Article de méthode

Réversion chimique des cellules souches pluripotentes humaines classiques à un état semblable au naïf avec une puissance améliorée de différenciation multilignée

9.4K vues

⸱

DOI :

10.3791/57921

⸱

10 juin 2018

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole pour la reversion chimique efficace, rapide et en vrac de classiques pluripotentes humaines lineage-amorcé des cellules souches (hPSC) dans un état de préimplantation épiblaste comme pluripotentes naïve epigenomically stable. Cette méthode se traduit par l’expression des gènes de lignée-amorcé une baisse et une amélioration marquée dans la différenciation multilignée dirigée à travers un vaste répertoire des lignes classiques hPSC.

Résumé

Naïve des cellules souches pluripotentes humaines (N-hPSC) avec une fonctionnalité améliorée peut avoir un large impact en médecine régénérative. Le but du présent protocole est revenir efficacement les cellules souches pluripotentes humaines lineage-amorcé, conventionnel (hPSC) maintenus sous conditions soit sans chargeur ou alimentation dépendant à une pluripotence naïve comme avec une fonctionnalité améliorée. Cette méthode de réversion naïf chimique emploie le facteur inhibiteur de leucémie classique (LIF), GSK3β et MEK/ERK inhibition cocktail (FRV-2i), additionné de seulement un inhibiteur de la tankyrase XAV939 (LIF-3i). FRV-3i revient hPSC traditionnelle à un état stable pluripotentes adoptant biochimiques, transcription et des fonctionnalités épigénétiques de l’épiblaste avant l’implantation humaine. Cette méthode de FRV-3i nécessite la manipulation de la culture de cellule minimale et est hautement reproductible dans un vaste répertoire de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et des lignées de cellules souches (hiPSC) exempt de transgene humaines pluripotentes induites. La méthode FRV-3i ne nécessite pas une ré-amorçage étape avant la différenciation ; N-hPSC peuvent être différenciés directement avec des rendements très élevés et de maintenir caryotypique et épigénomique stabilités (y compris aux imprimés loci). Afin d’accroître l’universalité de la méthode, hPSC classique sont tout d’abord cultivé dans le cocktail de FRV-3i additionné de deux autres petites molécules qui potentialisent la protéine kinase A (la forskoline) et sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) signalisation (FRV-5i). Cette brève étape adaptation de FRV-5i considérablement améliore l’expansion clonale initiale des hPSC classique et leur permet d’être naïf-revenue par la suite avec FRV-3i seul en grandes quantités, ce qui éviterait la cueillette/subcloning rare N-hPSC colonies plus tard. HPSCs LIF-5i-stabilisé sont maintenus par la suite en FRV-3i seuls sans avoir besoin de molécules anti-apoptotiques. Plus important encore, réversion FRV-3i améliore nettement la pluripotence fonctionnelle d’un vaste répertoire de classique hPSC en diminuant leur expression de gène lineage-amorcé et effacement de la variabilité de l’interligne de différenciation dirigée communément observé parmi les lignes de hPSC indépendants. Caractérisations représentatives de N-hPSC LIF-3i-revenue sont stratégies fournis et expérimentales pour les comparaisons fonctionnelles de hPSC isogénique dans lineage-amorcé vs. naïve comme États sont décrits.

Introduction

Le système de culture 2i (inhibiteur de la MEK/ERK et GSK3β) a été développé pour améliorer les cultures des cellules souches embryonnaires (mESC) hétérogènes axée sur le sérum de souris à un état fondamental uniform de pluripotence s’apparente à l’épiblaste préimplantatoire souris1. Cependant, 2i ne supporte pas le maintien stable de pluripotentes humaines les cellules souches (hPSC) lignes2. Les différents complexes petites molécules, additionné de facteur de croissance et les approches transgéniques ont récemment été rapportés pour capturer putativement similaires naïve comme pluripotentes moléculaire indique2. Toutefois, nombre d’Etats « naïve-like » a aussi créés avec ces méthodes exposées caryotypique instabilité, épigénomique défauts (par exemple, la perte globale de l’empreinte génomique parentale) ou affaiblies potentiel de différenciation.

En contraste, le cocktail de triple inhibition chimique de GSK3β, ERK et signalisation de la tankyrase et facteur inhibiteur de leucémie (LIF-3i) était suffisant pour que la réversion naïve comme stable d’un vaste répertoire de classiques hPSC lignes3. FRV-3i-revenue naïve hPSC (N-hPSC) maintenu caryotypes normaux et ont augmenté leurs expressions de gènes de l’épiblaste préimplantatoire humaine naïve spécifiques (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). FRV-3i reversion conférée aussi hPSC avec un éventail de caractéristiques moléculaires et biochimiques particulières à la pluripotence mESC comme naïve qui inclus STAT3 phosphorylée de signalisation accrue, diminution de la phosphorylation de ERK, global 5-méthylcytosine CpG l’hypométhylation, déméthylation CpG génome dans les cellules souches embryonnaires (CSE)-promoteurs de gènes spécifiques et l’utilisation dominante de renforceur du OCT4 distale. Par ailleurs, en comparaison avec d’autre naïve des méthodes de réversion qui ont abouti à aberrantly hypométhylés imprimé locus génomiques, N-hPSC LIF-3i-revenue étaient dépourvues de perte systématique d’imprimés motifs CpG ou d’expression de l’ADN méthyltransférase (par exemple, DNMT3B DNMT1, DNMT3A,)3.

Une culture de FRV-3i directe d’un large éventail de classiques cellules de souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSC) cultivées sur des mangeoires ou des conditions E8 chargeur atteint retour rapide et en vrac à un État épiblaste naïf. Toutefois, direct FRV-3i naïf reversion peut être inefficace dans certaines lignées hPSC classiques instable en raison les variabilités de génomiques et de la lignée-amorcé inhérentes découlant issus des milieux donneur génétiquement diversifiés.

Ainsi, pour accroître l’utilité de la méthode FRV-3i, une optimisation progressive a été développée et est présentée ici, qui permet de réversion naïf universel avec presque n’importe quel CSEh classique ou libres transgène hiPSC ligne cultivées sur les mangeoires. Cette méthode de réversion naïf universalisé emploie une étape transitoire culture initiale en hPSC classique qui complètent le cocktail FRV-3i avec deux autres petites molécules (FRV-5i) qui potentialisent la protéine kinase A (la forskoline) et sonic hedgehog (sHH) ( signalisation de Purmorphamine). Un passage initial de hPSC classique en FRV-5i adapte à ultérieure stable FRV-3i réversion en grandes quantités. Adaptation de FRV-5i initiale augmente significativement la prolifération clonale initiale seule cellule des hPSC classique cultivée sur E8 ou mangeoires (avant leur adoption subséquente de stable et continue en FRV-3i seul). Lignes hPSC conventionnel adaptés tout d’abord à un passage en FRV-5i tolèrent subséquentes en vrac clonale passage des naïfs-revenue des cellules dans des conditions de FRV-3i, qui élimine la nécessité pour la récolte et subcloning de rares colonies stables, ou l’utilisation systématique de molécules anti-apoptotiques ou inhibiteurs de protéine associée à Rho kinase (ROCK).

La méthode FRV-3i a été avec succès employée stablement développer et maintenir un vaste répertoire de > 30 lignes hPSC classiques indépendants et génétiquement diversifiée pour > 10 – 30 passages à l’aide de deux méthodes de dissociation non enzymatique ou enzymatique, et sans preuve d’induction de chromosomiques ou d’anomalies épigénomique, y compris les anomalies à l’imprimé locus. En outre, séquentiel FRV-5i/FRV-3i culture est la méthode la réversion seule naïve qui a jusqu'à présent été signalée qui améliore la pluripotence fonctionnelle d’un vaste répertoire des lignes conventionnelles hPSC en diminuant leur expression de gène lineage-amorcé et considérablement améliorer leur potentiel de différenciation multipotentes. Le FRV-3i naïf reversion méthode efface l’inhérente interligne de variabilité de la différenciation des lignes conventionnelles, apprêtée à la lignée hPSC et aura une grande utilité de l’application en médecine régénératrice et de thérapies cellulaires.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Toutes les procédures d’animaux ont été effectuées conformément aux directives de protection des animaux et les protocoles approuvés par la Johns Hopkins School d’Institut de médecine de soins des animaux et le Comité d’utilisation (IACUC).

1. préparation de le fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) pour Feeder-dépendante conventionnel (CSEh moyen/MEF) ou naïf-rétabli (FRV-3i moyen/MEF) hPSC Culture

  1. Acheter ou préparer des fournitures de basse-passage internes de mangeoires MEF de CF1 ou CF1 x DR4 hybride E13.5 des embryons de souris suivant les protocoles publiés4.
    1. Cryopréserver des cultures MEF passage bas (p1-p2) avant (pour l’entreposage à long terme) ou après (pendant 6 mois) l’irradiation et le magasin dans l’azote liquide comme décrit plus haut4.
    2. Irradier (5 000 rad) en vrac MEF élargi sous p5 en utilisant un γ - ou X-ray-irradiateur et préparer des aliquotes à 1,5 x 106 cellules par flacon pour stockage de courte durée (moins de 6 mois) à-80 ° C dans un congélateur ultra basse température.
    3. Plaque entre 1,2 x 106 (fraîchement irradiés non cryoconservés) et 1,5 x 106 (irradié cryoconservés) MEF par une plaque de 6 puits gélatinisée pour la préparation des cultures de l’alimentation, comme décrit ci-dessous.
  2. Préparer enduit de gélatine 6 puits stériles imprégnées de culture tissulaire plaques en ajoutant 1,5 mL de solution stérile de gélatine 0,1 % à chaque puits dans une armoire de sécurité biologique.
  3. Enduit de gélatine incuber à 37 ° C pendant au moins 1 h ou toute la nuit dans une étuve de laboratoire CO2 .
  4. Le lendemain, décongeler le passage bas (p. ex., P2 à P4) cryoconservés DMSO et irradié (5 000 rad) MEF selon les étapes indiquées ci-dessous.
    Remarque : Non irradiées MEF devrait également être décongelé, élargi et irradié immédiatement avant son utilisation.
  5. Placer une aliquote MEF cryoconservée dans un bain-marie à 37 ° C. Après décongélation, stériliser le tube avec de l’éthanol et diluer immédiatement le cryoprotecteur DMSO au moins 10 fois avec moyen de force expéditionnaire des marines (tableau 1) au sein d’une cabinet de biosécurité (par exemple transfert 1 mL de DMSO-MEF aliquote dans 9 mL de milieu de force expéditionnaire des marines dans un stérile de 15 mL conique).
  6. Centrifuger les cellules de force expéditionnaire des marines dilués à 200 x g pendant 5 min en tube conique stérile de 15 mL.
  7. Dans une armoire de biosécurité, aspirer et jeter le surnageant acellulaire et Resuspendre le culot dans un milieu MEF frais 1 à 2 mL.
  8. Doucement, jeter la solution de gélatine et ajouter 2 mL de MEF remis en suspension dans le milieu MEF dans chaque puits d’une plaque de 6 puits gélatinisée, tel qu’indiqué ci-dessus. Cellules de numération MEF et plaque 1,2 x 106 (fraîchement irradiés non cryoconservés) ou 1,5 x 106 (irradié cryoconservés) MEF par une plaque gélatinisée 6 puits.
    Remarque : Toutes les plaques de culture cellulaire qui sont transférés de l’incubateur à CO2 à la biosécurité du cabinet peuvent être essuyées délicatement avec du papier arrosée à l’éthanol mais ne devraient pas être vaporisés directement sur avec la solution d’éthanol à 70 % pour éviter la diffusion de l’éthanol dans les puits.
  9. Incuber les plaques MEF à 37 ° C durant la nuit dans une étuve de laboratoire CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide) pour permettre la fixation, avant de les utiliser.

2. en vrac à la stabilisation des Cultures conventionnelles hPSC d’ultérieures Reversion naïf avec une étape d’Adaptation brève FRV-5i

  1. Valider toutes les lignes conventionnelles hPSC pour possession d’un caryotype normal par G-bande, avant le retour de début FRV-5i/FRV-3i.
    NOTE : Réversion FRV-3i des lignes haut-passage hPSC classiques (p. ex.., P > 40 – 50) doit être évitée, car ces cultures peuvent abriter déjà aberrations génomiques qui peuvent nuire aux stable, efficace et en vrac FRV-3i reversion d’amorcée, pistolets hPSC lignes.
  2. Maintenir et développer les cultures conventionnelles hPSC avec des caryotypes normaux validés dans un système de culture axée sur le MEF (tel que décrit dans la Section 1), ou d’un système de culture sans chargeur (selon la préférence de l’enquêteur).
    Remarque : Les deux chargeur dépendant hPSC/MEF cocultures (p. ex., CSEh moyen (tableau 1) additionné de 4 à 10 ng/mL bFGF) ou sans alimentation (e.g., E8 5 ou mTSER 6 médias (conformément aux instructions du fabricant sur méthodes de vitronectine enduit plaques) sont compatibles avec réversion de naïf en bloc en utilisant le système de FRV-5i/FRV-3i/MEF (Figure 1). Méthodes non enzymatiques sont préférés pour le passage des hPSC classique avant de les préparer à la réversion. Les formulations de médias FRV-5i et FRV-3i ne contiennent pas d’antibiotiques ou antifongiques. Règles de fonctionnement standard de stérilité armoire de biosécurité et d’entretien doivent être rigoureusement respectées pour éviter toute contamination bactérienne ou fongique.
  3. Pour le MEF-basé système de culture, préparer mangeoires MEF dans la plaque de 6 puits gélatinisée tel que décrit dans la Section 1 au moins un jour avant le passage des cultures FRV-5i-adaptées classiques hPSC.
  4. Après que les cultures conventionnelles hPSC ont atteint environ 50 % confluence (c.-à-d. 3-5 jours après l’ensemencement initial), remplacer le milieu de culture de CSEh standard avec support LIF-5i (2 mL par puits ; Le tableau 1).
    Remarque : Effectuez ces étapes dans une armoire de sécurité biologique.
  5. Culture et maintenir conventionnel hPSC/MEF pendant 2 jours en FRV-5i dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide). Changer le support LIF-5i quotidiennement afin des pour adapter pour leur adoption subséquente et la réversion stable en FRV-3i.
  6. Sinon, pour les cultures libres Chargeur conventionnels (p. ex., en E8), la culture hPSC en FRV-5i nuit seulement avant passage le lendemain matin.
    NOTE : Cultures FRV-5i et FRV-3i peuvent tous deux maintenus avec atmosphérique (21 % O2) ou physiologiques (5 % O2) oxygène niveaux dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide).
  7. Avant le passage, placer les plaques de culture dans une enceinte de sécurité biologique, laver hPSC classique FRV-5i-adapté une fois avec du PBS et ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire dans chaque puits. Incuber 5 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 et triturer doucement avec une pipette dans une suspension monocellulaire dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
    NOTE : Tampons de dissociation Non enzymatique peuvent aussi retenir pour la préparation de cellules individuelles pour le passage.
  8. Recueillir la suspension de cellules dans un milieu de CSEh (au moins 2 fois dilution) en un tube conique stérile de 15 mL et triturer doucement les cellules de pipetage pour obtenir une suspension monocellulaire.
  9. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min, aspirat/jeter le surnageant et Resuspendre le culot cellulaire en 1 à 2 mL de milieu FRV-5i dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou un compteur de cellule automatique.
  10. Laver la plaque MEF pré plaquée deux fois avec du PBS (2 mL par puits dans les plaques 6 puits) et distribuer 1 – 2 x 106 cellules (en moyenne 2 mL FRV-5i) sur 1 puits de la plaque de la MEF de PBS à la chaux.
  11. Ajuster et optimiser la densité des ensemencements initiaux pour chaque ligne de hPSC individuel à être naïf-inversée, comme peuvent l’efficacité peut être très variable. Placer la plaque dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide).
    Remarque : L’utilisation systématique des réactifs anti-apoptotiques n’est pas recommandée pour la plupart des lignes de hPSC avec cette méthode. Le système FRV-5i améliore déjà grandement l’efficacité re-électrodéposition clonale initiale en vrac des lignes classiques hPSC. Toutefois, une utilisation ponctuelle d’inhibiteur de ROCK (5 – 10 μM Y-27632) peut accroître l’efficacité de re-électrodéposition clonale initiale FRV-5i des cultures conventionnelles hPSC dans le premier passage pour certaines lignes instable hPSC lignée-amorcé avec la propension des spontanée différenciation.
  12. Si à partir de cultures sans conducteur (p. ex., E8), directement transférer un bien de la hPSC conventionnelle dissocié adapté en FRV-5i dans un irradié bien plaqué MEF (c.-à-d., passage de 1:1).
  13. Le lendemain, agiter doucement la plaque à lever toutes les cellules non inscrits, aspirer le milieu (lavage de PBS est facultatif) et les remplacer par 2 mL de milieu de FRV-5i. Effectuez cette étape dans une armoire par jour pendant 3 à 5 jours ou jusqu'à ce que les cellules sont confluents de 60 à 70 % (Figure 1) prévention des risques biotechnologiques. Placer la plaque dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide).

3. à long terme entretien et l’Expansion des N-hPSC dans un milieu FRV-3i

  1. Après la première adaptation de FRV-5i, le passage des cultures ultérieures de FRV-3i stables tous les 3 – 4 jours dans une placard de la biosécurité, ou lorsque les cultures deviennent confluente de 60 à 70 % (Figure 1).
    NOTE : FRV-3i cultures nécessitent un entretien rigoureux et permettant aux cultures de N-hPSC atteindre la densité de confluence/cellulaire élevée de culture prolongée (p. ex.., > 4 jours) diminue l’efficacité re-électrodéposition clonale subséquente et favorise la spontanée différenciation.
  2. Dans une armoire de biosécurité, jetez le milieu de culture et laver chaque puits de cultures FRV-5i/FRV-3i en ajoutant doucement 2 mL de PBS. Jeter les PBS et ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire. Incuber 5 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide).
  3. Recueillir la suspension cellulaire, ajouter CSEh moyen (sans inhibiteurs ou facteurs de croissance (tableau 1) ; dilution au moins 2 fois) pour récupérer tous les hPSC et triturer doucement les cellules de pipetage pour obtenir une suspension monocellulaire. Transférer la suspension dans un tube conique stérile de 15 mL.
  4. Centrifuger à 300 g pendant 5 min et aspirer/jeter le surnageant. Resuspendre le culot dans un milieu FRV-3i. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou un compteur de cellule automatique.
  5. Plaque ~ 2 x 105 cellules / puits sur le MEF irradié dans la plaque de 6 puits gélatinisée pour passage systématique des cultures FRV-3i. Pour les cultures initiales FRV-5i-adaptées, plaque une densité au départ plus élevée (4 x 105 cellules/puits) avant le premier passage en FRV-3i/MEF.
  6. Re-plaque et distribuer hPSC LIF-5i-adapté sur frais lavés à PBS irradiés MEF chargeur plaques (préparé la veille comme indiqué ci-dessus) dans le milieu du FRV-3i. Remplacer le support LIF-3i quotidiennement.
  7. Passage N-hPSC moins 4 – 7 continue en vrac des passages dans le FRV-3i moyen avant l’utilisation du N-hPSC dans des études fonctionnelles ou cryoconservation. Noter le nombre de passages de N-hPSC dans les deux classiques ou support LIF-3i.
    NOTE : Réversion FRV-3i haut-passage (p. ex. > p40) lignes conventionnelles, lignée-amorcé hPSC n’est pas recommandé. Un effort devrait être fait pour rétablir les lignes conventionnelles hPSC au plus bas passage possible qu’ils soient disponibles. En outre, l’utilisation de hPSC LIF-3i-revenue ayant subi un traitement supérieur à 10 passages FRV-3i n’est pas recommandée pour des études fonctionnelles, puisque ces cultures N-hPSC pourraient contenir de clones caryotype anormal en raison de la sélection de la culture de cellules clonales prolongée. Frais FRV-5i/FRV-3i réversions des lignes de basse-passage hPSC conventionnelle doivent être effectuées pour des études fonctionnelles, si les stocks de N-hPSC avec < 10 passages en FRV-3i ne sont pas disponibles.

4. cryoconservation et le dégel du FRV-3i-revenue N-hPSC

  1. Développez dévulcanisation N-hPSC au moins 5 à 7 passages en FRV-3i, comme indiqué plus haut, avant utilisation dans les études fonctionnelles ou cryoconservation à long terme. Noter le nombre de passages dans des conditions classiques et dans des conditions de FRV-3i sur chaque flacon cryopréservé.
    NOTE : Excès de FRV-3i-revenue N-hPSC ne pas utilisé pour des tests fonctionnels peuvent être cryoconservés à chaque passage, mais le gel des passages inférieurs de réversion après (par ex.., < p3) peut entraîner dans les pauvres ou très variable de récupération après décongélation.
  2. Dans une armoire de biosécurité, aspirer le milieu de culture, laver les cellules dans du PBS (2 mL / puits), aspirer les PBS et dissocier des colonies hPSC dans des cellules individuelles à l’aide de la solution de détachement cellulaire (1 mL / puits). Placer la plaque pendant 5 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide). Diluer la solution de détachement cellulaire avec le médium de FRV-3i (2 fois), recueillir des hPSC dans une conique stérile de 15 mL, centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min et Resuspendre le culot dans FRV-3i moyen (1 à 2 mL par puits-équivalent). Compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou un compteur de cellule automatique.
  3. Centrifuger le N-hPSC dans le milieu du FRV-3i (x 200 g pendant 5 min) et remettre en suspension les cellules dans une enceinte de sécurité biologique dans la solution de congélation (tableau 2), avec une densité d’au moins 1 x 106 cellules/mL.
  4. Cellules de transfert dans les tubes cryogéniques de stockage à long terme et placez dans un récipient de ralentir au point de congélation. Laisser les échantillons de geler pendant la nuit dans un congélateur à-80 ° C.
  5. Le lendemain, transvaser le cryovials dans un congélateur d’azote liquide pour le stockage à long terme.
  6. Pour la décongélation, placez la cuvette congelée dans un bain d’eau de 37 ° C pendant environ 2 min. stériliser le flacon (c.-à-d., pulvérisation d’éthanol), transfert de hPSC à une conique stérile de 15 mL et diluer lentement le milieu de CSEh en 10 fois plus de cellules (tableau 1) additionné de 5 μM de Protéine associée à Rho (ROCK) inhibiteur de la kinase Y-27632 dans une hotte de sécurité biologique stérile du cabinet.
  7. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min. Dans une armoire de biosécurité, jetez acellulaire surnageant et Resuspendre le culot dans FRV-3i additionné (1 à 2 mL) inhibiteur de ROCK 5 μM Y-27632.
    Remarque : Exclusion de Y-27632 donne mauvaise efficacité de récupération après décongélation (Figure 2).
  8. Transférer les cellules dégelées resuspendues dans le FRV-3i/ROCK inhibiteur sur les puits de PBS-lavé MEF-plaqué. Cryoconservé FRV-3i cultures à une densité de 1 x 106 cellules par flacon. Chacun de ces flacons sur les mangeoires dans un puits d’une plaque de 6 puits gélatinisé décongeler.
  9. Le lendemain, commencer régulièrement FRV-3i foisonnement moyen sans inhibiteur de la kinase Rho.

5. chargeur suppression pour la collecte d’échantillons de N-hPSC

  1. Pour préparer des cultures d’échantillons de FRV-3i/MEF (ou CSEh/MEF conventionnelle) (c'est-à-dire, pour l’expression des gènes (p. ex., RT-PCR quantitative, microarrays) ou des analyses de protéines (p. ex., Western blot), appauvrissent FRV-3i cultures de mangeoires MEF à l’aide Magnétique activé cellule Tri (MACS) avec un anticorps anti-TRA-1-81 enduit microbilles selon le protocole du fabricant.
  2. Vous pouvez également utiliser la méthode suivante d’électrodéposition avant simple pour épuiser les cultures des mangeoires, tel que décrit ci-dessous.
  3. Sous une hotte de sécurité biologique stérile du cabinet, jeter le surnageant acellulaire, laver le culot avec 2 mL de PBS stérile par puits. Détacher les cultures de FRV-3i/MEF adhérentes à l’aide de la solution de détachement cellulaire (1 mL/puits). Incuber pendant 5 min dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide). Recueillir des hPSC dans une conique stérile de 15 mL. Lavage 2 fois CSEh en médium, cellules de transfert dans le stérile de 15 mL conique et centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
  4. Dans une armoire de biosécurité, réactiver chaque puits de cellules FRV-3i/MEF dissociée dans 2 mL de milieu FRV-3i et transférer directement sur un nouveau puits d’une plaque de 6 puits qui a été fraîchement revêtue avec de la gélatine de 0,1 %.
  5. Incuber les cellules hPSC LIF-3i/MEF pendant 1 h à 37 ° C dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide). Recueillir les cellules non adhérentes avec une pipette dans un nouveau tube conique. Doucement, ajouter 2 mL de milieu de CSEh dans chaque puits et agiter pour recueillir le reste des cellules non adhérentes.
    NOTE : La majorité de la MEF irradié attachera à la plaque gélatinisée en 1 h, laissant la majorité de la hPSC en suspension.
  6. Mélanger et centrifuger de cellules à 300 g pendant 5 min. laver dans du PBS. Le culot cellulaire Snap-congélation dans l’azote liquide après centrifugation, ou alternativement une nouvelle suspension pastilles dans un tampon de lyse qui est compatible avec l’analyse en aval de protéines ou d’acides nucléiques (Figure 2B).
  7. Effectuer des caractérisations de FRV-3i hPSC lignes avec un contrôle conventionnels apprêté hPSC isogéniques correspondant.
    NOTE : En raison de la variabilité intrinsèque entre et au sein des cultures apprêtées, contrôles pertinents sont préparés à un correspondant validant en culture ou avant retour naïf. Des protocoles détaillés et des matériaux pour en aval par immunofluorescence bioimaging, flow cytometry, Western Blot, l’expression des gènes (les tests de RT-PCR et les microarrays), études de méthylation (tache de dot, CpG méthylation microarray), OCT4 proximale et distale enhancer prédominance journaliste dosages et signalisation inhibiteur dosages sont fournis ailleurs3.

6. poster naïf réversion : Validation de l’intégrité génomique et rétention des empreintes Parental de N-hPSC LIF-3i-revenue avant utilisation dans des essais fonctionnels

  1. L’écran des cultures conventionnelles, apprêté hPSC départ pour possession d’un caryotype normal (par exemple, avec analyse de coloration Giemsa-bande à l’aide de méthodes publiées 7) avant d’entamer la réversion FRV-5i/FRV-3i.
    NOTE : Ceci est pour éliminer les populations de hPSC conventionnelles qui peuvent abriter des altérations génomiques anormales qui peuvent conduire à un avantage en survie sélective artéfactuelles dans des conditions de FRV-3i clonales.
  2. Pour des résultats optimaux, fraîchement revenir classique hPSC cultures à un État naïf avec FRV-3i plusieurs semaines avant leur utilisation dans les études fonctionnelles ou réalisé de différenciation.
    NOTE : Routine prolonge la culture « entretien » dans des conditions de FRV-3i pendant plus de 10 passages suivants naïf réversion n’est pas recommandée. Expansion systématique et l’entretien de lignées de CSEh et hiPSC est souhaitable à l’aide de systèmes de culture traditionnelle (p. ex., E8, ou MEF/CSEh moyen avec bFGF).
  3. Évaluer après dévulcanisation lignes N-hPSC pour le maintien de la normale caryotypes 5 – 7 passages après réversion FRV-3i (e.g., avec bande Giemsa coloration analyse7, ou toute autre méthode de choix).
  4. Évaluer toutes les lignes de N-hPSC rétablies pour le maintien de l’empreinte génomique parentale normale par une analyse de méthylation de l’ADN de choix (p. ex., protocoles pour analyse microarray ADN CpG d’empreintes parentales en FRV-3i-revenue N-hPSC sont fournis ailleurs3 ) après 5 à 10 passages de réversion FRV-3i.

7. post naïf réversion : Protocole expérimental Lignes directrices pour des dosages quantitatifs de différenciation dirigée à l’aide de N-hPSC LIF-3i-revenue

  1. Utiliser directement les FRV-3i N-hPSC dans des protocoles établis différenciation dirigée sans manipulations de la culture de cellules supplémentaires.
    NOTE : Ré-amorçage (c.-à-d., conversion N-hPSC retour des conditions classiques amorcées avant leur utilisation dans des essais de différenciation dirigée) n’est pas nécessaire avec la méthode FRV-3i et n’est pas recommandé.
  2. Pour contrôler les effets du dosage et interligne de variabilité dans le test fonctionnel des lignes individuelles hPSC, effectuer une validation croisée les puissances de la différenciation de la lignée spécifiques en utilisant des protocoles de différenciation indépendante avec au moins trois hPSC lignes dérivé des antécédents génétiques indépendantes (c.-à-d., hiPSC dérivé de donateurs multiples et les CSEh).
  3. Pour les comparaisons fonctionnels, mis en place frère cultures, au nombre de passage équivalente et de la même ligne de hPSC (isogéniques) parallèlement à la traditionnelle lignée-amorcé et FRV-3i-revenue hPSC. Culture hPSC isogéniques amorcée/naïve frères dans leurs médias respectifs (e.g., E8 vs. LIF-3i) et en même temps de différencier à l’aide de protocoles identiques de différenciation et matériaux, afin d’éliminer tout biais expérimental (Figure 4).
  4. Pour isogéniques amorcée vs naïve hPSC comparaisons, ajuster et optimiser la densité des ensemencements initiaux pour chaque série de tests de différenciation individuelle.
    NOTE : Les protocoles détaillés pour progénitrices neurales, endoderme définitif et hémato-endothéliales différenciation dirigée de N-hPSC LIF-3i-revenue sont fournis ailleurs 3. FRV-3i-revenue N-hPSC ont plus robuste capacité de prolifération et de différenciation dans les essais de différenciation dirigée que hPSC conventionnel. N-hPSC nécessite généralement une plus faible concentration d’ensemencements initiaux que le hPSC classique, et contrairement à leur hPSC conventionnel apprêté homologues, ne nécessitent pas l’utilisation de réactifs anti-apoptotiques pour améliorer leur survie clonale suite enzymatique digestion lors d’essais de différenciation.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Ce protocole optimise efficace comme naïve reversion avec FRV-3i dans les deux cultures de hPSC classique lignée-amorcé feeder-dépendants et indépendants de chargeur (Figure 1). Le protocole détaillé, décrit ci-après, contours adaptation séquentielle au FRV-3i à partir soit hPSC chargeur-dépendante ou exempte d’engraissement conventionnel des conditions (p. ex. E8 moyen).

Représentant des r...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Le système de FRV-3i applique une version modifiée du classique 2i murine naïf reversion cocktail1 à cellules souches pluripotentes humaines. L’auto-renouvellement des hPSC (qui ne peut pas développer à 2i seul) est stabilisé en FRV-2i en complétant ce cocktail avec l’inhibiteur de la tankyrase XAV939. FRV-3i culture permet en vrac et efficace retour de la hPSC conventionnelle à un État pluripotentes ressemblant à l' épiblaste préimplantatoire humain3

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

En vertu d’un accord de licence entre les Technologies de vie et de l’Université de Hopkins de Johns (JHU), Dr Zambidis a droit à une part des redevances reçues par l’Université pour les licences de cellules souches. Les conditions de cette entente sont gérées par JHU conformément à sa politique de conflit d’intérêts. Cela n’altère pas le respect des auteurs politiques de journal sur le partage des données et matériaux.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), le prix Innovation de BRP Stein, le Maryland Stem Cell Research Fund (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award et la Fondation Moseley.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugatedBD Biosciences561716utiliser 5µL par analyse (FACS)
anti- TFCP2L1 antibodySigma AldrichHPA029708utiliser à une dilution de 1:100 (immunostainings)
anti-beta-Actin antibodyAbcamab6276utiliser à 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated BD Biosciences550315utiliser 5µL par analyse (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugatedeBioscience17-0319-42utiliser 2µL par analyse (FACS)
anti-CD31 microbead kitMiltenyi Biotec130-091-935
anti-NANOG antibodyAbcamab109250utiliser à une dilution de 1:100 (immunostainings)
anti-NR5A2 antibodySigma AldrichHPA005455utiliser à une dilution de 1:100 (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibodyCell Signaling4695utiliser à 1:1000 (Western blot), pour la détection de la protéine totale
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibodyCell Signaling4370utiliser à 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibodyCell Signaling9145utiliser à 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylatedAgilentE0432utiliser à une dilution de 1:500-1:1000 (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated R&D SystemFAB1435Autiliser 5µL par analyse (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugatedR&D SystemNLLC1435Gutiliser à une dilution de 1:50 (immunostainings vivantes et fixées)
anti-STAT3 antibodyCell Signaling9139utiliser à 1:1000 (Western blot), pour la détection de la protéine totale
anti-STELLA/DPPA3 antibodyMilliporeMAB4388utiliser à une dilution de 1:50 (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated R&D SystemNLLC4770Rutiliser à  une dilution de 1:50 (immunostainings vivantes et fixées)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0068utiliser à une dilution de 1:100 (immunostainings vivantes et fixées)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0069utiliser à une dilution de 1:100 (immunostainings vivantes et fixées)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560193utiliser 10µL par analyse (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560161utiliser 10µL par analyse (FACS)
APEL2-LiStemCell Technologies5271
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA3311
CellAdhere dilution bufferStemCell Technologies7183diluant pour la matrice Vitronectin XF™
CF1 mouseCharles river023
CHIR99021R&D SystemL5283reconstituer à 100mM dans le DMSO
confocal microscope systemZeissLSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC lineThermo Fisher ScientificA18945également appelée ligne 6.2
Corning Costar tissue culture-treated 6-well platesCorning3506
Countess  cell counting chamber slideThermo Fisher ScientificC10228
Countess automated cell counterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific11995-065
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide)Sigma AldrichD2650
DR4 mouseThe Jackson Laboratory3208
Essential 8 (E8) mediumStemCell Technologies5940
Fetal bovin serum (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
ForskolinStemgent04-0025reconstituer à 100mM dans le DMSO
Gelatin (porcine)Sigma AldrichG1890-100Gresuspendre dans l'eau et stériliser avec un autoclave
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028
L-Glutamine (100X)Thermo Fisher Scientific25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
mTeSR1 mediumStemCell Technologies85850
Nalgene cryogenic vialsThermo Fisher Scientific5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide SystemFisher Scientific154534
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBSUSB Corporation 19943
PD0325901Sigma AldrichPZ0162reconstituer à 100mM dans le DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)Biological Industries02-023-1A
PurmorphamineStemgent04-0009reconstituer à 10mM dans le DMSO
recombinant human Activin APeprotechAF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4Peprotech120-05ETresuspendre

Références

  1. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  2. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  3. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  4. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  5. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  6. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
  7. Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203(2014).
  8. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293(2011).
  9. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838(2012).
  10. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  11. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
  12. Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
  13. Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
  14. Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
  15. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  16. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  17. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  18. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  19. Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  20. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  21. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  23. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Cellules souches pluripotentes na vesm thode LIF 3icellules souches embryonnaires humainescellules souches pluripotentes induitesculture sans cellules nourrici resrepiquage cellulairemarquage immunofluorescentanalyse par Western Blotdiff renciation en t ratome

Articles connexes