides amphiphiles (Fe). PAs traditionnels possèdent des acides aminés chargés comme des groupes (lysine, arginine), qui sont directement reliés à un segment de lipides ou peuvent contenir une région d’éditeur de liens faite des acides aminés neutres de solubilisation. Réglage de la séquence peptidique de PAs peut produire diverses morphologies. De même, l’AAE possède un segment hydrophobe et acides aminés neutres, mais contiennent aussi des molécules de polyamines comme l’eau (hydrophiles) groupes de solubilisation. Comme c’est le cas avec un FE, AAE peut également s’auto-assembler en diverses morphologies, y compris les petites tiges, nano-rubans torsadés et fondus nano-feuilles, dissous dans l’eau. Toutefois, la présence d’amines primaires et secondaires sur une molécule unique polyamine pose un défi de taille quand synthèse AAE. Dans cet article, nous montrons un protocole simple, basé sur des précédents de littérature, d’atteindre une synthèse facile des AAE à l’aide de la synthèse des peptides en phase solide (SPPS). Ce protocole peut être étendu à la synthèse de PAs et autres systèmes similaires. Nous illustrons également les mesures qui sont nécessaires pour le clivage de la résine, l’identification et la purification.

Introduction

Auto-assemblage peptides amphiphiles (PAs) sont une classe des biomatériaux se compose habituellement des segments suivants : tête a hydrophile, région de l’éditeur de liens (b) et queue c hydrophobe. La plupart PAs décrits dans la littérature possèdent une tête hydrophile constitué de résidus d’acides aminés polaires ou chargées^1,2,3,4. PAs ont trouvé un large éventail d’applications en biomédecine, y compris la délivrance de médicaments, diagnostic de la maladie, médecine régénérative, etc.⁵. Selon leur ordre d’acide aminé, PAs peut former une grande variété de nanostructures, y compris les micelles sphériques et nano-les filaments. Nous avons récemment rapporté une catégorie d’hybride axée sur les polyamines peptides amphiphiles, appelé PPAs⁶. Les morphologies, cinétique de l’auto-assemblage et dégradation métabolique, de ces biomatériaux, trouvées liées à leur solubilisation groupe de tête. En outre, les nanostructures PPA ne présentent pas de toxicité vers les cellules de mammifères (lignes MiaPaCa2 et des cellules HeLa) aux concentrations testées. Nanocarriers axée sur les PPA sont vecteurs de drogue attrayante parce que : (1) polyamine absorption et le métabolisme a été démontré pour être augmentés dans les cellules cancéreuses, nanostructures (2) cationiques peut atteindre endosomale évasion^7,8, ce qui conduit à plus de circulation et de résidence au sein d’une cellule et (3), ils doivent avoir un profil métabolique distinct par rapport à la PA ; par exemple, ils seront plus stables vers protéases trouvés dans le corps humain (bien qu’ils peut-être sensible aux autres enzymes, telles que des oxydases amine)^9,10. En outre, AAE ont ont des morphologies diverses, propriétés physico-chimiques, rigidité des nanoparticules et cinétique Assemblée selon la longueur et la charge individuelle PPA molécule⁶. Ici, les auteurs décrivent un protocole détaillé pour la synthèse, l’identification et la purification de l’AAE qui peut également être appliquée à la préparation des PAs ou des molécules peptidiques hybrides similaires.

Car polyamines ne sont pas couramment disponibles dans le commerce dans leurs formes protégées, et protégeant les amines primaires et secondaires des polyamines est d’une importance capitale pour leur conjugaison avec les acides aminés et d’autres molécules, que nous présentons le étapes pour obtenir leur protection. L’objectif général du présent protocole est de fournir une méthode simple pour la conjugaison des polyamines aux acides aminés. Polyamines manquent un groupe carboxylique ; ainsi, ils ne peuvent pas être couplés au patinoire Amide ou résines Wang. Au lieu de cela, résines comme le chlorure de 2-chlorotrityl sont recommandés pour le protocole synthétique. Le principal défi pour la synthèse de la PPA est la présence de groupements fonctionnels des amines primaires et secondaires. Pour nos besoins, nous avons protégé tous les amines secondaires dans les polyamines tout en gardant le groupement aminé primaire sur les polyamines libre pour permettre la réaction de couplage. La réaction a été faite sur un support solide, suivant les principes de la synthèse de peptide de phase solide (RCR) pour faciliter la marche à suivre après chaque étape de l’accouplement et la déprotection. Le protocole suivant est pour les deux la synthèse manuelle et automatisée des AAE (bien que la vérification de certaines étapes sera difficile dans un système automatisé). La synthèse de ces molécules peut aussi se faire sur un synthétiseur automatisé ou à l’aide d’un réacteur de micro-ondes (automatisés ou semi-automatisés). Le schéma réactionnel a été résumé dans la Figure 1.

Figure 1 : (A) A schéma de réaction générale pour la synthèse de l’AAE. (B) les polyamines représentatif qui peuvent être utilisés pour synthétisé AAE décrite ici. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocol

1. Généralités protocole pour la synthèse des AAE

1. Calculer l’échelle de synthèse (habituellement mmol). Cette échelle est basée sur la masse de la quantité de PPA de cible. N’oubliez pas que l’efficacité de la réaction de RCR diminue graduellement avec une augmentation de la séquence d’acides aminés. Par conséquent, l’efficacité de la réaction exacte est difficile à calculer.
2. Calculer le poids de la résine à utiliser en fonction du chargement de la résine. Le chargement est trouvé sur le conteneur ou le protocole d’analyse de la résine et exprimé en mmol/g. La formule suivante peut être utilisée pour calculer le poids de la résine :
3. Peser avec soin, résine de chlorure de 2-chlorotrityl (dans notre cas, le chargement est ~0.85 mmol)
4. Placer la résine dans un récipient de synthèse fritté avec les caractéristiques suivantes : contenance – 50 mL, Disc fritte – 25 mm, porosité moyenne.
5. Ajouter 15 mL de dichlorométhane (DCM) à la résine.
6. Apposer le navire de la synthèse d’un agitateur mécanique à vitesse variable (flacon shaker/agitateur) et tourner les navires jusqu'à un angle de 45° (ou horizontalement) afin de maximiser l’agitation.
7. Laisser les billes de résine à gonfler pendant 15 min. enflure améliore le rendement de la réaction car elle facilite la diffusion moléculaire et l’accessibilité au site actif, améliorer l’efficacité de couplage.
8. Ajouter 8 équivalents (2 mmol pour échelle 0,25 mmol) de la polyamine désiré (Spermine, Spermidine, Diethyelenetriamine, 1, 3-diaminopropane, etc.) à la résine et laisser réagir pendant 5 h.
   Remarque : Une moindre durée de réaction serait réduire le rendement.
9. Un Kaiser tester (voir Table des matières) pour confirmer le couplage réussi de la polyamine à la résine. Le couplage réussi des amines primaires donne une couleur bleu/violet, ce qui correspond à l’amine libre.
10. Protéger le groupe amine primaire à l’aide de 4 équivalents de 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde), dissous dans le méthanol anhydre (15 mL), en agitant le mélange de réaction pendant la nuit¹¹.
    Remarque : Un moindre temps de réaction réduit le rendement.
11. Effectuer un test de Kaiser. Une absence de couleur bleue de la bille de résine confirme protection réussie. En cas de protection infructueuse de l’amine primaire, répétez l’étape précédente.
12. Égoutter le DCM et nettoyer les résines deux fois avec un mélange de DCM et DMF (2:1, 15 mL).
13. Dissoudre 20 équivalents (5 mmol) de di-tert butyl di-carbonate (Boc) dans du DCM (20 mL) et permettre la réaction de procéder pendant 3 h.
14. Faire un chloranile tester (voir Table des matières) pour confirmer une protection complète de l’amine secondaire. Un test positif (protection) donne une couleur jaune sans couleur ou lumière. Amines secondaires gratuits donnent vert/bleu foncé, tandis que les amines primaires donnent une couleur rouge.
15. Égoutter le mélange de solvant et laver deux fois avec un mélange de DCM et DMF (2:1, 15 mL).
16. Ajouter une solution de 2 % d’hydrazine dans le DMF (10 mL) et agiter pendant 1 h.
17. Un Kaiser test pour confirmer la déprotection réussie de l’amine primaire.
18. Ajouter les acides aminés désirées dans l’ordre inverse dans lequel vous serait écrire/dessiner eux. Les peptides sont attirés par les extrémités C terminales du termini N mais sont synthétisées dans la direction opposée, C n. Par exemple, pour un PPA nécessitant le peptide suivant core - GLFD-, ajouter de l’acide aspartique (D), suivie de la phénylalanine (F), Leucine (L) et enfin de Glycine (G).
    Remarque : Pour la plupart des acides aminés, le cocktail de couplage suivant est approprié pour la fixation sur les résines polyamine chargé.
    1. Mélanger 4 équivalents (1 mmol) de l’acide aminé Fmoc-protégé, 3,95 équivalents de 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) et 15 équivalents d’amine diisopropylethyl (DIPEA).
    2. Dissoudre dans un mélange de DCM et DMF (1:1, 15 mL) et laisser agir le cocktail pendant 2 minutes (jusqu'à dissolution complète).
    3. Attendre une supplémentaire de 3 – 5 min pour s’assurer de l’activation de l’acide carboxylique sur l’acide aminé.
    4. Ajouter le mélange réactionnel au navire. Effectuer la réaction pour 2-4 h à température ambiante.
       NOTE : Nous avons trouvé ce qui suit comme solution de rechange efficace à HBTU (nécessitant habituellement des quantités plus faibles d’acides aminés et l’agent de couplage) : COMU, PyBOP, HATU, DIC/Oxima.
    5. Un Kaiser test pour confirmer le couplage réussi.
    6. -Protéger le Fmoc-groupe de l’acide aminé en ajoutant une solution de 20 % de méthyl-4 pipéridine (10 mL) dans le DMF. Le faire deux fois, chaque fois que secouer le mélange réactionnel pendant 15 min.
       NOTE : Une alternative efficace pour l’enlèvement du Fmoc est pipérazine/DBU¹².
       1. Effectuer un lavage de DCM (15 mL) entre les ajouts.
    7. Un Kaiser test pour confirmer le succès la protection de l’acide aminé.
    8. Laver la résine soigneusement pour éliminer toute trace du 4-méthyl. Laver la résine deux fois avec DMF (10 mL), chaque lavage dure pendant 5 min et enfin avec du DCM (10 mL) pendant 10 min.
    9. Ajouter tous les autres acides aminés en répétant successivement le couplage et la protection des mesures.
19. Enfin, après tous les acides aminés requis de couplage, conjuguer la queue hydrophobe pour le dernier acide aminé de la construction de la polyamine-peptide :
    1. Ajouter 10 équivalents de la fonctionnalité désirée d’acide carboxylique à 9,5 équivalents de HBTU et 12 équivalents de DIPEA dissous dans DCM et DMF en mélange (1:1, 20 mL).
       Remarque : Gardez à l’esprit que certaines queues peut avoir besoin d’une proportion différente de solvant (généralement un plus grand % de DCM), l’addition ou un autre solvant comme la N-méthylpyrrolidone (NMP).
    2. Laisser agir le cocktail pendant 5 – 10 min jusqu'à dissolution (nous avons vu cela prend plus longtemps pour la queue jusqu'à dissolution complète) et ajouter au navire.
       Remarque : Pour queues contenant plusieurs sites réactifs, ils devront être protégés avant leur couplage.
    3. Effectuer cette réaction (couplage la queue hydrophobe) pendant au moins 5 h, mais il est conseillé de le réaliser pendant la nuit pour le rendement le plus élevé.

2. PPA clivage de Support solide

L’objectif de cette étape est le clivage de la LPP de la résine et de supprimer les groupes protecteurs Boc par les acides aminés et les résidus de la polyamine.

1. Laver la résine avec DMF (8 mL pour 2 min) et deux fois avec du DCM (8 mL, chaque fois pendant 5 min). Avant chaque ajout, videz le solvant du navire. Une fois que s’effectue le dernier lavage, sécher la résine sous vide pendant 15 min.
2. Préparer la solution de clivage en utilisant le ratio de mélange suivant : 28:1:1 l’acide trifluoroacétique (TFA) : H₂O : Triisopropyl silane (TIPS). Pour réserver 15 mL du clivage cocktail ajouter 14 mL de TFA, à 0,5 mL de H₂O et 0,5 mL de conseils.
3. Ajouter cette solution de clivage à la résine et agiter pendant 2 à 4 heures à température ambiante.
4. Recueillir la solution dans un 25 ou 50 mL de ballon.
5. Concentrer l’AGT dans l’abstrait à 1 – 2 mL à l’aide d’un évaporateur rotatif à pression réduite tout en chauffant le mélange à 40 ° C (ne pas dépasser 55 ° C pour éviter la décomposition de la LPP).
6. Après évaporation, ajouter la solution obtenue de la TFA (goutte) d’un ballon à fond rond contenant de l’éther anhydre froid (15 mL). Ceci va précipiter immédiatement de la PPA.
7. En outre, ajouter éther anhydre de froid (5 mL) dans le ballon original où l’AGT était concentrée.
8. Laisser agir cette fiole pour récupérer les plus solides et se combinent avec la solution d’éther de l’étape 2.6.
   Remarque : La pipette de transfert peut être lavée avec un petit volume de DCM. Éviter d’introduire des DMF pendant le processus, car il a tendance à former une substance gélatineuse.
9. Placer la fiole (couverte) à l’intérieur du réfrigérateur et laissez-le reposer pendant la nuit afin de maximiser les précipitations.
10. Rassemble le matériel précipité par une filtration sous vide à l’aide d’un entonnoir de filtre fritté. La taille des pores idéal est fines ou moyennes.
11. Laver le précipité deux fois avec de l’éther froid (5 à 10 mL) pour éliminer les matières organiques résiduelles.

3. identification du produit brut en utilisant la méthode de séché-goutte MALDI

1. Préparation de matrice pour l’analyse en mode positif :
   1. Pour démarrer l’analyse du poids moléculaire par spectrométrie de masse de désorption-ionisation de Laser assistée par matrice (MALDI), ajouter 10 à 20 mg d’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique dans un tube de microcentrifuge.
   2. Ajouter une solution d’eau/acétonitrile (1:1, 1,0 mL) avec 0,1 % d’acide trifluoroacétique (TFA). Homogénéiser au vortex.
      Remarque : Cette matrice doit servir pour les peptides chargés positivement. Mode négatif MALDI est semblable mais nécessite une matrice contenant 9-aminoacridine avec 0,1 % d’ammoniaque comme additif de solvant.
   3. Ajoutez 1-2 µL de l’échantillon à la plaque cible inox pour MALDI et sécher l’échantillon dans l’air. Ajouter 1-2 µL de la matrice et faites-le sécher à nouveau.
      Remarque : Les plaques ont quadrillé le long de la plaque cible pour aider à localiser l’endroit particulier circulaires marquages.
2. Analyse des échantillons en instrument MALDI à vérifier leur identité. Ionisation par électrospray (ESI) est une alternative valable pour confirmer l’identité de l’AAE.

4. la purification des AAE à l’aide de Purification préparatives phase inverse High-performance Liquid Chromatography (HPLC)

1. Dissoudre le précipité de PPA dans un minimum d’acétonitrile et l’eau.
   1. En règle générale, dissoudre 100 mg de sec brut LPP dans moins de 5 mL d’acétonitrile et l’eau. Plus hydrophobe AAE peut nécessiter un plus grand pourcentage d’acétonitrile pour dissoudre et peut également nécessiter un plus grand volume de solvant en général, selon la charge nette des AAE (tableau 1).
   2. Si une dissolution complète n’a pas eu lieu, ajouter 1 % TFA (ACN ou H₂O). Il est également possible d’ajouter des quantités infimes d’autres solvants compatibles, y compris le diméthylsulfoxyde, méthanol ou alcool isopropylique (limiter leur contenu à 5 %).

Solvant	AAE chargés positivement		Chargé négativement AAE
	0,1 TFA de % dans l’eau		0,1 % NH3 dans l’eau
	0,1 % TFA chez ACN		0,1 % NH3 chez ACN

Tableau 1 : systèmes de solvants. Proposé le système de solvant pour positivement et négativement chargé AAE.

2. Laisser agir la PPA en utilisant un sonicateur corne pendant 20 min à 10 s Pulse avec Amp1 de 48 %, ou pendant 2-3 h dans un bain à ultrasons.
3. Ensuite, filtrer à l’aide d’une seringue-filtre 0,45 µm suivi par filtration à l’aide d’une seringue-filtre 0,20 µm en polytétrafluoroéthylène (PTFE). La solution de PPA doit être claire et libre de toutes les matières particulaires.
   1. Si la filtration est trop difficile, laisser agir pendant une période prolongée de temps. Il est fortement conseillé que la solution de PPA est purifiée immédiatement après filtration de seringue, tel qu’un stockage prolongé pourrait amener à agréger ou gelate, qui nécessitera la sonication et, peut-être, de re-filtration.
4. Pendant et après la purification, utiliser des solvants HPLC grade ou ceux qui sont filtrés à travers un 0,25 μm seringue/membrane filtrante.
   Remarque : Les conditions solvants les plus courantes pour purifier les PPAs consistent en un gradient de H₂O et ACN.
5. Utiliser un instrument HPLC phase inverse standard pour ce protocole. Il doit comprendre un programmeur de gradient d’élution, un système binaire de solvant, un détecteur UV capable de détecter à 220 et 254 nm et un collecteur de fraction programmable. Le débit maximum devrait être de 50 mL/min.
6. Utiliser un C-18 inversé colonne en phase de séparation. Colonnes de dimensions suivantes peuvent être utilisées selon la masse de solide étant purifié et le filet frais de la LPP (tableau 2).

Charge de PPA	Taille des particules	Taille de colonne	Masse de LPP brut
+ ve chargées	5 μm	150 x 30 mm	170 mg
-ve chargées	5 μm	150 x 30 mm	170 mg
+ ve chargées	5 μm	150 x 21,2 mm	90 mg
-ve chargées	5 μm	150 x 21,2 mm	90 mg

Tableau 2 : a suggéré des colonnes : Dimensions de la colonne, la granulométrie et la capacité de charge maximale par injection pour C18 inverser les colonnes HPLC en phase

7. Injecter un volume déterminé par deux la capacité de la colonne, ainsi que par le volume de la boucle de l’injection de l’HPLC de PPA. Exécutez la méthode du gradient HPLC conformément aux paramètres dans le tableau 3 (temps d’élution de 40 min).

Temps	Solvant un (acétonitrile)	B de solvant (eau)	Débit (mL/min)
0	5 %	95 %	Vitesse d’écoulement dépend de sa taille et l’emballage de la colonne.
2	5 %	95 %
35	95 %	5 %
38	100 %	0 %
40	5 %	95 %

Tableau 3 : gradient suggéré : Gradient de phase inverse suggéré montrant la composition relative d’eau vs acétonitrile sur une période de temps. Le débit dépendra des spécifications de la colonne.

8. Analyser les fractions collectées sur les différents tubes à essai à l’aide de MALDI et déterminer quel tube (ou tubes) contient le PPA. Elle est évaluée en étudiant le poids moléculaire trouvé dans chaque tube.
   1. Vérifier la pureté des fractions sur une HPLC analytique. Utiliser un système HPLC-gradient équipé d’un détecteur UV à 220 nm.
   2. S’il y a des impuretés, faire un cycle supplémentaire de purification par HPLC. Dégradé ci-dessus utilisé pour HPLC préparative peut être réduit à utiliser avec l’HPLC analytique en utilisant le logiciel en ligne de conversion de colonne. Chaque fraction beaucoup être ≥ 95 % pur pour caractérisation physique ou évaluation biologique.
9. Recueillir les fractions dans un ballon de l’évaporation ou le grand ballon à fond rond et enlever tous l’acétonitrile et la plupart de l’eau. La solution finale de la PPA doit être pas plus de 10 mL.
10. Transférer ce concentré dans un tube à centrifuger 50 mL. Noter qu’AAE est des substances similaires à détergent ; ainsi, bulles seront générés au cours de l’évaporation du solvant. Nous avons trouvé que l’addition d’alcool éthylique diminue la formation de bulles.
11. Concentré sous vide le concentré. Lors de l’évaporation sous vide, une grande quantité de la PPA pourrait adhérer aux parois du récipient. Récupérer ce en rinçant à plusieurs reprises le mur de la fiole avec de l’eau par CLHP. Le volume combiné de l’app concentré et le rinçage doit être pas plus de 30 mL.
12. Placer la solution aqueuse à l’intérieur d’un tube de 50 mL.
13. Flash gel cette solution de PPA dans l’azote liquide :
    Remarque : Flash résultats congélation en petits cristaux de glace qui seront sublime rapidement dans le lyophilisateur. En outre, congélation lente peut permettre la formation de structures supramoléculaires auto-assemblés. Une autre alternative (mais moins désirables) est progressivement geler dans un congélateur à-80 ° C ou à geler à l’aide d’une glace sèche + mélange acétone
    1. Avant de placer le tube à centrifuger dans le lyophilisateur, perforer ou desserrer le bouchon du tube pour laisser l’humidité s’échapper de l’échantillon et se collecter dans l’unité de réfrigération. Régler l’unité de lyophilisation valeur-54 ° C et 0,016 mbar.
       Remarque : Une autre option est d’enlever le bouchon et placez un chiffon (avec une bande de caoutchouc) sur le dessus de l’ouverture. En outre, nous avons trouvé que la congélation des échantillons à un angle ou de briser la glace en petites portions permet une plus rapide et mieux lyophilisation en raison d’une augmentation de superficie.
    2. Si le solide commence à fondre, cela peut indiquer des traces d’un solvant organique (généralement l’acétonitrile) sont présents. Répétez l’étape congélation et évaluer l’état de lyophilisation.
    3. Si la fonte persiste, il y a deux solutions possibles :
       1. Split, l’échantillon en deux tranches (pour être placé dans des tubes), diluer avec de l’eau et congeler à nouveau. Ne pas utiliser cette solution souvent parce que les grandes quantités de solvants organiques pourraient endommager le matériel.
       2. Vous pouvez également placer l’échantillon dans une fiole et encore laisser évaporer le solvant organique sous vide. Déposer un échantillon qui est habituellement sous la forme liquide conduit à se cogner et perte de la concession de la PPA.

5. stockage des AAE

1. Stocker l’AAE dans un-20 ° C avec les bouchons serrés et collés avec du Parafilm sur un tube muni d’une étiquette appropriée.
2. Avant utilisation, ramener la PPA à température ambiante dans une chambre à vide pour éviter la condensation de vapeur d’eau sur l’AAE.

Results

Après la synthèse et purification et avant évaluation physico-chimiques ou biologique, il est recommandé des masses des AAE sont inspectés à nouveau et la pureté constatée par CLHP analytique. Pour la caractérisation des matériaux ou évaluation biologique, PPAs besoin d’avoir une pureté de > 95 %. La figure 2 montre la trace HPLC (en haut) et des spectres MALDI (en bas) confirmant la présence du produit. Systèmes d’analyse HPLC intégrera l’aire sous la cou...

Discussion

Les protocoles décrits ici peuvent être utilisés pour synthétiser les PPAs comme PAs de puits et des molécules peptidique (comme hybride PA-peptoids). Bien que la synthèse de peptides utilisant un RCR est une procédure simple et directe, la synthèse des peptides contenant des molécules biologiques de guidage peut être particulièrement difficile. Polyamines comme la spermine, spermidine, diethyelenetriamine, etc., peuvent fonctionner comme molécules autoguidage pour le ciblage de cellules de cancer du

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Résine de chlorure de 2-chlorotrityle  ;	AappTec	RTZ001
SynthwareTM récipient de synthèse  ;	Aldrich	SYNP120050M
Dichlorométhane	Acros	AC406920250	Fisher Sci. Catalogue #
Wrist Shaker	Boekel Scientific	401000-2
Kaiser test kit	Sigma-Aldrich	60017
2-[(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl-amino]-ethanol	Sigma-Aldrich	CDS004772
Méthanol anhydre	Acros	AC610981000	Fisher Sci. Catalogue #
Kit d’essai Chloranil	TCI	TCC1771-KIT	Catalogue VWR #
Di-tert di-carbonate de butyle  ;	Acros	AC194670250	Fisher Sci. Catalogue #
Dimethylformamide	Fisher Scientific	BP1160-4
Hydrazine	Acros	AC296815000	FIsher Sci. Catalogue #
(2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate)	p3biosystems	31001
4-méthyl pipéridine  ;	Acros	AC127515000	FIsher Sci. Catalogue #
Acide trifluoroacétique	AappTec	CXZ035
Triisopropyl Silane	Sigma-Aldrich	233781
Ether	Fisher Scientific	E138-1
&alpha ;-Cyano-4-hydroxycinnamic	acid Sigma-Aldrich	C8982
9-Aminoacridine	Sigma-Aldrich	92817
Fisherbrand  ; Filtres pour seringues : Membrane PTFE	Fisher Scientific	09-730-21