Forcé de Salivation comme une méthode pour analyser la compétence vectorielle de moustiques

Résumé

Pour un contrôle efficace des moustiques, la charge de la transmission du virus, la connaissance du potentiel vecteur de moustiques respectifs est particulièrement intéressant. Nous décrivons la salivation forcée comme une méthode pour analyser la compétence vectorielle d’Aedes albopictus et trois différents taxons de Culex pour la transmission du virus Zika.

Résumé

Vector compétence se définit comme le potentiel d’une espèce de moustique pour transmettre un virus transmises par les moustiques (mobovirus) à un hôte vertébré. Particules virales viables sont transmises lors d’un repas de sang par l’intermédiaire de la salive d’un moustique infecté. Forcé de la salivation essais permettent de déterminer le potentiel vecteur sur la base des moustiques unique, évitant l’utilisation de l’expérimentation animale. Cette méthode convient analyser un grand nombre de moustiques dans une expérience dans un court laps de temps. Forcé de la salivation essais ont été utilisés pour analyser les 856 moustiques individuels pris au piège en Allemagne, dont deux différents biotypes de Culex pipiens pipiens , Culex torrentium ainsi Aedes albopictus, qui ont été infectés expérimentalement avec Zika virus (ZIKV) et incubé à 18 ° C ou 27 ° C pendant deux à trois semaines. Les résultats ont indiqué le manque de compétence vectorielle des différents taxons Culex pour ZIKV. En revanche, Aedes albopictus a été sensible aux ZIKV, mais seulement à 27 ° C, avec des vitesses de transmission semblables à une colonie de laboratoire de Aedes aegypti testée en parallèle.

Introduction

En 2015, Zika virus (ZIKV), un virus transmises par les moustiques (mobovirus) appartenant à la famille des Flaviviridae, a émergé en Colombie et au Brésil et se propager rapidement à travers les Amériques et les Caraïbes, causant une épidémie avec un nombre notable d’associés cas cliniques de microcéphalie et syndrome de Guillain-Barré¹. Les moustiques de l’espèce Aedes aegypti et Aedes albopictus sont considérés comme les vecteurs primaires et secondaires de ZIKV², mais les autres espèces du genre Aedes se sont également révélés avoir compétence expérimentale vecteur³ . Contrairement aux espèces d’Aedes , la plupart des espèces Culex testées jusqu'à présent n’est pas capable de transmettre le virus⁴. Simplement, les données de Culex quinquefasciatus fournies résultats non concluants,³. À l’heure actuelle, information fait défaut sur la compétence du vecteur moustique pour ZIKV dans des conditions de température modérée (< 20 ° C). Toutefois, cette information est importante pour l’évaluation des risques des "spreads" possible aux régions à climat tempéré comme l’Europe centrale.

Un vecteur compétent pour ZIKV est en mesure d’acquérir, conserver, amplifier et enfin de transmettre le virus. Donc, test moustique cadavres ou parties du corps, y compris les jambes, de l’intestin moyen, tête ou les glandes salivaires, pour ZIKV n’est pas suffisant pour déterminer la compétence vectorielle. Il est obligatoire d’essai pour les particules de virus infectieux dans la salive libérée. Afin d’évaluer la compétence vectorielle, les taux d’infection (IR, plusieurs corps de moustique ZIKV séropositifs en nombre de moustiques engorgées) et vitesse de transmission (TR, nombre de moustiques avec de la salive ZIKV positives par le nombre de corps de moustique ZIKV séropositifs), doivent être déterminé. IRs de moustiques peuvent être facilement analysés par les moustiques simplement homogénéisation suivies d’une réaction en chaîne polymérase en temps réel de transcriptase inverse (RT-qPCR) ciblant les ZIKV. Par ailleurs, l’infection peut être davantage caractérisée en déterminant le nombre de copies virales par le moustique. Par contre, l’analyse des taux de transmission repose sur la détection des particules virales viable dans la salive des moustiques individuels. Ceci peut être réalisé en se nourrissant de moustiques infectés sur des animaux de l’hôte sensible, suivies de l’analyse de la virémie chez l' hôte⁵. Toutefois, cette méthode s’appuie sur des organismes modèles adaptés et est coûteux et restreinte par les règlements de protection des animaux. Pour éviter l’utilisation des animaux de laboratoire pour l’analyse des débits de transmission et de réduire les coûts, re-systèmes d’alimentation artificielle en utilisant le sang des gouttelettes ont été décrit⁶. Cependant, le test à l’échelle individuelle combinée avec un nombre élevé de personnes est long et difficile. La première description d’un test de salivation à échelle individuelle a été publiée en 1966⁷ et au cours de ces dernières années, forcé de la salivation expériences sont devenues la méthode de choix pour évaluer la compétence vectorielle de moustiques^3,8 .

Basé sur notre étude de compétence vectorielle des pays d’Europe centrale, les moustiques publié récemment⁹, nous décrivons forcée de la salivation, tel que rapporté par Anderson et al. ⁸ avec quelques modifications. Cette méthode permet des expériences dans des conditions de niveau élevé sur la biosécurité (BSL-3) à haut débit normalisé et comprend l’identification du virus actif par essais fondés sur la culture de cellules. Les expériences décrites ici comprennent 856 moustiques. Ils étaient infectés par la ZIKV de la farine de sang artificielle et analysés par la suite la présence de particules virales infectieuses dans la salive. Les moustiques introduits dans les populations de laboratoire établi de longue date deux expériences composés de Ae. aegypti et Culex pipiens pipiens biotype molestus (Cx. p. molestus), ainsi que champ pris Culex pipiens pipiens biotype pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) et deux populations de Ae. albopictus . À l’exception d’une des deux populations Ae. albopictus , qui ont été recueillis en Italie, tous les moustiques ont été recueillis en Allemagne.

Protocole

1. préparer les moustiques femelles

1. Recueillir les moustiques d’une grande cage à l’aide d’un aspirateur (environ 400 moustiques par grande cage).
2. Anesthésier les moustiques avec le dioxyde de carbone (CO₂) pour 7 s.
3. Trier les 20 femelles par flacon en plastique (Ø 50 mm × 100 mm).
   Remarque : Si les moustiques se réveillent, utilisez un autre 3 s de CO_2.
4. Affamer les moustiques pendant la nuit.

2. artificiel farine de sang

Remarque : Toutes les étapes sont effectuées dans des conditions de niveau de biosécurité 3.

1. Préparer le repas de sang infectieux.
   1. Diluer les stocks de virus de la concentration de 1 x 10⁸ plaque formant des unités (PFU) / mL.
      Remarque : La concentration en stock a été déterminée en effectuant la méthode de culture de tissus infection dose 50 (DICT50) et calculée par l’algorithme^10,Spearman & Kärber¹¹.
   2. Mix expiré de sang humain (conservation de sang) de la Banque de sang (ne convient pas aux humains, mais utile pour les moustiques) au fructose (solution à 8 %), filtrée de sérum de bovin (FBS) et la solution de travail le stock de virus (expiré humain sang : fructose : FBS : solution de travail = 5:3:1:1).
      Remarque : Nous avons choisi sang humain, car il s’agit de l’hôte mammifère naturel connu de ZIKV.
2. Gel 140 µL du mélange de farine de sang pour une analyse ultérieure par l’intermédiaire de DICT50.
3. Effectuez l’alimentation artificielle à l’aide de différentes méthodes d’alimentation, selon les espèces :
   1. Aedes aegypti: utiliser une membrane systèmes d’affouragement pour 30 min (1 mL / feeder).
   2. Culex spp. : fournir le sang contaminé par un bâton de coton pendant la nuit et n’ai pas chaud le sang (300 µL par flacon).
   3. Aedes albopictus: mettre deux gouttes (50 µL) du mélange de farine de sang dans le flacon en plastique et laisser les moustiques se nourrissent pendant 2 h. Réchauffer pas le sang.
      Remarque : Les moustiques nourrira dans les 15 premières minutes. Le temps d’incubation prolongée est nécessaire pour des raisons de sécurité. Les gouttelettes de sang sont drainés après que 2 h, que donc le risque de contamination est réduit pendant le tri de nourri les moustiques.
4. Anesthésier les moustiques avec CO₂ pendant 7 s.
   Remarque : Si les moustiques se réveillent, utilisez un autre 3 s de CO₂.
5. Tri et comptage complètement engorgent moustiques dans un nouveau flacon.
6. Ajouter un tampon de coton, imprégnée de fructose (solution à 8 %) entre le flacon et d’une fiche.
7. Garder les moustiques à la température de 18 ° C ou 27 ° C dans l’humidité de 80 % de désigné pour 14 ou 21 jours.
8. Se nourrissent les moustiques avec des tampons de coton saturé en fructose. Renouveler toutes les 72 h avec 1,5 mL de fructose (solution à 8 %) par flacon (jusqu'à 20 moustiques, selon l’alimentation taux, reportez-vous à l’étape 2.5).

3. forcé Salivation test 14 ou 21 jours

Remarque : Toutes les étapes sont effectuées dans des conditions de niveau de biosécurité 3.

1. 2 x 10⁴ cellules de Vero de graines / / puits dans un 96 bien plat avec 200 µL de milieu de croissance (Dulbecco´s eagle milieu modifié (DMEM) additionné de 3 % FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 mg/mL de streptomycine, 5 µg/mL d’amphotéricine B, 2 mM de L-glutamine 1 % des acides aminés (NEAA), pyruvate de sodium 1 %).
2. Préparer le dispositif de la salivation :
   1. Placez une plaque de verre au carré (20 × 20 cm) sur le banc sous un angle de 30°.
      Note : Ceci est nécessaire en raison de la dépression dans le laboratoire de sécurité. Si la plaque est horizontal ou vertical, liquide fuira.
   2. Placer du ruban adhésif double face sur le dessus de la plaque de verre.
   3. Rôle de la glaise à modeler jusqu'à ce qu’il atteint un diamètre de 0,5 cm et fixez-le horizontalement 1 cm de distance de l’adhésif double-face.
   4. Couper les premiers 0,3 cm de l’extrémité d’une pointe de filtre de 10 µL.
      Remarque : Il est conseillé de préparer ceci avant de commencer l’expérience en dehors du laboratoire de biosécurité.
   5. Remplir les bouts filtrants avec 10 µL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4).
   6. Placer les pointes à filtre sur la glaise à modeler avec la pointe vers le ruban adhésif.
   7. Fixer les embouts de filtration avec une légère pression.
3. Préparer les moustiques :
   1. Anesthésier les moustiques en CO₂.
   2. Enlever les pattes et les ailes pour immobiliser les moustiques.
   3. Difficulté le moustique vivant organes sur la bande collante au-dessus d’une extrémité du filtre.
   4. Placez la trompe doucement sur l’extrémité du filtre.
   5. Exécutez le test de salivation pendant 30 min.
   6. Enlever les bouts de filtre et jeter l’argile et la bande.

4. le traitement de la salive

Remarque : Les étapes 4.1 – 4.6.2 sont effectuées dans des conditions de niveau de biosécurité 3.

1. Expulser le contenu dans les tubes de réaction contenant 10 µL de PBS.
2. Mélanger doucement et transférer le contenu dans les puits de la plaque de 96 bien préparés à l’aide d’un puits par exemple.
3. Incuber la plaque pendant 7 jours à 37 ° C, avec 5 % de CO₂.
4. Utilisez les jumelles pour vérifier les cellules de la présence de l’effet cytopathogène (ECP).
5. Si le puits est positif pour le CPE, récolter le surnageant en pipettant : 140 l dans un tube à essais pour extraction de l’ARN.
6. Purifier l’ARN à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN.
   1. Mix 140 µL du liquide surnageant avec 560 µL de AVL buffer (tampon de lyse virale) et incuber pendant 10 min à température ambiante.
   2. Ajouter 560 µL d’éthanol (96 %) et l’échantillon de vortex.
      Remarque : Les échantillons sont inactivés après cette étape et peuvent se déverser hors laboratoire BSL-3.
   3. Pipette 630 µL de l’échantillon sur une colonne et une centrifugeuse avec 6 000 x g pendant 1 min.
   4. Jeter le filtrat, pipette le µL 630 restants sur la colonne et répétez la centrifugation.
   5. Laver l’ARN, lié à la membrane de la colonne, en ajoutant 500 µL de tampon de 1 dans la colonne et centrifuger à laver à 6 000 x g pendant 1 min.
   6. Jeter le tube de prélèvement et placer la colonne dans un nouveau tube de prélèvement. Ajouter 500 µL de tampon de lavage 2 et centrifuger à 12 500 x g pendant 3 min.
   7. Jeter le tube de prélèvement et placer la colonne dans un tube de réaction de 1,5 mL.
   8. Ajouter 50 µL de tampon d’élution et incuber pendant 1 min à température ambiante.
   9. Centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min et puis jeter la colonne.
7. Analyse des échantillons d’ARN ZIKV via RT-qPCR.

5. le traitement de corps de moustique

Remarque : Les étapes 5.1 – 5,5 sont effectuées dans des conditions de niveau de biosécurité 3.

1. Retirer les corps du moustique et placer chaque organe dans un tube à essais.
   Remarque : Il est possible d’interrompre l’expérience à ce stade et stocker les échantillons à-80 ° C.
2. Ajouter 500 µL de médias d’homogénéisation (DMEM sans n’importe quel supplementals) dans le tube à essais.
3. Homogénéiser le corps à l’aide de moteur mélangeur de main et utiliser un pistil de nouveau pour chaque échantillon.
4. Ajouter 200 µL de l’homogénat dans une plaque à 96 puits pour la purification.
   Remarque : Il est possible d’interrompre l’expérience à ce stade et stocker les échantillons à-80 ° C.
5. Inactiver la plaque par incubation pendant 60 min à 60 ° C.
6. Purifier l’ARN de purification de l’acide nucléique automatisée.
   Remarque : Il est possible d’interrompre l’expérience à ce stade et stocker les échantillons à-80 ° C.

6. analyse

1. Quantifier les Copies d’ARN Viral à l’aide de la RT-qPCR.
   NOTE : Les copies RNA ont fait la moyenne sur tous les corps de moustique ZIKV positif et sans inclure les moustiques ZIKV négatif.
2. Calcul de l’IR, défini comme le nombre de corps de moustique ZIKV positives par le nombre de femelles nourries.
3. Calculer le TR, défini comme le nombre de moustiques avec de la salive ZIKV positives par le nombre de corps de moustique ZIKV positifs. Le taux de transmission n’a pas pu être calculé pour combinaisons d’espèces-température avec aucun corps ZIKV-positif.

Résultats

Aedes aegypti est connu comme un vecteur compétent pour ZIKV au moins dans des conditions climatiques tropicales,¹². Par conséquent, nous avons utilisé Ae. aegypti comme témoin positif pour établir le dosage et analyser les IRs comme TRs à une température d’incubation 27 ° c et une humidité de 80 %. IR et TR ont été définis comme décrit par Fortuna et al. ¹³. a contesté Ae. aegypti a montré IR de 50 % et 72 % et TR de 42 % et 31 % à 14 et 21 jours après l’infection (dpi), respectivement (Figure 1 a et 1 b). Par la suite, les moustiques européens ont été testés pour ZIKV infection et la transmission à l’aide de conditions climatiques tropicales ainsi que tempérées.

Avec une température d’incubation 27 ° C, toutes les espèces de moustiques ont montré infection ZIKV à 14 dpi ainsi que 21 dpi, sauf Cx. p. pipiens et Cx. torrentium particuliers, qui se sont révélés positifs à 14 dpi seulement. Toutes les espèces d’Aedes a montré IRs plus élevée (entre 50 % et 72 %) ainsi que de la concentration en ARN virale supérieure (10⁶ jusqu'à 10 échantillons de copies/moustique⁹ RNA) en comparaison avec les différents taxons de Culex , qui a révélé IRs comprise entre 0 % et 32 % et une charge virale de 10³ à 10 échantillons de copies/moustique⁴ RNA. Toutes les espèces d’Aedes affichent salive ZIKV séropositifs (TR 13 à 42 %), alors qu’aucun de ces échantillons de salive de taxons Culex contenaient ZIKV (Figure 1 a et 1 b). Fait intéressant, les taux de transmission à 21 dpi étaient semblables en Ae. aegypti et Ae. albopictus d’Allemagne (30 %), mais étaient nettement moindres dans Ae. albopictus d’Italie (13 %).

L’incubation des moustiques contestées à une température moyenne de 18 ° C a révélé généralement inférieur virus charge chez les espèces Aedes (⁴– 10 10⁶ RNA copies/moustique) ainsi que dans les différents taxons de Culex (10^{2 –}10⁴ RNA copies/moustique). Cependant, à 18 ° C la température d’incubation, transmission de ZIKV n’a pas été observée pour les espèces de moustiques étudié.

Figure 1 : taux de Transmission de moustiques infectés expérimentalement par ZIKV. Résultats des études de compétence vectorielle avec ZIKV en espèces différentes de moustiques. Six taxons différents moustiques étaient infectés par ZIKV et incubés à 27 ° C ou 18 ° C pendant 14 (A) ou 21 jours (B). TR est défini comme le nombre de moustiques avec de la salive ZIKV positives par le nombre de corps de moustique ZIKV positifs. Le nombre total de moustiques étudié était 856, avec un minimum de 30 personnes pour chaque taxa de moustique/température/point de temps. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Il a déjà été démontré que les résultats obtenus avec la salivation forcée correspondent classique d’expériences ré-alimentation⁶. Cependant, dans re-expériences d’alimentation et dans notre méthode présentée de la salivation forcée, il est impossible de directement la preuve de l’activité de la salivation ou surveiller le rejet de la salive. Pour prouver que l’activité de la salivation, les échantillons pourraient être testés pour autres composants présent dans la salive (e.g., protéines, glucides, etc..). En outre, y supplémentaires permettrait à détection de copies de RNA virales. Ceci, cependant, exige fractionnement des échantillons de salive pour diverses analyses, ce qui pourraient limiter la sensibilité dans l’épreuve de culture cellulaire en cas de nombres de particules très faible. À son tour, cela pourrait conduire à une sous-estimation des taux de transmission déterminé.

Pour obtenir des résultats reproductibles, il est nécessaire de s’assurer que tous les moustiques restent en vie jusqu'à la fin de l’expérience. Ceci est contrôlé en contrôlant visuellement l’activité de mouvement du corps des moustiques. En outre, l’utilisation du principe du dosage salivation pour une espèce de moustique donnée doit être testé en se nourrissant de virus control, qui sont connus pour être transmis par cette espèce de moustique spécifique. Inversement, tous les virus introduits dans une expérience doit être testé dans un moustique sensible.

Les tests de salivation forcé ont beaucoup d’avantages. Un nombre élevé de moustiques peut être testé simultanément sur un seul spécimen de base dans des conditions normalisées contrôlées sans entrer en conflit avec le bien-être animal règlements⁹.

La méthode est utilisée par plusieurs laboratoires. Toutefois, les configurations exactes peuvent différer, qui peut conduire à des différences de résultats entre les laboratoires. Un élément essentiel est le capillaire pour recueillir la salive, qui peut être faite de verre¹⁴ ou en plastique¹⁵. Pour respecter les normes de sécurité élevées d’un Insectarium de niveau 3 de biosécurité, nous avons utilisé des pointes à filtre en plastique au lieu de capillaires en verre, réduisant ainsi le risque de blessures. En outre, bouts filtrants ont l’avantage que le liquide recueilli peut être facilement transféré à l’aide d’une pipette.

La configuration de l’essai de salivation forcée présentée ici est basée sur deux enquêteurs travaillant ensemble et en partageant les tâches. Démobilisation du moustique est effectuée par une seule personne, tandis que l’autre prépare simultanément le paramétrage forcé de la salivation. Cela a significativement réduit le temps de manipulation et minimise le risque d’échantillon que de changer entre la démobilisation-lieu de travail et la salivation-plaque de commutation n’est pas nécessaire. En outre, il permet de placer les moustiques sur le périphérique de salivation forcé immédiatement après la démobilisation. Ce moustique plutôt court durée de la manipulation est essentiel pour la salivation forcée réussie. Enfin, les moustiques peuvent être directement contrôlés pour la motilité pendant toute l’expérience entière.

Le test de salivation présenté ici est utilisé pour mieux comprendre le potentiel vecteur des espèces de moustiques. Toutefois, pour répondre à certaines questions spécifiques (p. ex.., le nombre de piqûres de moustiques qui sont nécessaires pour infecter les vertébrés), animal expériences pourraient encore être nécessaires.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Inject+matic Sleeper	Inject+matic
Bugdorm-1 Cage d’élevage d’insectes	BugDorm Store
Tubes de culture de drosophile	carl roth	PK11.2	Flacon en plastique pour moustiques
Bouchon pour tubes de culture de drosophile	carl roth	PK15.1
Chambre climatique constante	Liant	KBF-240
Sang			humain mis en banque, périmé, non utilisable pour une application médicale
Dumont-Pincette Électronique SS	Dumont	B40c
Vero cellules	BNITM
Aspirateur de lampe flash	Bioquip	2809
Ruban			pas de fournisseur spécifique
Gammex Gants non poudrés avec AMT	Ansell		pour des raisons de sécurité nécessaires lors du travail avec des piqûres dans le laboratoire BSL3
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit	altona diagnostics	591013
MagMax Pathogen RNA/DNA Thermo	fisher	4462359	Isolement des corps de moustiques
Qiamp viral RNA Mini Kit Qiagen		52906	ARN-Isolation du filtre surnageant
Pointes (20 & micro ; L)	Sarstedt	701,116,210	Coupez les 3 premiers mm de la pointe
Batteur à main	à moteur carl roth	Épuisé
Micro pilons pour batteur à main	Carl Roth	CXH8.1
DMEM		P0403550
L Glutamine Péniciline/Streptomycine	PAN	P0819100
Amphotéricine B PAN		P06-0110
Fructose	carl roth	4981.5
Saline tamponnée au phosphate	PAN	P04-36500
FBS	PAN
Sodium Pyruvat	PAN	P0443100
MEM NAA	PAN
Hemotek Feeder	Hemotek	PS6
Light Cycler	Roche	480 II
Light Cycler Software	Roche	480 SW 1.5.1
Pâte			pas de fournisseur spécifique
King Fisher Flex Purification System	ThermoFisher scientific
Aedes albopictus			eggs ont été collectés à Fribourg, Allemagne
Jumelles	MOTIC	SMZ-168
Jumelles	MOTIC	MLC-150C
CO2-Incubateur	Thermo scientific	MIDI 40