Tissu-spécifique miRNA, profilage de l’Expression à l’aide de la souris coeur Sections en hybridation in Situ

Summary

micro-ARN (miARN) est des séquences d’ARN courts et très homologues, agissant comme organismes de réglementation post-transcriptionnelle des ARN messagers (ARNm). Les méthodes actuelles de détection de miRNA varient dans la sensibilité et la spécificité. Les auteurs décrivent un protocole qui combine l’hybridation in situ et immunostaining pour la détection simultanée de miRNA et protéine molécules sur des sections de tissu cardiaque souris.

Abstract

micro-ARN (miARN) est des transcriptions d’ARN simple brin qui se lient à des ARN messagers (ARNm) et inhibent leur traduction ou promouvoir leur dégradation. A ce jour, les miARN ont été impliqués dans un grand nombre de processus biologiques et la maladie, qui a signifié la nécessité pour les méthodes de détection fiable des transcriptions de miRNA. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour digoxigénine marqués (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) miRNA basée sur sonde détection, combiné avec la protéine immunostaining sur des sections de coeur de souris. Tout d’abord, nous avons réalisé une technique hybridation in situ à l’aide de la sonde pour identifier l’expression miRNA-182 dans les sections de centre de contrôle et de la souris de l’hypertrophie cardiaque. Ensuite, nous avons effectué immunostaining cardiaque protéine troponine T (cTnT), sur les mêmes sections, de localiser co miRNA-182 avec les cellules cardiomyocytes. Utilisant ce protocole, nous avons pu détecter miRNA-182 à travers une phosphatase alcaline selon Dosage colorimétrique et cTnT par coloration fluorescente. Ce protocole peut être utilisé pour détecter l’expression de n’importe quel miRNA d’intérêt au moyen de sondes LNA creuser-étiqueté et expression de la protéine pertinentes sur des sections de tissu cardiaque souris.

Introduction

micro-ARN (miARN) est courts (18 – 25 nucléotides), ARN monocaténaire, non codantes qui fonctionnent comme des régulateurs négatifs de l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel à inhiber la traduction de l’ARN messager (ARNm) et/ou promotion de dégradation de l’ARNm ¹. miARN est transcrits d’introns ou des exons du codage ou non codantes des gènes et sont clivés dans le noyau par DROSHA, à précurseur miARN (pré-miARN), qui sont des structures de tige-boucle courte de 70 nucléotides². Suite cytoplasmique à l’exportation, les pré-miARN est transformés par DICER en miARN matures qui s’étendent sur 18 – 25 nuclé....

Protocol

Échantillons de tissu de coeur de souris pour cette étude ont été obtenus en conformité avec les lois et directives institutionnelles et ont été approuvés par le Comité d’utilisation et de Yale University Institutional Animal Care.

1. préparation de la solution

1. Préparer la RNase ddH gratuit₂O, en traitant les 5 L de ddH₂O 5 ml de diéthylpyrocarbonate de 0,1 % (DEPC) pendant la nuit (O/N), à température ambiante (RT). Autoclave (121 ° C) pour désactiver le CPDE. Utilisation traitée DEPC ddH₂O pour la préparation de solutions en aval comme indiqué.
   ATTENTION : DEPC est un cancérigène connu, seulem....

Results

hybridation de miRNA in situ a été optimisée sur des sections de coeur de souris à l’aide d’un scramble miRNA et U6-snRNA, qui ont servi de témoins positifs et négatifs respectivement. Une coloration positive est indiquée en bleu, tandis que la coloration négative est indiquée par le manque de développement de la couleur (Figure 1 a-1 b). Cardiomyocyte expression spécifique de miRNA-182 a été évaluée dans des sections de coeur de con.......

Discussion

détection de transcription de miRNA est possible par le biais de différentes techniques qui varient dans la sensibilité, de spécificité et de puissance quantitative. Ici, nous démontrons l’accouplement de miRNA hybridation in situ avec immunostaining et décrire un protocole qui permet pour évaluer les niveaux d’expression des molécules de miRNA et protéine, sur les mêmes sections de coeur simultanée. Tout d’abord, nous montrons comment faire une hybridation in situ de creuser-étiquetée LNA miRNA sondes .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diéthylpyrocarbonate	Sigma Aldrich	D5758	DEPC
Saline tamponnée au phosphate	Sigma Aldrich	P4417	PBS
Tween-20	Bioanalytical	AB02038	tensioactif non ionique
Histoclear	National Diagnostics	HS-200
Protéinase K, recombinante, PCR Grade	Sigma Aldrich	3115879001	ProK
Paraformaldéhyde	Sigma Aldrich	P6148	PFA
Chlorure de sodium	ThermoFisher	S271	NaCl
Chlorure de magnésium hexahydraté	ThermoFisher	M33	MgCl2
Tris	Sigma Aldrich	T6066
chlorhydrique, 1 N	ThermoFisher	SA48	HCl
Solution d’acide chlorhydrique, 12	N ThermoFisher	S25358	HCl
1-Methylimidazole	Sigma Aldrich	336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime ;-chlorhydrate d’éthylcarbodiimide	Sigma Aldrich	39391	EDC
Solution de peroxyde d’hydrogène H2O2	Sigma Aldrich	216763	H2O2
Citrate trisodique dihydraté	Sigma Aldrich	S1804	Citrate de sodium
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)	Qiagen	339450	scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY Sonde de détection	QIagen	YD00615701	5'-DIG et 3'-DIG marqué
Chlorhydrate de lévamisol	Sigma Aldrich	31742
Albumine sérique bovine	Sigma Aldrich	A9647	BSA
NBT/BCIP Comprimés	Sigma Aldrich	11697471001	NBT-BCIP
Chlorure de potassium	ThermoFisher	P217	KCl
DAPI solution (1mg/ml)	ThermoFisher	62248	DAPI
Lamelle en verre	ThermoFisher	12-545E	Couvre-objet en
verre Couvre-objet en plastique	Grace Bio-Labs	HS40 22mmX40mmX0.25mm	Couvercle en plastique sans RNA-ase
Anti-Digoxigénine-AP, Fab fragments	Sigma Aldrich	11093274910	Anticorps DIG
Stylo barrière hydrophobe	Vector Laboratories	H-4000	Stylo Pap
Anti-Cardiaque Troponine T Anticorps	Abcam	ab92546	cTnT
Anticorps secondaire à absorption croisée IgG (H+L) de chèvre, Alexa Fluor 568	ThermoFisher	A-11011	anticorps anti-lapin-568
Milieu de montage à fluorescence Dako		S3023	Sérum
mouton	Sigma Aldrich	S3772
Sérum de chèvre	Sigma Aldrich	G9023
Formamide désionisé	américain	bioanalyse AB00600
d’hybridation	ThermoFisher	UVP HB-1000 Hybridizer