Réversion chimique des cellules souches pluripotentes humaines classiques à un état semblable au naïf avec une puissance améliorée de différenciation multilignée

Tea Soon Park; Ludovic Zimmerlin; Rebecca Evans-Moses; Elias T. Zambidis

doi:10.3791/57921

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Article de méthode

Réversion chimique des cellules souches pluripotentes humaines classiques à un état semblable au naïf avec une puissance améliorée de différenciation multilignée

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DOI :

10.3791/57921

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10 juin 2018

Tea Soon Park^*¹ , Ludovic Zimmerlin^*¹ , Rebecca Evans-Moses¹ , Elias T. Zambidis¹

¹Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole pour la reversion chimique efficace, rapide et en vrac de classiques pluripotentes humaines lineage-amorcé des cellules souches (hPSC) dans un état de préimplantation épiblaste comme pluripotentes naïve epigenomically stable. Cette méthode se traduit par l’expression des gènes de lignée-amorcé une baisse et une amélioration marquée dans la différenciation multilignée dirigée à travers un vaste répertoire des lignes classiques hPSC.

Résumé

Naïve des cellules souches pluripotentes humaines (N-hPSC) avec une fonctionnalité améliorée peut avoir un large impact en médecine régénérative. Le but du présent protocole est revenir efficacement les cellules souches pluripotentes humaines lineage-amorcé, conventionnel (hPSC) maintenus sous conditions soit sans chargeur ou alimentation dépendant à une pluripotence naïve comme avec une fonctionnalité améliorée. Cette méthode de réversion naïf chimique emploie le facteur inhibiteur de leucémie classique (LIF), GSK3β et MEK/ERK inhibition cocktail (FRV-2i), additionné de seulement un inhibiteur de la tankyrase XAV939 (LIF-3i). FRV-3i revient hPSC traditionnelle à un état stable pluripotentes adoptant biochimiques, transcription et des fonctionnalités épigénétiques de l’épiblaste avant l’implantation humaine. Cette méthode de FRV-3i nécessite la manipulation de la culture de cellule minimale et est hautement reproductible dans un vaste répertoire de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et des lignées de cellules souches (hiPSC) exempt de transgene humaines pluripotentes induites. La méthode FRV-3i ne nécessite pas une ré-amorçage étape avant la différenciation ; N-hPSC peuvent être différenciés directement avec des rendements très élevés et de maintenir caryotypique et épigénomique stabilités (y compris aux imprimés loci). Afin d’accroître l’universalité de la méthode, hPSC classique sont tout d’abord cultivé dans le cocktail de FRV-3i additionné de deux autres petites molécules qui potentialisent la protéine kinase A (la forskoline) et sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) signalisation (FRV-5i). Cette brève étape adaptation de FRV-5i considérablement améliore l’expansion clonale initiale des hPSC classique et leur permet d’être naïf-revenue par la suite avec FRV-3i seul en grandes quantités, ce qui éviterait la cueillette/subcloning rare N-hPSC colonies plus tard. HPSCs LIF-5i-stabilisé sont maintenus par la suite en FRV-3i seuls sans avoir besoin de molécules anti-apoptotiques. Plus important encore, réversion FRV-3i améliore nettement la pluripotence fonctionnelle d’un vaste répertoire de classique hPSC en diminuant leur expression de gène lineage-amorcé et effacement de la variabilité de l’interligne de différenciation dirigée communément observé parmi les lignes de hPSC indépendants. Caractérisations représentatives de N-hPSC LIF-3i-revenue sont stratégies fournis et expérimentales pour les comparaisons fonctionnelles de hPSC isogénique dans lineage-amorcé vs. naïve comme États sont décrits.

Introduction

Le système de culture 2i (inhibiteur de la MEK/ERK et GSK3β) a été développé pour améliorer les cultures des cellules souches embryonnaires (mESC) hétérogènes axée sur le sérum de souris à un état fondamental uniform de pluripotence s’apparente à l’épiblaste préimplantatoire souris¹. Cependant, 2i ne supporte pas le maintien stable de pluripotentes humaines les cellules souches (hPSC) lignes². Les différents complexes petites molécules, additionné de facteur de croissance et les approches transgéniques ont récemment été rapportés pour capturer putativement similaires naïve comme pluripotentes moléculaire....