Article de méthode

Caenorhabditis Tamis : Un Instrument rudimentaire et une méthodologie pour le tri des petits organismes multicellulaires

DOI :

10.3791/58014

⸱

4 juillet 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Wildlife, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 4Departments of Biology and Chemistry, Earlham College, 5Department of Biological Sciences, College of Natural Science and Mathematics, California State University Long Beach

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole actuel comprend une méthodologie pour le tri et le nettoyage des populations appariés selon l’âge de elegans de Caenorhabditis. Il utilise un simple, peu coûteux et un outil sur mesure efficace pour obtenir une grande population expérimentale de nématodes pour la recherche.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un organisme de modèle bien établi utilisé dans un éventail de recherche fondamentale et recherche biomédicale. Au sein de la communauté des chercheurs nématodes, on a besoin d’un moyen abordable et efficace maintenir les populations de c. elegansgrandes, appariés selon l’âge. Nous présentons ici une méthodologie pour mécaniquement tri et nettoyage c. elegans. Notre objectif est de fournir un processus rentable, efficace, rapide et simple pour obtenir des animaux de tailles uniformes et étapes de la vie pour leur utilisation dans des expériences. Cet outil, le tamis de Caenorhabditis , utilise un système de couvercle sur mesure qui fils sur commune tubes à essai conique et trie c. elegans , basé sur la taille du corps. Nous démontrons également que le tamis de Caenorhabditis transfère effectivement animaux de plaque d’une culture à une autre permettant un tri rapide, synchronisation et nettoyage sans impact sur les marqueurs de la santé, y compris de la motilité et stress-inductible journalistes de gène. Cet outil accessible et novatrice est une option rapide, efficace et non stressant pour maintenir les populations de c. elegans .

Introduction

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Le ver nématode Caenorhabditis elegans, est un organisme modèle premier ministre. Outre le caractère simple et contrôlé de leur culture en laboratoire, leur génome est séquencé1 et le sort du développement de chaque cellule est connu2. En raison de ces caractéristiques, le c. elegans est un organisme modèle largement utilisé pour des études génétiques. Toutefois, avec ces caractéristiques bénéfiques viennent des défis pour les chercheurs. En raison de leur durée d’une génération rapide, des populations de c. elegans peuvent rapidement manquer de nourriture et/ou mélangées avec plusieurs générations, les populations et les stades présentent à la fois. Ainsi, les expériences réalisées sur des milieux solides nématode (NGM) nécessitent chercheurs de déplacer physiquement les animaux aux plaques de frais avant que la source de nourriture bactérienne est épuisée et développent de nouvelles larves. Cela peut être fastidieux car un transfert fréquent des animaux est nécessaire pour éviter les populations expérimentales de devenir mélangé à des générations de descendants. Pourtant, certaines expériences nécessitent tous deux un grand nombre d’animaux et de points de temps prolongée (p. ex., extraction de l’ADN ou l’ARN à l’âge adulte). Cela composés les défis de maintenant une population synchronisée avec précision et de transférer un grand nombre d’animaux.

Les méthodes actuelles de transfert c. elegans cultivés sur NGM cueillette ou laver les animaux de la plaque à la table ; traitement chimique des animaux (p. ex., avec la réplication de l’ADN inhibiteur fluorodésoxyuridine ou FUDR) ; ou à l’aide de cytométrie de flux pour trier les animaux en plaques multipuits. La cueillette implique l’utilisation d’un outil à main, réalisé avec un mince fil de platine ou un cil, de transférer manuellement particulier ou plusieurs animaux3,4. Cette méthode est précise mais exige des compétences et temps et une limitation pour les études portant sur un grand nombre d’animaux. Cueillette de mai également être physiquement préjudiciables et stressante pour les animaux en soumettant potentiellement particuliers aux montants peu naturelle et incohérentes de perturbation et de force. Lavage implique une boîte de Pétri avec une solution tampon de rinçage et transfert de la solution avec les animaux par le biais de pipette Pasteur en verre pour une nouvelle plaque de culture. Cette méthode est rapide et efficace, mais n’est pas exacte, comme plusieurs générations et des stades de développement des animaux sont transférés en vrac. Les traitements chimiques, tels que FUDR, peuvent être dissous dans les médias culture afin d’éviter la production de descendants à travers bloquant toute réplication de l’ADN et donc, le développement de la production et oeuf de gamète. Bien qu’efficace, cette méthode doit être appliquée après la maturation du développement quant à ne pas perturber les processus normales de développement, et cela signifie qu’il y a toujours une obligation de transférer les animaux avant son administration3. Cette méthode influe aussi sur les multiples cellulaires voies de signalisation, entraînant des effets notables sur les animaux en vieillissant (par exemple, une extension de la durée de vie ou une altération protéostasie) selon les souches c. elegans utilisé5, 6,7,8,9,10. Cytométrie en flux méthodes automatiquement trier et transférer des elegans de Caenorhabditis d’une plaque multipuite à un autre11. Bien que cette méthode est très efficace et efficient, équipements de cytométrie en flux est prohibitivement cher et inaccessible à beaucoup de chercheurs. Une alternative au transfert des animaux est d’utiliser des modèles de mutants qui sont sensible, tels que fer-15 et MEF-1, qui deviennent stériles avec réglage de température12la température. En utilisant des animaux mutants est utile dans certaines situations, ces souches spécifiques croissent plus lentement que les animaux sauvage et ils comptent sur un génome altéré, servant en tant que représentants de pauvres pour les vers de vieillissement ou en bonne santé. En outre, le recours à un changement de température pour provoquer la stérilité se traduit également par l’absence d’un environnement statique, et des changements de température montrent facilement influencer gène expressions13,14, 15. groupes de recherche ont été publiés techniques décrivant l’utilisation d’un maillage de filtre c. elegans taille16. Cependant, nous n’avons pu trouver des travaux précédents tests pour tout changement dans l’état de santé global qui peut être associée à l’utilisation de ces filtres.

Il faut, par conséquent, au sein de la communauté de recherche de c. elegans pour une méthode abordable, efficace, rapide et précise pour le transfert d’un grand nombre d’animaux entre les plaques de culture. Nous avons développé une pièce améliorée et accessible des équipements (nommé le tamis de Caenorhabditis ) et un protocole associé pour sa réalisation et de fonctionnement répondant aux besoins de la communauté de recherche de c. elegans . Ici, nous partageons la conception du Caenorhabditis tamis et méthodes pour son utilisation, et nous démontrer que son utilisation n’influe pas sur la santé commune ou des marqueurs de stress par rapport à la cueillette manuelle standard et un traitement avec l’usage courant, FUDR chimique privatives de fertilité.

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Protocole

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1. Caenorhabditis tamis Construction et utilisation

  1. Protocole de construction
    1. Acquérir 2 couvercles de tubes coniques 50 mL (Figure 1 a).
    2. Supprimer la zone du centre à l’intérieur de la lèvre interne de la paupière (lorsqu’on regarde le fond, la Figure 1 b) à l’aide d’un bec Bunsen et une sonde de métal chaud ou un fer à souder ou en gradins de foret.
      Remarque : En utilisant la chaleur pour couper le couvercle en plastique est préférable à une lame parce qu’il y a moins de risques de blessures.
    3. Nettoyer et poncer les arêtes et recouvrir la surface avec un fichier de courbe ou une rotative (p. ex., Dremel) outil de meulage. Voir la Figure 1.
    4. Couper le cercle de la maille de monofilament au diamètre approprié (Figure 1). Pour cela, tracer un couvercle sur une feuille de maille en nylon monofilament et couper à l’intérieur de la ligne tracée.
    5. Pratiquez des rainures/fentes sur le dessus des couvercles pour améliorer l’adhérence des deux paupières lorsque la colle est appliquée à la matière plastique (Figure 1E).
    6. Nettoyer les couvercles avec de l’éthanol et les laisser sécher.
    7. Appliquer la colle cyanoacrylate sur la surface supérieure de deux couvercles, gardant au bord extérieur.
      Remarque : un peu de colle va un long chemin.
    8. Posez le filet monofilament, conformément au tableau 1, un couvercle collé (Figure 1F). Placez le deuxième couvercle inversé sur le dessus de la maille ; les deux couvercles doivent avoir leurs sommets ensemble. Appuyez fermement ensemble (Figure 1). Assurez-vous que le filet est tendu.
      Remarque : par mesure de sécurité, utilisation pince à épiler pour placer les mailles sur les couvercles.
    9. Une fois la première couche de colle est sèche, appliquer un anneau de colle cyanoacrylate autour de l’écart extérieur entre les couvercles. Soyez généreux car cela ajoute intégrité et empêche tout peeling Appart ou qui fuient.
    10. Étiqueter le filtre avec le maillage de pore de la maille de monofilament.
      NOTE : Ici, nous utilisons deux maillages pore — 20 µm et 50 µm.
  2. Protocole d’utilisation
    1. Pré mouillage le tamis.
      1. Pipeter une solution saline, comme M9 [5 g de NaCl, 6 g de Na2HPO4, 3 g de KH2PO4, 1 L d’ultrapure H2O et 1 mL de MgSO4 (1 M)]17, à travers le centre de la passoire jusqu'à ce qu’une forme de gouttelette , se condense et s’égoutte hors du centre de la partie inférieure du filtre (Figure 2 a). Éventuellement, appliquez un chiffon non pelucheux (par exemple, Kimwipe) vers le bas pour forme ou répandre une goutte de l’humidité sur le maillage.
      2. Placez le tamis sur un tube conique de 50 mL. Etiqueter le tube comme « Tube de déchets » (Figure 2 b).
    2. Laver une population de c. elegans hors un plat d’agar.
      1. Laver la plaque avec le tampon de M9 et placer le milieu contenant du ver sur le dessus de la maille de monofilament 1 mL à la fois (Figure 2). Veillez à opérer dans le centre de la maille. Laver tous les vers de la plaque.
        Remarque : En général, 3 mL de M9 pour une plaque de 60 mm est suffisant.
      2. Pour minimiser le nombre de vers perdu en pipettant également, utiliser une pipette Pasteur en verre pour déplacer les vers la plaque et sur le centre de la maille (à répéter au besoin).
      3. Rincer le filtre avec le tampon de M9 du haut. Encore une fois, assurez-vous d’exploiter dans le centre de la maille et rincer tous les vers dans ce domaine. Laver autant de fois que nécessaire pour s’assurer que toutes les bactéries et les vers plus petits ont passé à travers les mailles.
    3. Récolter les animaux de même taille de la passoire.
      1. Fixer un nouveau tube conique de 50 mL sur le dessus de la passoire, avec les vers adultes de l’étape 1.2.2.3 vers l’intérieur du nouveau tube de prélèvement (Figure 2D).
      2. Supprimer le premier tube (tube de déchets) et de retourner rapidement sur le tamis et le nouveau tube pour empêcher la migration de la goutte (Figure 2E).
        Remarque : Si la stérilité n’est pas nécessaire, utilisez un chiffon non pelucheux (par exemple, Kimwipe) au fluide de la mèche du bas de la maille avant le retournement.
      3. Rincer la maille avec M9 dans le nouveau tube de 50 mL de la nouvelle tranche (Figure 2F). Encore une fois, opèrent dans le centre de maillage et de maintenir une goutte sur le dessous de la maille.
      4. Permettre les vers à régler ou à les tourner délicatement vers le bas (par exemple, < x 16 g) pendant environ 1 min (Figure 2).
      5. Aspirer la solution tampon de la pastille de worms, idéalement à > 0,5 mL, ou éliminer autant de liquide que possible sans déranger le culot.
      6. Déposer les vers à l’aide d’une pipette Pasteur en verre sur un plat de NGM et laissez-les sécher. Espace dehors plusieurs gouttes sur une nouvelle plaque donc ils sèchent plus vite (Figure 2 H).
    4. Nettoyer le tamis.
      1. Rincer le tamis doucement et soigneusement avec de l’eau par osmose inverse et de l’éthanol. Laissez-le sécher.
      2. Conservez-la dans un récipient propre pour une utilisation ultérieure indéfinie.
      3. Jetez-les quand la maille développe un aspect de « sag ».

2. validation du tamis de Caenorhabditis méthode de tri

  1. Entretien général
    1. Pour toutes les expériences, la culture vers sur une norme de milieux de culture de nématode17 (1 L de NGM se compose de 2,5 g de peptone, 17 g d’agar-agar, 3 g de NaCl, 975 mL d’eau bidistillée, 1 mL de cholestérol 5 mg/mL, 1 mL de 1 M CaCl2 1 mL de 1 M MgSO4et 25 mL de 1 M KHPO40,5 mL de streptomycine 100 mg/mL) à 25 ° C.
  2. Administration du traitement expérimental
    1. Comparez les trois groupes de traitement : pioche, fluorodésoxyuridine (FUDR) et Caenorhabditis tamis.
      1. Pour le groupe de traitement FUDR, ajouter 100 mg/mL FUDR aux médias NGM à une concentration finale de 100 μM pour empêcher toute production de descendance et transférer les vers tous les autres jours sur une plaque NGM frais pour éviter l’épuisement de la nourriture.
      2. Pour le groupe de choix, sélectionner et transférer les vers manuellement à l’aide d’une boucle de la platine.
      3. Pour le groupe de traitement de tamis de Caenorhabditis , suivez l’étape 1.2 et pipeter les vers sur un plat de NGM.
  3. Caenorhabditis Tamisez le pourcentage de rendement
    1. Afin de quantifier le degré d’efficacité le tamis est au tri des elegans de Caenorhabditis, grandir âge-synchrone N2 animaux au jour 1 de l’âge adulte à 25 ° C (soit48 h après la ponte) et puis de les transférer par ramasser aux plaques de NGM frais (pour un total de N = 50 ou N = 100 animaux par tre Groupe de traitement).
    2. Après 24 h de récupération, transférer la population de nouvelles plaques NGM avec le tamis de Caenorhabditis précède le protocole (Voir l’étape 1.2) et compter le nombre d’animaux transféré.
    3. Calculer le pourcentage de rendement comme le rapport entre le nombre d’animaux transférés par rapport au nombre de départ au début du transfert multiplié par 100 (%).
  4. Tests de Healthspan
    NOTE : Score healthspan paramètres de la classe de motilité, du taux de la pompe du pharynx et la partie antérieure et la réponse de douceur postérieur les jours 2, 4, 6 et 8 de l’âge adulte pour synchronisé âge N2 animaux maintenus à 25 ° C.
    1. Suivi de la motilité
      1. Affecter des scores de motilité basées sur un système basé sur des classes (classes A, B et C) suivre les méthodes de Herndon et al. 18. comparer les effets des trois groupes expérimentaux à l’aide d’un modèle statistique logistique ordinal dans le logiciel d’analyse statistique.
        NOTE : Individus de classe A se déplacent spontanément dans un modèle normal, sinusoïdal. Catégorie B personnes se déplacent en mouvements nettement non sinusoïdales et nécessitent insistance pour encourager le mouvement. Catégorie C personnes passer leur tête ou la queue en réponse à l’insistance mais ne peuvent pas se déplacer librement dans la gélose.
    2. Taux de pompe du pharynx
      1. Compter le mouvement moulin du bulbe pharyngien terminal de l’animal visuellement sous un stéréomicroscope à un 600 X grossissement final pendant 1 min.
      2. Effectuer une analyse statistique avec une ANOVA à α = 0,05 et post-tests de Bonferroni avec α = 0,05.
    3. Réponse de Touch
      1. Enregistrer une réponse de douceur et de comparer entre les trois groupes de traitement. Effectuer les tests basés sur les méthodes décrites par Calixto et al. 19.
      2. Enregistrement de la partie antérieure et postérieure touchent réponse par doucement caresser un prélèvement de cil perpendiculairement sur la queue ou la tête (5 x de chaque, alternant tête et queue) des animaux.
      3. Marquer tout mouvement dans la direction opposée du trait que 1 point sur une échelle de 0 à 5 pour la partie antérieure et la réponse postérieure.
      4. Effectuer une analyse statistique avec une ANOVA à α = 0,05 et post-tests de Bonferroni avec α = 0,05.
  5. Dosage de la fécondité
    1. Pour déterminer l’utilisation de l’impact de la passoire Caenorhabditis sur la reproduction, croissance âge-synchrone N2 animaux jour 2 de l’adulte à 25 ° C.
    2. 60 h après oeuf allongé, transférer les animaux aux nouvelles plaques NGM avec une pioche de platine ou le tamis de Caenorhabditis et donnez-leur 4 h pour récupérer (sécher les plaques tamisées pendant 20 à 30 min).
    3. Après récupération, individuellement plaque les animaux via un cil pick aux plaques de NGM, donnez-leur 24h pour pondre des œufs et enlever les animaux. Permettre la descendance sur chaque plaque de développer dans des conditions normales pour une autre 24h à 25 ° C.
      Remarque : Un prélèvement de cil est un cil humain fixés à l’extrémité de la pipette Pasteur avec vernis à ongles et stérilisé avec de l’éthanol.
    4. Compter le nombre d’individus de génération F1 viables. Effectuer une analyse statistique en utilisant un test T avec α = 0,05.
      Remarque : Une descendance Viable est considérés comme les œufs qui éclosent et commencent leur développement à travers les cycles réguliers de larves avec succès.
  6. Essais de réponse stress journaliste fluorescent
    1. Effectuer trois essais journaliste fluorescents couramment utilisés pour détecter des marqueurs potentiels du stress : une translocation de DAF-16::GFP dans les noyaux des cellules dans une souche [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP ; rol-6)]20; une expression de hsp-16,2 [TJ375-gpIs1 (PIH-16.2p::GFP)]21; et une expression de sod-3 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.
    2. Pour chaque série de tests, de la culture âge-synchrone animaux en provenance des trois groupes de traitement à 20 ° C et les examiner au 3e jour de vie adulte : utiliser un contrôle négatif (sur une base quotidienne, transférer un groupe d’animaux manuellement avec une pioche de platine), un contrôle positif (sur une base quotidienne transfert d’un groupe d’animaux manuellement avec une pioche de platine, plus un facteur de stress établi) et le tamis de Caenorhabditis (passer les animaux à travers le tamis et laissez-les se rétablir pendant 30 min sur NGM juste avant l’imagerie).
    3. Dans le test DAF-16::GFP, chaleur choquer les animaux témoins positifs à 37 ° C pendant 30 min avant l’imagerie20. Pour le dosage de hsp-16,2, chaleur choquer les animaux témoins positifs pendant 90 min, 20 h avant d’imagerie21. Pour le dosage de la sod-3, traiter les animaux de contrôle positif avec le paraquat 100 mM pendant 4 h avant l’imagerie22.
    4. Récolter les vers immédiatement avec un prélèvement de CIL et montez-les sur un lamelle couvre-objet avec 1 μl d’une solution de surfactant 407 poloxamer 36 % pour immobiliser les vers.
    5. "Sandwich" les vers monté avec une autre lamelle. Montez les deux lamelles couvre-objet à une image et une lame de microscope de verre standard les vers en utilisant un grossissement 8 X sur un microscope inversé à fluorescent (pour un grossissement total de 80 X) et une exposition constante avec un filtre FITC.
    6. Pour détecter des différences entre les trois groupes dans le test DAF-16::GFP, classer les animaux selon l’emplacement du reporter DAF-16::GFP (nucléaire si le journaliste transloqué aux noyaux, cytosoliques si le journaliste situé dans le cytosol et le cas intermédiaire le journaliste, situé dans les noyaux et le cytosol).
    7. Comparer les résultats en utilisant un modèle statistique de logistique ordinal dans le logiciel d’analyse statistique. Pour le PIH-16.2 et les dosages de sod-3 expression, utilisez une ANOVA à α = 0,05 et tests de post hoc de Tukey avec α = 0,05 pour comparer la fluorescence totale de la région céphalique.

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Résultats

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Le tamis de Caenorhabditis se compose de 2 cache-vis, sécuriser une zone de maille de monofilament de nylon tissé inférieur au diamètre du corps de l’âge du développement souhaité, utilisé pour extraire des populations vivantes d’organismes à l’aide d’une technique simple lavage. Il s’adapte sur les tubes coniques standards et utilise l’écran grillagé pour trier mécaniquement les animaux par diamètre de corps, en laissant les animaux souhaitées dans le tube prêt à davantage de ma...

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Discussion

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Ici, nous avons introduit la conception et l’utilisation de la passoire de Caenorhabditis accessible, efficace comme un outil pour le tri et le maintien de c. elegans. Cet outil présente plusieurs avantages à choisir manuellement chaque animal, le lavage des populations, des traitements chimiques (p. ex., FUDR) et des méthodes plus coûteuses d’animaux en ségrégation. Tout d’abord, le Caenorhabditis tamis efficacement et rapidement (moins de 20 min) trie les descendances de grandes popu...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer. Les auteurs déclarent que la recherche a été effectuée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprété comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs aimeraient remercier Heather Currey pour sa première contribution à la conception de l’étude et m. Swarup Mitra pour son examen critique du manuscrit. Nous tenons également à remercier le Dr. Michael B. Harris de commentaires, de raffinements et d’assistance dans la production de la démonstration de cette méthodologie. Les souches ont été fournis par le centre de génétique de Caenorhabditis, qui est financé par le NIH Office de programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440). La recherche rapportée dans cette publication a été financée par le National Institute Of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health, sous attribution numéros UL1GM118991, TL4GM118992 ou RL5GM118990 et par une bourse de développement institutionnel (IDeA) de le National Institute of General Medical Sciences de la National Institutes of Health, sous concession numéro 5P20GM103395-15. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health. UA est une institution éducative et un employeur AA/EO et interdit toute discrimination illégale contre n’importe quel individu : www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lunettes de sécuritéUlineS-21076
Gant de protection résistant à la chaleurGraingerArticle # 3AT17 N° de modèle du fabricant # 3AT17 Page du catalogue # 1703
50 mL tube coniqueFalcon14-432-22
Nylon synthétique mailleDynamic
Aqua-Supply Ltd		NTX20 et NTX50
Colle cyanoacrylateScotch Super Glue LiquidSAD114
PinceVampliersVMPVT-001-8
Outil Dremmel avec lime circulaireLowe’sItem # 525945 Modèle # 100-LG
FUDRSigmaF0503
M9 produits chimiques ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)  ;Sigma  ;S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
Produits chimiques pour plaques NGM (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2, Cholestérol, Streptomycine)BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma (repos)BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  ; Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127SigmaP2443
Hydrate de dichlorure de paraquatSigma36541
Microscope à fluorescence inverséeOlympusFSX100

Références

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