Article de méthode

Benchtop immobilisé par chromatographie d’affinité métallique, Reconstitution et analyse d’un Polyhistidine tag métalloenzyme pour le laboratoire d’études de premier cycle

18.6K vues

⸱

DOI :

10.3791/58012

⸱

23 août 2018

 , 
1Department of Chemistry, Muhlenberg College

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole de la purification par chromatographie AFFINITE métal benchtop immobilisé et réhydratation ultérieure d’un polyhistidine le tag, le fer non hémique liaison dioxygénase approprié pour le laboratoire d’enseignement de premier cycle.

Résumé

Chromatographie d’affinité métallique de benchtop immobilisé (IMAC), des protéines polyhistidine Taggé est facilement maîtrisée par les étudiants de premier cycle et est devenu la méthode de purification de protéines plus largement utilisé dans la littérature moderne. Mais, l’application de la chromatographie d’affinité pour les protéines de liaison métallique, particulièrement ceux avec des métaux redox sensibles tels que le fer, est souvent limitée aux laboratoires ayant accès à une boîte à gants - matériel qui n’est pas couramment disponible dans le premier cycle laboratoire. Dans cet article, nous montrons nos méthodes de benchtop pour isolation, IMAC reconstitution de purification et d’ions métalliques d’un poly-histidine Taggé, liaison du fer non hémique actifs en oxydoréduction extradiol dioxygénase et le dosage de la dioxygénase avec substrat varié les concentrations et la saturation d’oxygène. Ces méthodes sont exécutées par les étudiants de premier cycle et mis en œuvre dans le laboratoire de recherche et d’enseignement premier cycle avec une instrumentation qui est accessible et abordable au premier cycle institutions principalement.

Introduction

Les premiers rapports de la purification d’une protéine polyhistidine Taggé des extraits d’un organisme hôte à l’aide de chélation de l’étiquette histidine par un métal immobilisé entré dans la littérature en 19881,2. Depuis ce temps, l’ajout de balises de polyhistidine de protéines recombinantes et leur purification par chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC) sont devenus pratiquement omniprésent dans la littérature biochimiques3,4, 5. Méthodes de purification IMAC peuvent être implémentés sur la paillasse, chromatographie automatisé et dans des formats de colonne à centrifuger. Alors que les méthodes de purification d’affinité, notamment les IMAC, sont largement utilisés dans le laboratoire de recherche, ils sont moins fréquents dans le laboratoire d’enseignement de premier cycle. Les manuels de laboratoire plus largement utilisé pour le laboratoire de biochimie n’enseignent pas systématiquement ces méthodes, optant plutôt pour échangeuse d’ions plus traditionnel ou colorant-liaison chromatographie6,7,8 , 9. par exemple, la purification de la lactate déshydrogénase par Anderson10 utilise affinité de liaison de colorant, et la purification du lait de vache α-lactalbumine7,11 par Boyer utilise un nickel-nitriloacetic matrice de l’acide, mais aucune balise recombinant poly-histidine, comptant plutôt sur l’affinité intrinsèque de la protéine pour la résine. Certains manuels de laboratoire moderne de premier cycle et les publications implémentent chromatographie d’affinité métallique immobilisée sur poly-histidine Taggé protéines cibles tels que les protéines vertes ou rouges fluorescentes12,13, 14,15, anticorps16et certaines enzymes17,18,19,20, même certains de fonction inconnue,21. Sans doute, la purification de l’enzyme est préférable dans le laboratoire d’enseignement, parce que la cible peut être dosée pour activité dans ses sessions ultérieures, enrichir l’expérience de la « vraie science » la part de l’étudiant ; en effet, ces types d’expériences de laboratoire ont été publiés et les résultats bénéfiques sur l’apprentissage des élèves signalés17,18,20,21. Et encore, applications d’IMAC à purification d’enzymes dans la biochimie enseignement laboratoire restent rares, et les méthodes publiées peuvent présumer même accès aux instruments de chromatographie qui n’est généralement pas disponible pour utilisent en laboratoire en classe 20. il y a aussi des limitations dans l’application de l’IMAC à métalloprotéines, surtout celles qui lient l’oxydo-réduction sensible des métaux divalents qui sont essentiels à l’activité22. Fréquemment, l’ion métallique est perdue ou oxydée durant la purification produisant une enzyme inactive inadapté au laboratoire du premier cycle.

Un tiers plein d’enzymes se lier à un ion métallique23, et malgré une exigence presque universelle pour le fer dans toutes les formes de vie23, fer est sans doute parmi les ions métalliques plus problématiques en enzymologie. Non hémique Fe2 + liaison enzymes sont particulièrement sujettes à la perte et/ou l’oxydation du métal au cours de l’IMAC ; probablement en raison de l’absence d’un ligand biologique dédié comme l’hème et la facilité avec laquelle Fe2 + pouvez dissocier du acide aminé ligands24. En outre, l’oxydation par l’oxygène dépendant de Fe2 + en Fe3 + est spontanée en solution aqueuse, en raison du changement négatif d’énergie libre et la relative stabilité de Fe3 +. Souvent, ces défis sont relevés par utilisation d’anaérobie atmosphère et/ou non-IMAC méthodes chromatographiques22. Dans cet article, nous allons démontrer l’utilisation de benchtop IMAC pour purifier le Fe2 + métalloenzyme charge L-DOPA dioxygénase utilise des conduites simples et peu coûteuses de chromatographie, suivies par la reconstitution du site actif Fe2 +, et dosage enzymatique. Ces méthodes sont standards dans notre propre laboratoire de baccalauréat en biochimie des groupes d’élèves de 6 à 12 et peuvent être utilisés pour élargir le répertoire des enquêtes enzymatique au niveau du baccalauréat.

Protocole

1. préparation pour la Purification

  1. Préparation de l’extrait brut acellulaire
    1. Obtenir un culot ~ 9-10 g d' e. coli (BL21) qui surexprimé la polyhistidine Taggé metalloprotein25 dans un tube conique de 50 mL.
    2. Ajouter 5 mL par gramme de tampon de lyse temp/identification de chambre (50 mM Phosphate, 300 mM NaCl, imidazole de 10 mM à pH 8) à environ 9-10 g de culot pour un volume total ~ 45-50 mL. Périodiquement de vortex pour encourager la dissolution. Si la pastille a été gelée, décongeler dans un bain d’eau tiède.
    3. En utilisant le bain d’eau glacée, faites refroidir la suspension cellulaire à environ 3 ° C en prévision de la lyse cellulaire.
      Remarque : À ce stade, la lyse cellulaire par sonication, fraisage de perle ou une autre méthode est possible. Fraisage de la perle est démontré ici parce qu’il est rapide, relativement peu coûteux et n’exige pas des protections auditives.
    4. Assembler une bille de 50 mL fraisage chambre selon les instructions du fabricant.
    5. Remplir la chambre de moulin de perle moitié plein de réfrigérés 0,1 mm perles en verre qui ont été stockés à-20 ° C.
    6. Remplir le reste de la chambre avec la suspension de cellules réfrigérées et tampon de lyse/identification de 4 ° C permet de remplir la chambre complètement.
    7. Utilisez une petite spatule pour faire tourner l’arbre de l’usine de perles et de mélanger la suspension cellulaire avec les perles.
    8. Éliminez les grandes bulles avec une pipette et puis visser le couvercle.
    9. Sec hors de la chambre de toute fuite.
    10. Ajouter environ 1 tasse de glace à la veste claire, en plastique, inverser la chambre remplie de 50 mL dans la veste de glace rempli et le visser fermé.
    11. Sécuriser la chambre de glace-chemisé sur le moteur.
    12. Tourner le moulin de perle moteur sur pendant 15 secondes à 15 800 tr/min, puis laissez pour reposer pendant 45 secondes. Répétez 8 fois.
    13. Lorsque les 8 cycles sont complétés, décanter la suspension de la lyse cellulaire tout en 50 mL ou plus grand tube conçu au centrifugation à haute vitesse (25 000 x g ou supérieur). Placer une paire de tubes équilibrés dans la centrifugeuse et un essorage à 25 000 x g pendant 40-45 minutes à 4° C pour granuler des perles de verre et de débris cellulaires.
      Remarque : Si 50 mL ou plus gros tubes calibrés pour la centrifugation à haute vitesse ne sont pas disponibles, retirer les perles de verre par centrifugation à 1000-2000 x g pendant 2-3 min dans un tube conique de 50 mL pour donner un plus petit volume de suspension cellulaire (~ 25 mL) qui peut être décanté dans un plus petit volum tube e convenant de centrifugation à haute vitesse.
    14. Lorsque centrifugation est terminée, décanter le clair, jaune, acellulaire, brut extrait dans un tube conique propre de 50 mL. Prendre soin de ne pas pour transférer les débris cellulaires.
    15. Recueillir un petit échantillon des extraits bruts acellulaire pour une analyse ultérieure de la purification par SDS-PAGE26.
  2. Préparation de la colonne de l’IMAC
    1. Obtenir une colonne de 1,5 x 20 cm équipée d’un support de lit inférieur pour retenir les particules de résine, une prise de verrouillage Luer et un capuchon qui contient également un raccord Luer lock. Correspond à la prise de connecteur Luer-lock avec un robinet d’arrêt pour contrôler le flux.
    2. Travaillant à la paillasse, fixer la colonne sur un support de bague.
    3. Obtenir une suspension de 50 % de résine de (Ni-NTA) acide nitriloacetic nickel-bondissent dans 20 % d’éthanol qui a été stockée à 4 ° C.
    4. Doucement agiter le flacon pour remettre en suspension uniformément la résine.
    5. Travailler à température ambiante et applications, utiliser une pipette jaugée de retirer 2 mL de la solution aqueuse, qui produira 1 mL de réglé résine capable de se lier à 50-60 mg de polyhistidine protéine contenant le tag et transférer la suspension dans la colonne.
    6. Ouvrir le robinet et laisser la solution de stockage excessif s’écouler par gravité de la résine.
    7. Bien fermer le robinet d’arrêt
    8. À l’aide d’une pipette Pasteur, ajouter avec précaution le tampon de lyse réfrigérés/bind (50 mM Phosphate, 300 mM NaCl, imidazole de 10 mM à pH 8) et à la colonne de résine – au moins 30 mL. Prendre soin de ne pas pour troubler la surface de la résine. Exécutez le tampon vers le bas les murs de la colonne pour éviter les éclaboussures.
    9. Equilibrer la résine en permettant le tampon de lyse/bind s’écouler lentement de la colonne par gravité dans un bécher de collection.
    10. Lorsque le tampon de lyse/bind a principalement été vidangée, fermez le robinet d’arrêt pour arrêter le flux de mémoire tampon lorsque environ 5 mL de tampon de lyse se maintient au-dessus de la résine et laisser la colonne, montée verticalement, jusqu’au moment de procéder ou pour 1 semaine.

2. purification de Polyhistidine-tag cible par IMAC

  1. Préparer le tampon de lavage (50 mM 300 mM NaCl, le Phosphate, pH imidazole de 20 mM 8) et de la mémoire tampon d’élution (50 mM Phosphate, NaCl, imidazole de 250 mM, 300 mM 10 % de glycérol, pH 8). Refroidir à 4° C.
  2. Préparer la colonne Ni-NTA pour l’ajout d’extraits bruts acellulaire en ouvrant le robinet d’arrêt et permettant restant de tampon de lyse/liaison s’écouler par gravité à travers la résine Ni-NTA. Lorsque toute la mémoire tampon a été vidangée, et affleure la surface de la résine, fermer le robinet.
  3. Le brut libre de cellules à l’aide d’une pipette Pasteur, soigneusement la pipette extraits sur la résine, en prenant soin de ne pas pour troubler la surface. Exécuter les extraits bruts sur les murs de la colonne pour éviter les éclaboussures. Le volume des extraits bruts appliquée dépend du niveau d’expression de la protéine polyhistidine-étiquetée ; s’assurer que le volume total des extraits bruts contient 50 à 60 mg ou moins de la protéine cible par mL de résine Ni-NTA (voir étape 1.2.4).
  4. Lorsque tous les extraits bruts ont été transférés à la colonne, ouvrir le robinet afin que la colonne peut vider par gravité. Ce flux à travers est composé de protéines qui ne se lient pas à la résine – collecter 100 μL pour une analyse ultérieure de la purification par SDS-PAGE. 26
  5. La viscosité des extraits bruts acellulaire peut ralentir l’écoulement par gravité de la colonne considérablement. Pour augmenter la vitesse d’écoulement, appliquer un simple « pompes » :
    1. Prenez une seringue de 10 mL Luer-lock et connectez-le à l’extrémité de la colonne à l’aide d’un petit morceau de tube en plastique et des raccords Luer-lock entre le plafond de la colonne et la seringue. Tirez le piston de la seringue et le fixer fermement le cap de la colonne sur le dessus de la colonne.
    2. Comprimer légèrement le piston de la seringue tout en évaluant manuellement le débit en recueillant l’éluant dans une éprouvette graduée ; taux de 1 à 2 mL / minute sont compatibles avec la résine et cette configuration. Doucement augmenter la compression du piston de la seringue que le débit ralentit.
    3. Pour empêcher l’introduction d’air dans la résine, enlever le capuchon de la colonne et joint pompe manuelle lorsque le ménisque du liquide appliqué atteint 5 à 10 mm au-dessus du lit de résine et permettent le volume restant s’écouler par gravité.
  6. Quand les extraits bruts libre de cellule ont fini drainant et la surface de la résine est exposée à nouveau, utilisez une pipette Pasteur pour ajouter avec précaution environ 30 mL de tampon de lavage réfrigéré à la colonne – en prenant soin de ne pas pour troubler la surface de la résine. Exécutez le tampon vers le bas les murs de la colonne pour éviter les éclaboussures.
  7. Ouvrir le robinet et laisser le tampon de lavage s’écouler à travers la colonne. Ce processus enlève protéines faiblement liés de la résine. Jeter l’éluant.
  8. Tandis que le tampon de lavage est drainante, préparer, seize ans, étiqueté, microtubes à centrifuger pour rassemblant des fractions de 1 mL.
  9. Dès que le tampon de lavage a été vidangée, et la surface de la résine est encore exposée, fermer le robinet d’arrêt. Utiliser une pipette Pasteur pour ajouter avec précaution environ 30 mL de tampon d’élution réfrigérés à la colonne – en prenant soin de ne pas pour troubler la surface de la résine. Exécutez le tampon vers le bas les murs de la colonne pour éviter les éclaboussures.
  10. Ouvrir le robinet lentement et laisser le tampon d’élution Éluer la protéine polyhistidine avec étiquette de la colonne. Collecter 1 mL de l’éluant dans chacun des tubes de microcentrifuge marqué, 1 à 16.
  11. Tester les fractions de protéine par dosage colorimétrique de protéines telles que l’analyse de Bradford ou spectroscopie UV-Visible selon des méthodes spécifiques par le réactif et/ou instrument fabricants27,28. Tel qu’illustré ici, le dosage colorimétrique à l’aide de bleu de Coomassie est réduit à un volume μL 100 pour sacrifier seulement un petit volume de chaque fraction.
  12. Mix 3 μL de chaque fraction avec 100 µL d’une protéine colorimétrique réactifs de dosage et manuellement observe la formation de n’importe quelle couleur pour indiquer la présence de protéines dans la fraction ; détection avec un spectromètre n’est pas nécessaire.
  13. Si la protéine est présente dans la fraction 16, continuer à élution de fractions de 1 mL et dosage des protéines régulièrement, jusqu'à ce que les fractions éluées ne contenant une quantité importante de protéines.
  14. Combiner des fractions protéiques dans un tube conique propre et retirer un échantillon de 100 μL pour une analyse ultérieure par SDS-PAGE26.
  15. Procéder à la reconstitution du cofacteur de l’ion métallique ou geler la protéine en aliquotes de 3 mL à-80 ° C. Veiller à ce que 10 % de glycérol est inclus dans l’élution tampon est un cryoprotecteur pour stabiliser les protéines pures au cours du gel.
  16. Lors de l’élution de la colonne de Ni-NTA est terminée, c'est-à-dire toutes les protéines sont au large de la colonne et recueillis dans les fractions, passer un autre 25 mL de tampon d’élution par le biais de la colonne et stocker la colonne à 4 ° C en environ 5 mL de tampon d’élution pour le stockage à court terme , ou le tampon de lyse/bind avec 20 % d’éthanol pour le stockage à long terme.

3. la reconstitution de la protéine cible avec Fe2 +

  1. Ajout de Fe2 +
    Remarque : Un fer non hémique (II) liaison enzyme, par exemple la dioxygénase L-DOPA dans cet exemple, nécessite un ion Fe2 + pour l’activité ; Cependant, le fer (II) s’oxyde facilement en fer (III), qui est inactif, et une fraction de la protéine purifie sans aucun fer à tous.
    1. Pour commencer la reconstitution du métal, obtenir 3 mL de l’enzyme purifiée en suspension dans le tampon d’élution. Si gelé, décongeler rapidement à l’aide d’un bain d’eau tiède et une fois décongelé, mettre la protéine sur la glace.
    2. En utilisant le volume de protéine dans le tube, calculer le montant d’ascorbate de sodium (198,1 g/mol) nécessaire pour que la concentration finale 12,5 mM dans l’échantillon. En outre, calculer le montant de dithiothréitol (DTT, 154.25 g/mol) nécessaire pour que la concentration finale 12,5 mM dans l’échantillon.
    3. Ajouter l’ascorbate de sodium solide et sur la TNT et doucement, mais complètement, mélanger pour dissoudre complètement. Prendre soin de ne pas pour provoquer la précipitation de protéines avec mélange trop agressifs. Ajouter une petite quantité de sulfate de fer (II) heptahydraté (278.01 MW g/mol) à l’échantillon de protéine.
    4. Afin d’obtenir une assez petite quantité d’eau salée, fer 1 quelques mm granules de FeSO4•7H2O solide dehors sur un morceau de peser papier, replier le papier sur le granule et l’écraser avec le côté plat d’une spatule métallique.
    5. Ajouter un grain de poudre qui en résulte dans le tube de la protéine.
    6. Vortex pour mélanger et une rose couleur rose apparaîtra dans le tube.
    7. Incuber la solution rose de protéine, plafonné, de 10 à 30 minutes sur la glace. La couleur rose disparaîtra lentement au fil du temps.
  2. Filtration sur gel
    1. Utiliser une colonne de gel filtration emballée avec 10 mL de gel de polyacrylamide sphérique avec une limite d’exclusion de poids moléculaire d’environ 6 000 et une gamme de tailles de particules hydraté de 90 à 180 µm dans une colonne de 1.5 x 12 cm, qui est également équipée d’un réservoir de 10 mL. Assurez-vous que la colonne est équipée en bas et lit sup. prend en charge sous la forme de 30 disques um poreux polyéthylène de retenir la résine dans la colonne et éviter le lit de résine de fonctionner à sec. Monter la colonne de gel filtration à un support de bague.
    2. Si vous utilisez une colonne de filtration gel pré-packagées, enlever le bouchon et videz l’excès de tampon au-dessus du support du lit supérieur.
    3. Pour équilibrer la colonne, commencez par remplir le réservoir avec tampon compatible avec dosage ultérieur et de stockage, par exemple, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10 % de glycérol à pH 8,0.
    4. Si vous utilisez une colonne de filtration gel pré-packagées, casser la pointe de bas de colonne de gel filtration pour démarrer le flux de mémoire tampon et exposer raccord Luer slip. Monter un robinet d’arrêt à l’extrémité du feuillet Luer de la colonne, mais laissez-le ouvert et laissez la colonne à s’écouler par gravité.
    5. Lorsque la mémoire tampon a vidé de la colonne et le support de la plateforme supérieure affleure, fermer le robinet et ajouter le ~ 3 mL de la métalloenzyme de Fe (II) reconstitué à la colonne en pipettant également, la solution sur le support de lit sup. exposées.
    6. Ouvrir le robinet et laisser l’échantillon entier 3,0 mL entrer dans la colonne par gravité. Jetez ces 3 premières mL d’éluant. N’importe quelle couleur rose qui se forme lors de la manipulation de la solution sera bloqué en haut de la colonne.
    7. Lorsque la colonne goutte ne s’échappe et le support de la plateforme supérieure affleure, ajouter 4 mL de tampon gel-filtration (p. ex., 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10 % de glycérol à pH 8,0) à la colonne. Ouvrir le robinet et recueillir l’éluant dans des tubes de microcentrifuge sur huit fractions de 0,5 mL.
    8. Tester les fractions de protéine à l’aide d’un dosage colorimétrique protéique ou UV-Vis27,28 comme décrit précédemment.
    9. Combiner des fractions protéiques.
    10. Retirer un échantillon pour analyse de SDS-PAGE26.
    11. Procéder à l’essai ou l’entreposage de l’échantillon.

Résultats

Ces résultats représentatifs ont été recueillies par les étudiants de premier cycle comme ils ont exécuté ce protocole au cours de deux périodes de laboratoire du cours de BCM 341 : biochimie expérimentale au Muhlenberg College. La figure 1 montre les résultats de la purification d’un poly-histidine de 20 kDa tag métalloenzyme, L-DOPA dioxygénase, interprété par deux étudiants de premier cycle durant une période de laboratoire de 4 heures en classe et analysés par SDS-PAGE, par le même étudiants au cours d’une période ultérieure en laboratoire. La protéine de poly-histidine Taggé est effectivement purifiée (Figure 1, piste 2). Un immunoblot du gel à l’aide d’anticorps contre la balise poly-histidine indique qu’une petite quantité de la protéine cible de poly-histidine Taggé est perdue dans le cheminement (données non présentées), probablement parce que plus que la quantité de 100 mg de protéine cible dans la lysat a dépassé la capacité de liaison de la résine.

La figure 2 montre des données d’activité étudiant Collector sur la réaction enzymatique de la cible de poly-histidine étiqueté métalloenzyme, L-DOPA dioxygénase, après reconstitution avec le fer (II) et gel-filtration ultérieure telle que décrite par le protocole dans les présentes. La seconde cinq morts-temps avant la collecte des données commence est typique des étudiants l’exécution de cette technique pour la première fois. L’activité robuste de la métalloenzyme a été détectée à l’aide d’un test publié et donné stationnaire des paramètres cinétiques compatibles avec les résultats publiés,29. Équilibre des paramètres cinétiques ont été déterminées en ajustant les courbes de progression30 illustré à la Figure 2; Cependant, le montage non linéaire des moindres carrés des vitesses initiales recueillies au cours d’une série de concentrations de substrat est tout aussi possible31.

figure-results-1
Figure 1. L’analyse de la SDS-PAGE26 de la poly-histidine tag protéine avant, pendant et après la purification. Voies 1 - marqueurs de poids moléculaire, poste Ni-NTA de la protéine purifiée 2 (20 kDa), 3-Ni-NTA accréditives, 4 - cellule libre des extraits bruts avant purification, 5 - cellules-débris pellet post lyse. Des échantillons ont été préparés en utilisant 5 x tampon échantillon/chargement et séparés sur gel de polyacrylamide préfabriqués en 4-20 % à l’aide d’un système d’électrophorèse de gel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
La figure 2. L’état stationnaire, dosage du fer (II) reconstitué métalloenzyme (c.-à-d., L-DOPA dioxygénase, 10µM) avec substrat (L-DOPA-5 µM (rouge), 25 µM (vert), 50 µM (bleu)) dans un tampon (50 mM Phosphate, 200 mM NaCl, pH 8). Traces illustrent la formation des produits à 414nm. Données d’absorbance ont été acquises en continu à l’aide des cuvettes de méthacrylate de 1 mL dans un faisceau balayage UV-Visible spectromètre29. Les données brutes sont propres à un modèle de Michaelis-Menten approximation de l’état d’équilibre (KM 30,8 µM ± 14,4, kchatapparente 2.3 s-1 ± 0,05)30. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Alors que l’ajout de balises de polyhistidine de protéines recombinantes et leur purification par IMAC est devenu pratiquement omniprésent dans la littérature biochimiques3,4,5, applications d’IMAC à purification d’enzymes dans la biochimie, laboratoire d’enseignement restent rares, et les méthodes publiées ne considèrent pas toujours les ressources limitées de l’enseignement de laboratoire20. En outre, l’utilisation de l’IMAC dans le laboratoire d’enseignement est plus efficace lorsqu’elle est associée à des expériences qui permettent d’évaluer l’activité et la pureté, rendant la purification IMAC d’une enzyme, une activité d’enseignement idéale. Afin d’étendre l’application de l’IMAC à la purification des enzymes, y compris des métalloenzymes, dans le laboratoire d’enseignement, des méthodes fiables et peu coûteux sont nécessaires. Dans ce protocole, nous démontrons benchtop IMAC à l’aide de fournitures de laboratoire facilement disponibles et peu coûteux, tout en abordant également les limitations dans l’application de l’IMAC à métalloprotéines22, en reconstituant le fer (II) dépendant métalloenzyme, L-DOPA dioxygénase, après purification. En utilisant les réactifs et les matériaux décrits, nous estimons que le coût des consommables pour huit groupes d’étudiants est entre 500 à 600 $ par semestre d’exécuter le présent protocole, y compris les étapes d’analyse décrites dans la Figure 1 et Figure 2.

En raison de la facilité avec laquelle Fe2 + peut désolidariser de ligands peptidiques24 et l’oxydation facile de Fe2 + O2 à Fe3 +, reconstitution de non hémique, acide aminé-chélaté fer (II) dans une métalloenzyme recombinante est un élément typique de la purification de l’enzyme. Lorsque chromatographie classique est utilisée, il est possible d’éviter une perte totale de fer dans certains cas32, mais plus souvent, il est ajouté le fer (II) retour en présence d’agents réducteurs33,34,35, 36 souvent sous un atomosphere anaérobie37,38,39et dans certains cas, l’excès de fer n’est pas enlevé33,34,36, ce qui complique toute analyse ultérieure. Les étapes successives de chromatographie classique et une atmosphère anaérobie ne sont pas réalistes pour le laboratoire de premier cycle, ce qui incite l’élaboration du présent protocole.

Bien que la préparation manuelle de la colonne de Ni-NTA et le traitement des échantillons en grande partie par gravité prennent plus de temps et effort lorsque comparé aux colonnes pré-packagées et automatisé des instruments de chromatographie, les étapes manuelles permettent pour Hands-on apprentissage de l’étudiant qui donnent lieu à une meilleure compréhension de la science derrière le processus. L’addition d’un sel de fer (II) dans les conditions décrites ici est particulièrement sensible aux excès dithiothréitol. Si un étudiant a tort ajoute un excès de dithiothréitol, un événement de précipitation est probable. Nous avons trouvé utile d’exiger des étudiants effectuer des calculs de quantités de réactifs avant son arrivée au laboratoire, donc temps de laboratoire peut être utilisé plus efficacement sur le banc. La purification de IMAC benchtop entier - de la lyse cellulaire à élution de protéine - peut être accomplie dans une période de 4 heures de laboratoire, suivie de la reconstitution et l’essai sur une période subséquente de laboratoire.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Remerciements

Cette publication est basée sur le travail soutenu par la National Science Foundation sous le Grant No.  CHE 1708237.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
consommables
BeadBeater 0,1 mm billes de verreBioSpec Produits110791011 livre chacun
50 ml Tubes coniques avec bouchons à vis, stérilesVWR21008-178
Chlorure de sodiumFisher BioreagentsBP358-1
Phosphate de potassium, monobasiqueAcros (Fisher)AC42420-5000
Ascorbate de sodiumAcros (Fisher)AC35268-1000  ;
DTT (Dithiothreitol)Lab ScientificD-115
Sulfate de fer(II) heptahydratéSigmaaldrich310077
HisPur NiNTA Resin  ;Fisher (perce)PI88221
Colonnes de chromatographie Econo-Column - 1,5 x 20cmBio-Rad737-1522  ;1,5 x 20 cm, 35 ml, 2 unités,
Robinet d’arrêt, unidirectionnel, femelle à luer mâleKimble420163-0000paquet de 50
seringues luer-loc BD 10mL (non stérile, sans aiguille)VWR301029
Raccord pour tubulure : 1,6 mm Barb à Luer Biorad femelle7318222
Raccord pour tubulure : 1,6 mm Barbé à Luer mâleBiorad 7318225
(1,6 mm de diamètre intérieur/0,8 mm de paroi, pour 0,2 à 5 ml/min sur une pompe péristaltique)Bio-Rad7318211paquet de 1, 1,6 mm de diamètre intérieur/0,8 mm de paroi, 10 m, tube basse pression pour la manipulation de liquides
GlycérolFisher (Pierce)17904
Coomassie Plus (Bradford) Dosage des protéinesThermo Scientitic23236
Tubes de microcentrifugation, capuchon à pression, 1,5 mlVWR89000-028
Pipettes sérologiques jetables en polystyrèneFisherbrand Fisher13-676-10F
Pompe à pipette universelle FiserbrandFisher  ;14-955-110
Pipettes de transfert FisherbrandFisher  ;13-711-9AM
Colonnes de dessalage Econo-Pac 10DGBio-Rad732-2010boîte de 30
tampons d’échantillons ExpressPlus PAGE 5xGenscriptMB010155mL (Diluer 1:5 avec l’échantillon)
ExpressPlus PAGE Gel, 4-20 %, 12 puitsGenscriptM4201220 gels
Fisherbrand Cuvettes jetables, méthyacrylateFisher14-955-128  ;Caisse de 500
Bouchons de cuvette carrés jetablesFisher14-385-999
L-DOPA (3,4-dihydroxyphénylalanine)AcrosD9628-5G
Équipement permanent :  ;
Chambre BeadBeater 50mL  ;BioSpec Products110803-50SS1 chambre
BeadBeaterBioSpec Products1107900-101Chambre en polycarbonate de 350 ml, rotor, base du moteur, chemise de refroidissement à l’eau glacée et une livre de billes de verre.
Tubes à centrifuger, PPCO haute vitesse, 50 mlFisher3119-0050PK
Cellule d’électrophorèse verticale Mini-PROTEAN Tetra pour mini-gels préfabriqués, 4 gelsBio-Rad1658004 Système d’électrophorèse verticale à 4 gels, comprend l’ensemble d’électrodes, le module de roulement d’accompagnement, le réservoir, le couvercle avec câbles d’alimentation, le barrage tampon à mini-cellules,
l’alimentation PowerPac HCBio-Rad1645052100&ndash ; 120/220&ndash ; 240 V, alimentation pour les applications à courant élevé, avec cordon d’alimentation
UV-1800 avec logiciel de sonde UVShimadzuUV-1800
Kintek Global Kinetic ExplorerKintek Corpversion 6https://www.kintekexplorer.com/downloads/
Tube en silicone ,

Références

  1. Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nature Biotechnology. 6 (11), 1321(1988).
  2. Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
  3. Block, H., et al. Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review. Methods in Enzymology. , 439-473 (2009).
  4. Derewenda, Z. S. The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization. Methods. 34 (3), 354-363 (2004).
  5. Gräslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  6. Switzer, R. L., Garrity, L. F. Experimental Biochemistry. , Macmillan. (1999).
  7. Boyer, R. Modern Experimental Biochemistry, 3rd Edition. , (2001).
  8. le Maire, M., Chabaud, R., Hervé, G. Laboratory Guide to Biochemistry, Enzymology, and Protein Physical Chemistry: A Study of Aspartate Transcarbamylase. , Springer Science & Business Media. (2012).
  9. Bettelheim, F. A., Landesburg, J. M. Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry. , Thomson Brooks/Cole. (2013).
  10. Anderson, A. J. Affinity chromatography of lactate dehydrogenase: An experiment for the undergraduate biochemistry laboratory. Journal of Chemical Education. 65 (10), 901(1988).
  11. Boyer, R. F. Purification of milk whey α-lactalbumin by immobilized metal-ion affinity chromatography. Journal of Chemical Education. 68 (5), 430(1991).
  12. Moffet, D. A. From gene mutation to protein characterization. Biochemistry and Molecular Biology Education. 37 (2), 110-115 (2009).
  13. Sommer, C. A., Silva, F. H., Novo, M. T. M. Teaching molecular biology to undergraduate biology students: An illustration of protein expression and purification*. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (1), 7-10 (2004).
  14. Wu, Y., Zhou, Y., Song, J., Hu, X., Ding, Y., Zhang, Z. Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization. Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (1), 43-54 (2008).
  15. Ward, W. W., Swiatek, G. C., Gonzalez, D. G. Green fluorescent protein in biotechnology education. Methods in enzymology. 305, 672-680 (2000).
  16. Kay, B. K., Winter, J., McCafferty, J. Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual. , Elsevier. (1996).
  17. Arkus, K. A. J., Jez, J. M. An integrated protein chemistry laboratory. Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (2), 125-128 (2008).
  18. Crowley, T. E. Expression, purification, and characterization of a recombinant flavin reductase from the luminescent marine bacterium Photobacterium leiognathi. Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (3), 151-160 (2010).
  19. Colabroy, K. L. A writing-intensive, methods-based laboratory course for undergraduates. Biochemistry and Molecular Biology Education: A Bimonthly Publication of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 39 (3), 196-203 (2011).
  20. Kreiling, J. L., Brader, K., Kolar, C., Borgstahl, G. E. A real-time and hands-on research course in protein purification and characterization: Purification and crystal growth of human inosine triphosphate pyrophosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 39 (1), 28-37 (2011).
  21. Gray, C., et al. Known structure, unknown function: An inquiry-based undergraduate biochemistry laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 43 (4), 245-262 (2015).
  22. Kocabas, E., Hernick, M. Metalloenzymes: Use of Recombinant Protein Expression and Affinity Tags to Aid Identification of Native Metal Ion Cofactors. Biochemistry & Analytical Biochemistry. 2 (2), 1-3 (2013).
  23. Ellis, W. R. Metalloenzymes. Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine. , (2006).
  24. Williams, R. J. P., Begley, T. P. Metallo-Enzymes and Metallo-Proteins, Chemistry of. Wiley Encyclopedia of Chemical Biology. , (2007).
  25. Mierendorf, R. C., Morris, B. B., Hammer, B., Novy, R. E. Expression and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 257-292 (1998).
  26. He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
  27. He, F. Bradford Protein Assay. BIO-PROTOCOL. 1 (6), (2011).
  28. Johnson, M. Protein Quantitation. Materials and Methods. , (2017).
  29. Colabroy, K. L., Hackett, W. T., Markham, A. J., Rosenberg, J., Cohen, D. E., Jacobson, A. Biochemical characterization of L-DOPA 2,3-dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from lincomycin biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 479 (2), 131-138 (2008).
  30. Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods in Enzymology. , 601-626 (2009).
  31. Kemmer, G., Keller, S. Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets. Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).
  32. Wang, Y. Z., Lipscomb, J. D. Cloning, overexpression, and mutagenesis of the gene for homoprotocatechuate 2,3-dioxygenase from Brevibacterium fuscum. Protein Expr Purif. 10 (1), 1-9 (1997).
  33. Amaya, A. A., Brzezinski, K. T., Farrington, N., Moran, G. R. Kinetic analysis of human homogentisate 1,2-dioxygenase. Archives of Biochemistry and Biophysics. 421 (1), 135-142 (2004).
  34. Johnson-Winters, K., Purpero, V. M., Kavana, M., Nelson, T., Moran, G. R. 4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase from Streptomyces avermitilis: The Basis for Ordered Substrate Addition. Biochemistry. 42 (7), 2072-2080 (2003).
  35. Bugg, T. D. H. Overproduction, purification and properties of 2,3-dihydroxyphenylpropionate 1,2-dioxygenase from Escherichiacoli. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Protein Structure and Molecular Enzymology. 1202 (2), 258-264 (1993).
  36. Mendel, S., Arndt, A., Bugg, T. D. H. Acid-Base Catalysis in the Extradiol Catechol Dioxygenase Reaction Mechanism Site-Directed Mutagenesis of His-115 and His-179 in Escherichia coli 2,3-Dihydroxyphenylpropionate 1,2-Dioxygenase (MhpB). Biochemistry. 43 (42), 13390-13396 (2004).
  37. Viggiani, A., Siani, L., Notomista, E., Birolo, L., Pucci, P., Di Donato, A. The Role of the Conserved Residues His-246, His-199, and Tyr-255 in the Catalysis of Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas stutzeri OX1. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48630-48639 (2004).
  38. Uragami, Y., et al. Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase. Journal of Inorganic Biochemistry. 83 (4), 269-279 (2001).
  39. Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Prot ine tiquette polyhistidinereconstitution par ions m talliquesliaison au fer non h miniqueessai d activit enzymatiquechromatographie de filtration sur gelanalyse par SDS PAGEpurification de prot ines sur paillassem thodes de laboratoire de premier cycleenzyme redox active

Articles connexes